增加植物產量的方法
2024-01-21 21:57:15
專利名稱：增加植物產量的方法
描述本發明涉及增加植物產量的方法、用於這些方法的重組核酸分子、它們的應用以及產量增加的植物。
在農業和林業領域中，正在進行不斷的努力以產生高產量的植物，尤其是為了保證不斷增長的世界人口的食物供應和保證可再生的原材料的供應。傳統地，通過耗時又耗勞力的育種以獲得高產量的植物是令人厭煩的。而且，對於每個相關植物物種必須進行適當的育種程序。
通過對植物進行遺傳操作即通過將重組核酸分子導入植物並在植物中表達已取得部分進展。這些方法具有通常不局限於一種植物物種而是可轉移入其它植物物種的優點。例如，在EP-A 0 511 979中，描述了原核天冬醯胺合成酶在植物細胞中的表達尤其導致生物量產量增加。
例如，在WO 96/21737中，描述了通過解除調控或非調控的果糖-1，6-二磷酸酶的表達而產生由於光合作用率增加而增加產量的植物。
然而，仍需用於提高植物產量對農業或林業有利的普遍可行的方法。
因此，本發明的問題是提供增加植物產物的進一步方法。
根據本發明，通過提供權利要求書中所述的實施方案，這一問題得到解決。
因此，本發明涉及增加植物產量的方法，其特徵在於表達穩定整合入植物基因組的重組DNA分子，重組DNA分子包括(a)允許在伴胞中特異轉錄的區域；以及與其可操作連接的(b)編碼選自下列多肽的核苷酸序列
(i)具有切割蔗糖的酶活性的蛋白；(ii)蔗糖轉運蛋白；(iii)其活性引起位於植物細胞質膜上的質子梯度的刺激作用的蛋白；和(iv)檸檬酸合酶(E.C.4.1.3.7)。
令人吃驚地發現上述蛋白在植物韌皮部中特異表達導致產量顯著增加。
術語「產量增加」優選地是指生物量產量的增加，尤其是作為植物鮮重測定的時候。
這種產量增加優選地是指植物所謂的「庫」器官即那些攝取通過光合作用產生的光同化產物的器官的增加。特別優選的是可收穫的植物部分如種子、果實、貯藏根、根、塊莖、花、芽、枝條、莖幹或木材。根據本發明，生物量產量的增加是與相同條件下種植的相同基因型的未轉化植物相比增加至少為3％、優選至少10％且特別優選至少20％。
上述蛋白的共同之處在於當它們在韌皮部表達時，它們的生物學活性導致韌皮部光同化產物積累增加。
在本發明的上下文中，光同化產物理解為糖和/或胺基酸。
根據本發明，(b)中提及的核苷酸序列通常可編碼植物蛋白或細菌蛋白或來自真菌或動物有機體的蛋白。
優選的實施方案中，核苷酸序列編碼蔗糖合酶(E.C.2.4.1.13)、優選地植物蔗糖合酶，特別是來自馬鈴薯、並且特別優選地在馬鈴薯塊莖中表達的類型。這些序列例如在Salanoubat和Belliard中描述(基因60(1987)，47-56)並且可在EMBL基因庫錄入號X67125下得到。
更優選的實施方案中，核苷酸序列編碼蔗糖磷酸化酶(E.C.2.4.1.7)。
編碼蔗糖磷酸化酶的序列例如從WO 96/24679得知。
在另一優選的實施方案中，核苷酸序列編碼轉化酶(E.C.3.2.1.26)，優選地來自微生物，尤其是來自酵母屬真菌、優選地來自釀酒酵母的轉化酶。特別優選的是編碼胞質轉化酶的序列(Sonnewald等，植物雜誌，1(1991)，95-106)。
根據本發明，蔗糖轉運蛋白理解為在植物系統中轉運蔗糖通過膜的轉運蛋白。優選地，這種轉運蛋白是植物來源(例如EMBL基因庫錄入號G21319)。特別優選的(b)中所述序列編碼來自菠菜的蔗糖轉運蛋白，特別是具有如例如Riesmeier等(歐洲分子生物學組織雜誌，11(1992)，4705-4713)中所述的克隆SoSUT1的序列。
更優選的實施方案中，刺激位於質膜上的質子梯度的蛋白是質子ATP酶。
這種情況中，(b)中所述序列優選地編碼來自微生物、尤其是酵母屬真菌，優選地來自釀酒酵母的蛋白。
在特別優選的實施方案中，序列編碼來自釀酒酵母的質子ATP酶PMA1(Serrano等，自然319(1986)，689-693；EMBL基因庫)或者來自釀酒酵母的這種質子ATP酶在3′末端截短的形式，特別是如本發明實施例3中所述的ATP酶ΔPAM1。
選擇性地，核苷酸序列也可編碼來自植物的質子ATP酶，優選來自馬鈴薯的質子ATP酶。
特別優選的是編碼來自馬鈴薯的質子ATP酶PHA2(Harms等，植物分子生物學，26(1994)，979-988；EMBL基因庫X76535)或來自馬鈴薯的這種質子ATP酶在3′末端截短的形式、特別是如本發明實施例4中所述的ATP酶ΔPHA2的序列。
