可變容積電穿孔室以及其方法

2024-01-25 14:54:15

專利名稱：：可變容積電穿孔室以及其方法
技術領域：
：本發明涉及體外細胞和小泡的電穿孔。更具體地說，本發明涉及在電穿孔室、尤其是總容積具有按照需要加以變化的易處理室中對細J包和'J、泡進行電穿孔。
背景技術：
：以下描述包括可以用於理解本發明的信息。它並不是承認任何這樣的信息是現有技術，或與目前要求的發明有關，或明確地或隱含地提及的任何出版物是現有技術。電穿孔
技術領域：
充滿轉染生物細胞和小泡的活體外方式。例如，授權給Meserol的美國專利第5,720,921號披露了一種電穿孔室，其被i殳計成連續液流室，其中小泡被輸送到該室、電穿孔並在施加電穿孔脈衝以後^皮清洗。其它液流室包括授權給Nicolau(U.S.P.N.5,612,207)、Dzekunov(U.S.RA.N.2001/0001064)、以及Vernhes(U.S.P.N.6,623，964)的美國專利。在每一種這些披露內容的情況下，對於電穿孔生物細胞的臨床應用，液流室並不是一種最佳設計。這是因為為了無菌性必須解決的機械問題並且由於難以在細胞群體的電穿孔和當細月包連續通過室時所4吏用的月永沖之間建立聯繫。還"l皮露了其它的電穿孔室，其中並沒有使用含有(承載)小泡的介質的連續液流，但電穿孔室裝置包括各種元件。例如，授權給Marshall的美國專利第4，906，576號4皮露了一種室，其連同其它元件一起具有^茲芯。授權給Jarvis的美國專利第6,897,069號披露了一種具有可移除電極的電穿孔樣品室。其它室是用於處理小樣品的小池型(cuvettestyle),即，約250jxl至1.5ml。還有其它室，如在4ti又給Walters的WO04/083,379中所才皮露的，4是供更大的容積，即，達到10毫升左右，但這樣的室並不是動態的，因為室的尺寸是固定的並且採用的電極是兩個平行板，該板僅用於包含小泡的介質的固定範圍的電導率，其必須相對於容積/細月包密度和傳送到固定容積室的電導率加以計算。在Walters專利中，例如，介質的電導率4皮降低，使得可以處理並在單個電穿孔事件中電穿孔較大的容積。具體地說，對介質進行調節，使得介質具有0.01至1.0毫西門子的電導率(100-1000歐姆的電阻)。在許多情況下，調節介質的電導率並不是所希望的或不現實的，因為最理想的介質是鹽水基介質，其是內在導電的並為細胞提供穩定的和能生存的環境。鹽水基介質是優選的，因為它們被設計為4是供4妻近地類似細胞的自然生活環境的環境，從而使細胞死亡降至最小程度。最廣泛使用的介質之一是磷酸緩衝鹽溶液(PBS),其是內在導電的，這是起因於溶液的離子含量。在基因治療裝置中通常需要活體外轉染患者的細胞，其中從患者移出細胞，如祖細胞和其它所謂的"幹"細胞，然後在細胞培養將細胞的數目擴大許多倍。因為通常在懸浮培養中進行細胞的擴大，所以這樣的細l包在其中擴大的容積是非常可變的。另外，就它們在培養物中的存活而言以及就電穿孔過程而論，細胞密度是重要的。因此，在期望轉染大量細胞的情況下，個別樣品之間的容積差異可能是高度可變的。這意p未著，在臨床裝置中，一種才幾構必須用來加入處理步驟以使樣品之間的容積變得均勻，以致可以使用固定尺寸的電穿孔室，或必須存在一種^M勾，用於適應在這樣的介質容積方面的差異而無需直接調節容積或細胞密度和/或適應介質的特定的低電導率。另外，通常利用具有相對較高電導率的介質對懸浮液中的細胞進行電穿孔，如磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，其具有0.017西門子/cm的電導率。當試圖電穿孔大量的包含能生存的生物細胞的介質時，甚至考慮使用具有0.4cm間隙的室，因此將需要較大的電流來同時對整個容積施加力永沖，這是由於試圖施加脈衝通過4交大^黃截面積所產生的低電阻，從而將可能受到損傷，或在脈衝條件下經受可變性。而一些發明已設法通過設計使用低電導率介質的系統來克服這樣的困難，這樣的系統的使用是不能實行的，因為低離子強度介質可能會4員害細月包生存力。^口最近在Cwre"fGe"eT7zera;^(Vol.5,pp375-385,2005)中指出的，目前的電穿孔方法並不是一種可行的工具來轉染某些細胞，這是由於較差的細胞存活(大約僅1%)，除非採用更加細胞友好的介質。然而，甚至先前改善的介質條件僅保證5-6%的細胞存活。因此，在本
技術領域：
需要促進使用活體外系統來轉染細胞和小泡如幹細胞，其中採用大容積4各式的分子，即，例如約1至高達100ml，其可以容易地和便宜地將上述分子傳送到細胞而無需在每種情況下進行離子強度對容積對細胞密度的關鍵計算。因此，本發明通過提供在任何這樣的容積下其電穿孔細胞的能力為動態的系統來滿足上述需要。.