根據本發明，檸檬酸合酶可以是任何檸檬酸合酶，例如來自細菌、真菌、動物或植物的那些檸檬酸合酶。編碼檸檬酸合酶的DNA序列已知，例如來自下列生物枯草芽孢桿菌(U05256和U05257)、大腸桿菌(V01501)、R.prowazekii(M17149)、P.aeruginosa(M29728)、A.antiratum(M33037)(見Schendel等，應用環境微生物學58(1992)，335-345，並且此處引用作為參考)、沃氏富鹽菌(James等，Biochem.Soc.Trans.20(1992)，12)、擬南芥(Z17455)(Unger等，植物分子生物學13(1989)，411-418)、凝結芽孢桿菌(M74818)、C.burnetti(M36338)(Heinzen等，基因109(1990)，63-69)、恥垢分枝桿菌(X60513)、嗜酸硫桿菌(X55282)、T.thermophila(D90117)、豬(M21197)(Bloxham等，美國國家科學院院報，78(1981)，5381-5385)、粗糙脈孢菌(M84187)(Ferea等，分子基因遺傳學242(1994)，105-110)、釀酒酵母(Z11113，Z23259，M14686，M54982，X00782)(Suissa等，歐洲分子生物學組織雜誌，3(1984)，1773-1781)和馬鈴薯(EP 9591 3066.7)。
括弧內的數字是GenEMBL資料庫中相應的錄入號。
根據本發明，核苷酸序列一般可編碼來自任何生物，尤其是來自植物、真菌、細菌或動物的蛋白。這些序列優選地編碼來自植物或真菌的蛋白。優選地，植物是高等植物，尤其是貯藏澱粉或油的有用植物，例如馬鈴薯或者穀類如大米、玉米、小麥、大麥、黑麥、小麥、燕麥、小米等，以及菠菜、菸草、甜菜、大豆、棉花等。
真菌優選地屬於酵母屬、裂殖酵母屬、麴黴屬或脈孢菌屬，尤其是釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、黃麴黴、黑麴黴或者粗糙脈孢菌。
根據本發明所述的方法的優選實施方案中，(a)中提及的保證伴胞特異轉錄的區域是來自髮根農桿菌的rolC基因的啟動子。
此啟動子例如描述於Schmülling等(植物細胞(1989)，665-671)和Kühn(茄科中蔗糖載體SUT1的鑑定和定位，博士論文(1991)，FreieUniversitt Berlin，生物系)。優選地，所用的啟動子區域具有SeqID No.1中所示的核苷酸序列。
除了上述rolC啟動子，本領域技術人員可立即使用用於伴胞特異表達的其它啟動子。進一步的伴胞特異的啟動子在文獻中有描述，如來自擬南芥的蔗糖轉運蛋白啟動子(Truernit和Sauer，植物196(1995)，564-570)。
而且，不同RNA和蛋白在伴胞中的特異存在在文獻中已有描述(見例如Foley等，植物分子生物學，30(1996)，687-695；DeWitt，植物雜誌1(1991)，121-128；Stadler等，植物細胞，7(1995)，1545-1554)。對於本領域技術人員，可能從已知蛋白開始通過使用抗體或使用從胺基酸序列推導的寡核苷酸方便地分離cDNA(參見例如Sambrook等，分子克隆，實驗室手冊，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)，Cold Spring Harbor，NY.)。從用此方法獲得的cDNA開始有可能篩選從相應生物建立的基因組文庫並鑑定基因組片段。通過比較cDNA和基因組克隆的核苷酸序列，可粗略確定啟動子位置。啟動子特異性可在轉基因情況下通過使用含有啟動子和指示基因如β-葡糖醛酸糖苷酶的嵌合基因來證實(參見例如kertbundit等，美國國家科學院院報88(1991)，5212-5216)。
原則上，根據本發明所述的方法可應用於任何植物。因此，單子葉植物以及雙子葉植物物種是特別適合的。此方法優選用於那些對於農業、園藝和/或林業有利的植物。
其例子是蔬菜植物，例如黃瓜、甜瓜、西葫蘆、茄子、小胡瓜、西紅柿、菠菜、捲心菜種、豌豆、菜豆等；以及水果，例如梨、蘋果等。
而且，貯藏油的植物是適當的，例如油菜、向日葵、大豆。在特別優選的實施方案中，貯藏澱粉的植物是適當的，尤其是例如穀類(大米、玉米、小麥、黑麥、燕麥、小麥、小米、大麥)、馬鈴薯、木薯、甘薯等。
此方法還可用於貯藏蔗糖的植物，例如甜菜和甘蔗，而且還用於其它有用的植物，例如棉花、菸草、木材類型、酒、啤酒花等。
本發明還涉及重組核酸分子，包含(a)允許在植物伴胞中特異轉錄的區域；以及與其可操作連接的(b)編碼選自下列多肽的核苷酸序列(i)蔗糖合酶；(ii)蔗糖磷酸化酶；(iii)蔗糖轉運蛋白；(iv)其活性引起位於植物細胞質膜上的質子梯度的刺激作用的蛋白；和(v)檸檬酸合酶。
關於這樣的分子的優選實施方案，上述的有關本發明方法的分子同樣適用於(a)中提及的區域和(b)中提及的核苷酸序列。
本發明還涉及包含本發明的核酸分子的載體，尤其是那些適於植物細胞轉化以及將外源DNA整合入植物基因組的載體。
本發明還涉及用本發明的核酸分子轉化並含有穩定整合入基因組的上述核酸分子的植物細胞。這些細胞與天然存在的植物細胞不同，例如因為本發明的核酸分子在非天然存在的位置整合入細胞的基因組。
本發明還涉及含有本發明的植物細胞的轉基因植物，並且由於整合入植物伴胞基因組的重組核酸分子的表達，在相同條件下栽培時，轉基因植物表現與對應的未轉化植物相比增加的產量。
本發明又涉及含有本發明的上述植物細胞的植物的繁殖材料。術語「繁殖材料」特別包括種子、果實、塊莖、根莖、插條、愈傷組織、細胞培養物等。
最後，本發明涉及包含允許在植物伴胞中特異轉錄的區域以及與其可操作連接的編碼選自下列多肽的核苷酸序列的重組核酸分子的用途(i)帶有蔗糖切割酶活性的蛋白；(ii)蔗糖轉運蛋白；(iii)其活性引起位於質膜上的質子梯度的刺激作用的蛋白；和(iv)檸檬酸合酶用於在轉基因植物中表達以增加產量。
編碼的蛋白優選地是上面進一步描述的蛋白。
單子葉和雙子葉植物的轉化方法為本領域技術人員所知。
為將DNA導入植物宿主細胞，可使用多種技術。這些技術包括採用根瘤農桿菌或髮根農桿菌作為轉化工具用T-DNA轉化植物細胞、原生質體融合、DNA注射、DNA電穿孔方法、採用biolistic方法以及進一步可能的方法導入DNA。
對於在植物細胞內DNA注射和電穿孔，質粒不需滿足特殊的要求。可以採用簡單的質粒如pUC衍生物。
EP-A 120 516的說明書中已大量檢測並充分公開了使用農桿菌轉化植物細胞，見Hoekema(雙元載體系統Offsetdrukkerij kantersB.V.，Alblasserdam(1985)，第五章)、Fraley等(植物科學鑑定性詳論4，1-46)和An等(歐洲分子生物學組織雜誌，4(1985)，277-287)。
植物外植體可與根瘤農桿菌或髮根農桿菌共培養以將DNA轉移給植物細胞。可以在含有用於選擇轉化細胞的抗生素或biozide的適當培養基中從侵染的植物材料(例如葉外植體、莖段、根以及原生質體或懸浮培養的植物細胞)再生完整植株。然後可以檢測這樣獲得的植物中導入DNA的存在。採用biolistic方法或通過原生質體轉化導入外源DNA的其它可能性已知(參見例如Willmitzer，L.，1993轉基因植物。於生物技術，A Multi-Volume Comprehensive Treatise(H.J.Rehm，G.Reed，A.Pühler，P.Stadler編輯)第2卷，627-659，VCHWeinheim New York-Basel-Cambridge)。
通過Ti—質粒—載體系統藉助根瘤農桿菌轉化雙子葉植物的方法已充分建立。最近的研究已表明單子葉植物也可利用以農桿菌為基礎的載體來轉化(Chan等，植物分子生物學22(1993)，491-506；Hiei等，植物雜誌6(1994)，271-282；Deng等，中國科學33(1990)，28-34；Wilmink等，植物細胞報告11(1992)，76-80；May等，生物/技術13(1995)，486-492；Conner和Domisse，國際植物科學雜誌153(1992)，550-555；Ritchie等，轉基因研究2(1993)，252-265)。
用於單子葉植物轉化的可選系統是利用biolistic方法轉化(Wan和Lemaux，植物生理學104(1994)，37-48；Vasil等，生物/技術11(1993)，1553-1558；Ritala等，植物分子生物學24(1994)，317-325；Spencer等，理論和應用遺傳學79(1990)，625-631)、原生質體轉化、部分滲透處理細胞的電穿孔以及利用玻璃纖維導入DNA。
特別地，文獻中多次描述玉米轉化(參見例如WO95/06128，EP0513849；EP 0 465 875；Fromm等，生物技術8(1990)，833-844；Gordon-kamm等，植物細胞2(1990)，603-618；Koziel等，生物技術11(1993)，194-200)。在EP 292 435和Shillito等(生物/技術7(1989)，581)中描述了藉助並從無粘液的、柔軟的(脆弱的)玉米愈傷組織開始獲得可育植物的方法。Prioli和Sndahl(生物/技術7(1989)，589)描述了從Cateto玉米近交系Cat 100-1的玉米原生質體再生並獲得可育植物。