發明內容在第一具體實施方式中，本發明提供了一種裝置，用於活體外大容積電穿孔細胞和小泡，尤其是抗原呈遞細胞、祖細胞和/或千細胞。一4殳地，這樣的容積是在1至100ml之間、通常在5至75ml之間以及優選在10至50ml之間。幹細胞是指來源於胚胎或成體來源的多能細胞，其保持可以被誘導以分化成各種細胞類型的表型，包括內胚層、中胚層以及外胚層(Mendez等人，2005)。其它有用的用途包括為了4秦種疫苗和治療目的而轉染免疫系統的細胞。藉助於本發明可以轉染的免疫系統的細月包包4舌單核細月包、巨噬細月包、T和B、淋巴細月包、樹突細月包以及其它抗原呈遞細月包。雖然本發明涉及使用人細胞，但藉助於本發明也可以處理其它物種的細胞。在第二具體實施方式中，本發明提供了一種用於電穿孔細胞和小泡的裝置，其中所述裝置包括一種這樣的室，該室具有按照需要的能採耳又在1至100ml之間的任何遞增的容積的能力。在一種有關的具體實施方式中，該裝置可以在任何這樣的容積下進4於才喿作，而無需相對於電極的容積或表面積調節或計算比離子強度，其中電極與含有所述細力包或'J、泡的介質^妄觸。在第三具體實施方式中，本發明的室包括許多單獨可尋址電才及，在一種優選的具體實施方式中，其能夠對流體介質的容積引發電脈沖而無需計算電極間隙與容積的比率，而如果僅使用跨越整個室的單電才及對，則可能需要計算電才及間隙與容積的比率。具體地說，對於使用的任何容積，脈沖條件(即，電壓、脈沖形式、以及脈衝持續時間)與所述容積無關。在一種有關的具體實施方式中，包含細胞的流體介質的電導率可以包括可用於實施生物細胞和小泡的電穿孔的任何7K平的電導率。例如，包含細胞的介質的電導率可以相當於磷酸緩衝鹽溶液(PBS)或更小。在另一種具體實施方式中，本發明的電穿孔室可以適應流體容積而沒有暴露於露天環境，因而可以進4亍才喿作而不涉及或不需要在室中i殳計有空氣過濾器或排氣孔(airbleedorifice)。在另一種具體實施方式中，許多電極包括一系列的平行"板"電才及，其可以布置在本發明的室內<吏得所述4反的長度在和對應的可變的容積可調節性相同的方向，即，柱塞的推拉方向進行延伸，或可以在與室容積擴大的方向成90度的方向進4於延伸。在一種有關的具體實施方式中，單獨的才反可以包括任〗可有用的生物相容和導電材料，其包括鈦和金。在一種進一步優選的具體實施方式中，板可以包4舌通常大於只於置電才及(對電才及，opposingelectrode)之間的距離或間隙的寬度尺寸，並且甚至優選大於間隙距離的兩倍。每個電極板可以是由電脈衝獨立地可尋址的，其中電脈衝足以對位於任何陰才及與陽才及電扭j反對之間的;容液中的生物細胞和小泡進4亍電穿孔。在另一種具體實施方式中，電極可以包括2至100個陰極和2至100個陽才及之間的陣列，並且總是存在偶數的陰極和陽極以形成陽極和陰才及對。在又一進一步的具體實施方式中，陰極和陽極可以在儲存器的相反內側相隔0.4至1cm之間的距離，即，電脈衝必須透過的間隙大約在0.4cm至1cm之間。在又一進一步的具體實施方式中，可以以2.4和29.5歐姆之間的負載電阻(以歐姆為單位)(其取決於室尺寸)對每對所述陽極和陰極進行供能。