其它穀類物種的成功轉化也已有描述，例如用於大麥(Wan和Lemaux，見上面；Ritala等，見上面)和小麥的轉化(Nehra等，植物雜誌，5(1994)，285-297)。
一旦導入的DNA整合入植物基因組，它通常在那裡是穩定的而且在原始轉化的細胞的子代中也含有此DNA。它通常含有使轉化細胞對biozide或抗生素如卡那黴素、G 418、博來黴素、潮黴素或膦絲菌素等有抗性的選擇標記。因此，特定選擇標記應該允許從缺乏導入DNA的細胞中選擇轉化細胞。
轉化細胞在植物中以平常方式生長(同樣見McCormick等，植物細胞報告5(1986)，81-84)。可正常培養得到的植物。可從這些植物收穫種子。
應培育兩代或兩代以上以保證穩定維持並傳遞表型特徵。應收穫種子以確保相應的表型或其它特徵得以維持。
圖1示意性表示質粒pBinRolC-SS的結構。
圖2a表示用RolC-SS構建體轉化的轉基因馬鈴薯植物葉子中的蔗糖合酶(SS)活性的分析。根據Zrenner等測定酶活性(植物雜誌，7(1995)，97-107)。活性用μmol己糖當量/(min×g鮮重)表示。各柱代表每基因型的三個樣品的平均值。還表示了標準偏差。
圖2b表示了用RolC-SS構建體轉化的轉基因馬鈴薯植物的塊莖產量的分析。各柱代表每基因型10-15個植物的平均值。還表示了標準偏差。塊莖產量以克鮮重表示。
圖2c表示用RolC-SS構建體轉化的轉基因馬鈴薯植物的塊莖澱粉的分析。為此目的從每基因型10到15個植物收集塊莖並根據VonScheele等測定塊莖的澱粉含量(Landw.Vers.Sta.127(1937)，67-96)。
圖3示意性表示質粒pBinRolC-Suc2的結構。
圖4示意性表示質粒pBinBolC-ΔPMA1的結構。
圖5示意性表示ΔPMA1的克隆方法。
步驟A到B用PMA1 cDNA為模板和互補內部引物通過PCR擴增在3′末端截短的H+-ATP酶ΔPMA1(A)。PCR產物(B)側翼的酶切位點通過相應的合成引物導入。
步驟B到CPst I/Not I酶切並通過Pst I/Not I酶切位點將PCR片段克隆入大腸桿菌載體(C)。
步驟C到DBcl I/Spe I酶切質粒SK-ΔPMA1並將片段克隆入pBinRolC的相容BamH I/Xba I酶切位點(D)。
圖6表示用特異寡核苷酸進行的聚合酶鏈式反應的結果，表明ΔPMA1穩定整合入通過用rolC-ΔPMA2構建體轉化獲得的轉基因植物的基因組中。PCR產物大小為730bp；WT＝野生型；M＝標記。
圖7示意性表示質粒pBinRolC-ΔPHA2的結構。
圖8示意性表示ΔPHA的克隆方法。
步驟A到B用PHA2 cDNA為模板和互補內部引物通過PCR擴增在3′末端截短的H+-ATP酶ΔPHA2。PCR(B)產物側翼的酶切位點通過相應的合成引物導入。
步驟B到CPst I/EcoR I酶切並通過Pst I/EcoR I酶切位點將PCR片段克隆入大腸桿菌載體SK(C)。
步驟C到DBgIII/Spel酶切質粒SK-ΔPHA2並將片段克隆入pBinRolC的相容BamH I/Xba I酶切位點(D)。
圖9表示用特異寡核苷酸進行的聚合酶鏈式反應的結果，表明ΔPHA2穩定整合入通過用rolC-ΔPHA2構建體轉化獲得的轉基因植物的基因組中。PCR產物的大小為758bp；WT為野生型；M為標誌。
圖10示意性表示質粒pBinRolC-SoSUT1的結構。
圖11示意性表示質粒pBinRolC-CiSy的結構。
圖12表示富含維管組織的嫁接馬鈴薯植物塊莖的薄壁組織樣品中的蔗糖含量的測定結果。用於嫁接的基因型是RolC-Suc 2-#25系(胞質轉化酶)和野生型馬鈴薯變種Désirée。按照Stitt等(酶學方法，174(1989)，518-522)測定蔗糖含量。各柱代表每個嫁接型12個樣品的平均值。表示了標準偏差。蔗糖含量以μmol己糖當量/g鮮重表示。
圖13表示在光照下，14CO2大氣中放置6小時的ΔPMA1葉的韌皮部滲出液的分析。按照Stitt等(上述引文中)測定蔗糖含量。各柱代表每基因型4～5個樣品的平均值。表示了標準偏差。
圖14表示ΔPMA1植物的塊莖產量(鮮重g)。各柱代表每基因型6個植物的平均值。圖上表示了標準偏差。塊莖產量以g鮮重表示。
圖15表示了ΔPHA2植物的塊莖產量(鮮重g)。各柱代表每基因型4～5個植物的平均值。圖上表示了標準偏差。塊莖產量以g鮮重表示。
下面的實施例說明本發明。實施例1 質粒pBinRolC-SS和轉基因馬鈴薯植物的產生質粒pBinRolC-SS在雙元載體pBin19中的含有三個片段A，B和C(Bevan，核酸研究，12(1984)8711)(參見
圖1)。
片段A包含來自髮根農桿菌的rolC啟動子。rolC啟動子含有1138bp的EcoR I/Asp718 DNA片段(Lerchl等，植物細胞7(1995)，259-270)，來自髮根農桿菌的Ri農杆鹼型質粒的TL-DNA的DNA區段(位置11306到位置12432)(Slightom等，生物化學雜誌261(1986)，108-121)。將片段A插入pBin19多接頭的EcoR I和Asp718酶切位點。
片段B含有來自馬鈴薯的蔗糖合酶(SS)的cDNA編碼區(位置76到位置2493)(Salanoubat和Belliard，基因60(1987)，47-56)。片段B作為來自載體pBluescript SK的2427bp BamH I片段獲得，其中片段插在載體多接頭的BamH I酶切位點。片段B在載體pBin19中以有義方向插入BamH I酶切位點，即以允許可翻譯RNA轉錄的方向插入rolC啟動子的下遊。
片段C含有Ti質粒pTiACH5的T-DNA的基因3的聚腺苷酸化信號序列(Gielen等，歐洲分子生物學組織雜誌3(1984)，835-846)，特別是核苷酸11749-11939，它們作為來自質粒pAGV40的PvuII/HindIII片段得到分離(Herrera-Estrella等，自然303(1983)，209-213)並且在加上Sph I接頭後被克隆入pBin19多接頭的Sph I和HindIII酶切位點之間的PvuII酶切位點內。
通過由根瘤農桿菌介導的基因轉移，將得到的質粒pBinRolC-SS導入馬鈴薯植物細胞內。為此目的，將用手術刀切傷的無菌培養的10個馬鈴薯小葉(馬鈴薯L.cv.Désirée)放入10ml含2％蔗糖和50μl根瘤農桿菌的選擇壓力下培養的過夜培養物的MS培養基(Murashige和Skoog，植物生理學15(1962)，473)中。輕輕搖動3到5分鐘後，在暗處繼續培養兩天。然後，將葉子放在含有1.6％葡萄糖、5mg/l萘乙酸、0.2mg/L苄氨基嘌呤、250mg/L claforan、50mg/l卡那黴素和0.8％細菌用瓊脂的MS培養液上以誘導愈傷組織。在25℃和3000lux下培養一周後，將這些葉子放到含1.6％葡萄糖、1.4mg/L玉米素核糖、20μg/L萘乙酸、20μg/L赤黴酸、250mg/L claforan、50mg/L卡那黴素和0.8％細菌用瓊脂的MS培養液上。
對用這一載體系統轉化的大量植物的葉子的分析清楚地表明增高的蔗糖合酶活性的存在。這是包含在pBinRolC-SS中的來自馬鈴薯的蔗糖合酶基因表達的結果(參見圖2a)對用這一載體系統轉化並表現增高的蔗糖合酶活性的植物的塊莖產量(每克塊莖產量)的分析清楚地表明塊莖產量增加。這也是來自馬鈴薯的包含在pBinRolC-SS中的蔗糖合酶基因表達的結果(參見圖2b)。
馬鈴薯塊莖的澱粉含量線性決定塊莖密度(von Schéele等，Landw.Vers-Sta.127(1937)，67-96)。對用載體系統pBinRolC-SS轉化的具有增高的蔗糖合酶活性的植物的轉基因塊莖密度的分析令人吃驚地表明增高的澱粉含量。這是來自馬鈴薯的包含在pBinRolC-SS中的蔗糖合酶基因表達的結果(參見圖2c)實施例2 質粒pBinRolC-Suc2和轉基因馬鈴薯植物的產生質粒pBinRolC-Suc2在雙元載體pBin19中含有三個片段A、B和C(Bevan，上述引文中)並在圖3中表示。
片段A和C對應於實施例1中所述的片段A和C。
片段B包含來自酵母(釀酒酵母)的胞質轉化酶基因的編碼區(位置845-位置2384)。片段B作為來自載體pBluescript SK-的1548bp長的BamH I片段獲得，其中片段插在多接頭的BamH I酶切位點。片段B以有義方向在HamH I酶切位點插入pBin19。
質粒pBinRolC-Suc2通過由農桿菌介導的基因轉移導入馬鈴薯植物細胞。從轉化細胞再生完整植株。與未轉化植物相比，這種植物表現產量增加(增加的生物量)。實施例3 質粒pBinRolC-ΔPMA1和轉基因馬鈴薯植物的產生質粒pBinRolC-ΔPMA1在雙元載體pBin19(Bevan，loc.cit.)中包含三個片段A，B和C並在圖4中表示。
片段A和C對應於實施例1中所述的片段A和C。
片段B包含來自酵母釀酒酵母的質子ATP酶PMA1基因的編碼區(位置937到位置3666)(Serrano等，自然319(1986)，689-693)。片段B採用聚合酶鏈式反應(PCR)獲得。為此目的，基因PMA1編碼區的3′末端被特意截短27bp並且同時導入必需的新終止密碼子。這種方法修飾的DNA片段稱為ΔPMA1。片段B作為長2739bp的Bc II/SpeI片段以有義方向插入載體pBin19的BamH I(與Bc II限制性位點相容的插入位點)和Xba I(與Spe I限制性位點相容的插入位點)酶切位點。
片段B作為來自載體pBluescript SK-的Bc II/Spe I片段獲得，其中片段通過多接頭的酶切位點插入載體(參見圖5)。
將質粒pBinRolC-ΔPMA1通過農桿菌屬介導的基因轉移導入馬鈴薯植物細胞。從轉化細胞再生完整植株。
通過聚合酶鏈式反應(PCR)檢測到ΔPMA1穩定整合入採用pBinRolC-ΔPMA1載體系統獲得的轉基因植物的基因組中(參見圖6)。
轉化的植物表現與未轉化植物相比增高的產量(增高的生物量)(見
圖13和14)。實施例4 質粒pBinRolC-ΔPHA2和轉基因馬鈴薯植物的產生質粒pBinRolC-ΔPHA2在雙元載體pBin19(Bevan，上述引文中)中包含三個片段A，B和C並且在圖7中表示。
片段A和C對應於實施例1中所述的片段A和C。
片段B包含質子ATP酶cDNA的編碼區(位置64到位置2672)(Harms等，植物分子生物學26(1994)，979-988)。片段B通過聚合酶鏈式反應(PCR)獲得。為此目的，基因PHA2編碼區的3′末端被特意截短249bp並且同時導入兩個新終止密碼子。這種方法修飾的DNA片段稱為ΔPHA2。片段B作為長2631bp的BgIII/Spe I片段以有義方向插入載體pBin19的BamH I(與BgIII限制性位點相容的插入位點)和Xba I(與Spe I限制性位點相容的插入位點)酶切位點。
片段B作為來自載體pBluescript SK-的BgIII/Spe I片段獲得，其中片段插入多接頭序列的EcoR I和Pst I酶切位點(參見圖8ΔPHA2克隆策略)。
質粒pBinBolC-ΔPHA2通過由農桿菌屬介導的基因轉移導入馬鈴薯植物細胞。從轉化細胞再生完整植株。
採用聚合酶鏈式反應(PCR)檢測到用pBinRolC-ΔPHA2載體系統獲得的轉基因植物的基因組中ΔPHA2的穩定整合(參見圖9)。
轉化的植物表現與未轉化植物相比增加的產量(增加的生物量)(見
圖15)。實施例5 質粒pBinRolC-SoSUT1和轉基因馬鈴薯植物的產生質粒pBinRolC-SoSUT1在雙元載體pBin19中包含三個片段A，B和C(Bevan，上文引文中)並且在
圖10中表示。
片段A和C對應於實施例1中描述的片段A和C。
片段B包含來自菠菜的編碼蔗糖轉運蛋白的cDNA(位置1到位置1969)(Riesmeier等，歐洲分子生物學組織雜誌11(1992)，4705-4713；錄入號X67125和S51273)。片段B作為來自載體pBluescriptSK-的Not I片段獲得，其中片段通過Not I接頭序列插入載體。為克隆入載體pBin19的Sma I酶切位點，將用Not I酶切得到的片段的粘端變為平端並以有義方向將其插入pBin19中。得到的質粒稱為pBinRolC-SoSUT1。
通過農桿菌屬介導的基因轉移將質粒導入馬鈴薯植物細胞。從轉化細胞再生完整植株。
與未轉化植物相比，這樣轉化的植物表現增加的產量(增加的生物量)。實施例6 質粒pBinRolC-CiSy和轉基因馬鈴薯植物的產生質粒pBinRolC-CiSy在按照Becker(核酸研究18(1990)，203)修飾的雙元載體pBin19(Bevan，核酸研究12(1984)，8711)中包含三個片段A，B和C(參見
圖11)。
片段A包含來自髮根農桿菌的rolC啟動子。rolC啟動子包含作為1143bp長的EcoR I/Asp718 DNA片段(Lerchl等，植物細胞7(1995)，259-270)是來自髮根農桿菌的Ri農杆鹼型質粒的TL-DNA的DNA區域(位置11306到位置12432)(Slightom等，生物化學雜誌261(1986)，108-121)。片段A插入pBin19多接頭的EcoR I和Asp718酶切位點。
片段B包含來自裂殖酵母釀酒酵母的檸檬酸合酶(CiSy)的cDNA編碼區。片段B作為來自載體pBluescript SK的長1400bp的BamH I片段獲得，其中片段插入多接頭的BamH I酶切位點(Landschütze，關於乙醯-CoA合成的影響和轉基因植物中的應用的研究，博士論文，FreieUniversitt Berlin，(1985)D83/FB15 No.028)。
片段C包含Ti質粒pTiACH5的T-DNA的基因3的聚腺苷酸化信號序列(Gielen等，歐洲分子生物學組織雜誌.3(1984)，835-846)，核苷酸11749-11939作為來自質粒pAGV40的PvuII/HindIII片段得到分離(Herrera-Estrella等，自然303(1983)，209-213)並在將Sph I接頭加到Pvu II酶切位點上之後將其克隆入pBin19多接頭的Sph I和HindIII酶切位點之間。
質粒pBinRolC-CiSy長約13kb。
質粒pBinRolC-CiSy通過由根瘤農桿菌介導的基因轉移插入馬鈴薯植物中。從轉化細胞再生完整植株。
對用此載體系統轉化的大量植物的分析清楚地表明增加的生物量，這是包含在pBinRolC-CiSy中的來自酵母的CiSy cDNA表達的結果。實施例7 嫁接實驗對於嫁接，用受體植物的枝條替換供體植物的枝條。
此實驗中，轉基因植物(RolC-Suc 2#25)的枝條嫁接到野生型植物(馬鈴薯變種Désirée)砧木上。對照實驗中，將野生型莖嫁接到野生型砧木上以排除實驗中的培養差異(同體嫁接)。此實驗的目的是為了檢驗轉基因植物枝條的光合活性和光同化產物分布對野生型砧木器官(此時是塊莖)的唯一影響。
將馬鈴薯植物從組織培養轉移到土壤中並置於溫室中。約五周後(在此階段植物還未誘導塊莖產生)進行嫁接。為此目的，削掉不需要的受體植物的根，並且在受體植物莖中切出一楔狀體。在其莖末端以適當方式切下要嫁接的供體枝條並將其插入受體植物的楔狀體中。將嫁接位點用膠帶固定。
然後將嫁接的馬鈴薯植物置於增加的空氣溼度和陰影中約一周。七到十天之內使它們逐漸適應正常溫度條件。在此階段植物為七周齡。
現在去除受體植物的所有葉子，而且莖幹用鋁箔覆蓋避光以保證供體枝條的光合活性和光同化產物分布唯一地營養嫁接植物的莖。
將這些植物置於溫室中直到嫁接後約兩個月並在種植到土壤後約三個月收穫馬鈴薯塊莖。這樣的嫁接實驗的結果在
圖12中表示。
序列表(1)基本信息(i) 申請人(A)名稱Max-Plank-Gesellschaft zur Foerderungder Wissenschaften e.V(B)街道無(C)城市Berlin(D)國家德國(E)郵政編號無(ii) 發明名稱增加植物產量的方法(iii) 序列數1(iv) 計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentIn Release#1.0，版本#1.30(EPA)(2)關於SEQ ID NO1的信息(i) 序列特徵(A)長度1138個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線型(ii) 分子類型基因組DNA(iii) 假設無(iv) 反義無(vi) 原始來源(A)生物髮根農桿菌(xi) 序列描述SEQ ID NO1AATTCGATAC GAAAAAGGCA AGTGCCAGGG CCATTTAAAA TACGGCGTCG GAAACTGGCG60CCAATCAGAC ACAGTCTCTG GTCGGGAAAG CCAGAGGTAG TTTGGCAACA ATCACATCAA 120GATCGATGCG CAAGACACGG GAGGCCTTAA AATCTGGATC AAGCGAAAAT ACTGCATGCG 180TGATCGTTCA TGGGTTCATA GTACTGGGTT TGCTTTTTCT TGTCGTGTTG TTTGGCCTTA 240GCGAAAGGAT GTCAAAAAAG GATGCCCATA ATTGGGAGGA GTGGGGTAAA GCTTAAAGTT 300GGCCCGCTAT TGGATTTCGC GAAAGCGGCA TTGGCAAACG TGAAGATTGC TGCATTCAAG 360ATACTTTTTC TATTTTCTGG TTAAGATGTA AAGTATTGCC ACAATCATAT TAATTACTAA 420CATTGTATAT GTAATATAGT GCGGAAATTA TCTATGCCAA AATGATGTAT TAATAATAGC 480AATAATAATA TGTGTTAATC TTTTTCAATC GGGAATACGT TTAAGCGATT ATCGTGTTGA 540ATAAATTATT CCAAAAGGAA ATACATGGTT TTGGAGAACC TGCTATAGAT ATATGCCAAA 600TTTACACTAG TTTAGTGGGT GCAAAACTAT TATCTCTGTT TCTGAGTTTA ATAAAAAATA 660AATAAGCAGG GCGAATAGCA GTTAGCCTAA GAAGGAATGG TGGCCATGTA CGTGCTTTTA 720AGAGACCCTA TAATAAATTG CCAGCTGTGT TGCTTTGGTG CCGACAGGCC TAACGTGGGG 780TTTAGCTTGA CAAAGTAGCG CCTTTCCGCA GCATAAATAA AGGTAGGCGG GTGCGTCCCA 840TTATTAAAGG AAAAAGCAAA AGCTGAGATT CCATAGACCA CAAACCACCA TTATTGGAGG 900ACAGAACCTA TTCCCTCACG TGGGTCGCTA GCTTTAAACC TAATAAGTAA AAACAATTAA 960AAGCAGGCAG GTGTCCCTTC TATATTCGCA CAACGAGGCG ACGTGGAGCA TCGACAGCCG 1020CATCCATTAA TTAATAAATT TGTGGACCTA TACCTAACTC AAATATTTTT ATTATTTGCT 1080CCAATACGCT AAGAGCTCTG GATTATAAAT AGTTTGGATG CTTCGAGTTA TGGGGTAC1138
權利要求
1.一種用於增加植物產量的方法，其特徵在於表達包含(a)允許在伴胞中特異轉錄的區域；以及與其可操作連接的(b)編碼選自下列多肽的核苷酸序列(i)具有切割蔗糖的酶活性的蛋白；(ii)蔗糖轉運蛋白；(iii)其活性引起位於植物細胞質膜上的質子梯度的刺激作用的蛋白；和(iv)檸檬酸合酶並穩定整合入植物基因組的重組DNA分子。
2.權利要求1的方法，其中核苷酸序列編碼植物蛋白。
3.權利要求1的方法，其中核苷酸序列編碼來自細菌或真菌的蛋白。
4.權利要求1的方法，其中核苷酸序列編碼具有切割蔗糖的酶活性的蛋白，蛋白選自蔗糖合酶、蔗糖磷酸化酶和轉化酶。
5.權利要求1的方法，其中核苷酸序列編碼來自菠菜的蔗糖轉運蛋白。
6.權利要求1的方法，其中核苷酸序列編碼質子ATP酶。
7.權利要求6的方法，其中核苷酸序列編碼來自馬鈴薯或來自釀酒酵母的質子ATP酶。
8.權利要求1～7的任意一項的方法，其中(a)中提及的區域是來自髮根農桿菌的rolC啟動子。
9.一種重組核酸分子，包含(a)允許在植物伴胞中特異轉錄的區域；以及與其可操作連接的(b)編碼選自下列多肽的核苷酸序列(i)蔗糖合酶；(ii)蔗糖磷酸化酶；(iii)蔗糖轉運蛋白；(iv)其活性引起位於植物細胞質膜上的質子梯度的刺激作用的蛋白；和(v)檸檬酸合酶。
10.一種載體，含有權利要求9的重組核酸分子。
11.權利要求10的載體，它適於轉化植物細胞以及將外源DNA整合入植物基因組。
12.用權利要求9的重組核酸分子轉化並含有其的植物細胞。
13.含有權利要求12的植物細胞的植物，其中由於重組核酸分子在植物伴胞中的表達，植物表現與對應的未轉化植物相比增加的產量。
14.權利要求13的植物的繁殖材料，含有權利要求12的植物細胞。
15.含有允許在植物伴胞中特異轉錄的區域以及與其可操作連接和編碼選自下列多肽的核苷酸序列的重組核酸分子的用途(i)具有切割蔗糖的酶活性的蛋白；(ii)蔗糖轉運蛋白；(iii)其活性引起位於植物細胞質膜上的質子梯度的刺激作用的蛋白；和(iv)檸檬酸合酶，用於在轉基因植物中表達以增加產量。
全文摘要
本發明描述的是增加植物產量的方法,其中在伴胞特異的啟動子控制下表達核苷酸序列。核苷酸序列編碼的蛋白的表達導致刺雷射同化產物在韌皮部的積累。
文檔編號A01H5/00GK1265704SQ98807898
公開日2000年9月6日 申請日期1998年8月5日 優先權日1997年8月7日
發明者M·科瓦特, J·裡斯梅爾, L·維爾密澤 申請人:馬普科技促進協會