當室中的每個電極對被順序地供能時，將用足以發生電穿孔而又不損傷細胞的等效能量對懸浮在室中的生物細胞(與它們在室中的位置無關)施加脈沖。在一種進一步的具體實施方式中，本發明可以包括各種各樣的儀器或其它部件如指示器，用於檢測和顯示給與暴露於細胞介質的系列電極的電穿孔脈沖序列已完成的通知。用戶可使用這樣的指示器來始終監視是否室已經暴露於脈沖。在另一個實例中，該室可以在其設計中包括一種4建控部件(keyingfeature)來幫助以適當的取向將該室固定於其基底託盤以致以適當序列將脈衝給予到每個電極上。根據以下附圖、詳細描述、以及所附權利要求，本發明的其它特徵和優點將是明顯的。附圖"i兌明圖1是是示出了本發明的可變容積室10和電才及激勵4乇盤200的透^L圖。如圖所示，室10被構造成可拆卸地連接或安裝到託盤200上，佳j尋室的每個電扭j反11的電招j妄觸小塊(electrodecontactnub)15接觸託盤電才及接頭(電才及調整片)201。在該具體實施方式中，接觸小塊15從室外殼並從室的底部或底側引出。圖2是本發明的室的—見圖，其示出了在埠14一側室的端4見圖(側一見圖)，該埠可以以^f壬《可方式加以構造以適合連4妄於包含待電穿孔的細胞的流體介質源，如小型快速接頭(luerfitting)。圖3是示出了本發明的室10的分解圖的透視圖，其中示出帶有推桿13和半彈性減震墊16的柱塞(活塞)12，其共同地並可滑動地接合室10的內壁(側面、頂部以及底部)，從而提供密封，進而^吏流體可以吸入和4,出室(類似於注射器)。電才及11沿室10的相反側排列。該圖進一步示出了電極接觸小塊15，在該具體實施方式中，其/人室外殼的側面突出。圖4示出了包括埠14的室IO末端的部分透視圖。可對帶有半彈性減震墊的柱塞加以定位以在室內產生不同的容積。圖5是本發明的室10的俯4見圖，其示出了柱塞12已定位在室的約一半容積、17。圖6A-E示出了如在圖5中的俯視圖並且描述了電極對2至6的逐步脈衝(圖6A-E),使得每個電極對之間的電場18相對均勻地穿過電極之間的間隙距離。星號表示正被供能的電極對。圖7是一種可替換室設計的透視圖，其中本發明的室100由相對較小表面積的電才及111構成。這樣的構造可以用於電4及之間的間隙3巨離為約1cm的室構造中。圖8示出了來自經處理的細胞(如在實施例中所描述的)的平均螢光讀數。具體實施例方式如本領域:技術人員將明了的，以下描述詳細地描述了本發明的某些優選具體實施方式，並JU又是示例性的而不是描述本發明的實際範圍。在詳細描述本發明以前，應當明了，本發明並不限於所描述的特定的裝置布置(devicearrangement),系統以及方法，因為它們可以變化。還應當明了，本文所使用的術語僅是為了描述特定的具體實施方式，而不是用於限制由所附權利要求所限定的本發明的範圍。本發明涉及電穿孔哺乳動物細l包和其它小泡，尤其是幹細月包和-組細月包的活體外方法，其中細月包淨皮懸浮在較大容積室內的導電介質中。該^交大容積室包含許多電極對，其以這樣的方式加以布置4吏得在暴露於所述流體介質的那部分室中在對置電極的每個連續對之間的介質暴露於電能的多個順序脈沖。在這樣的室中，並不是同時電穿孔全容積的含有生物細胞的介質而是通過對單個電極對或可替才奐;也對電才及對的組部分i也施加月永沖來進4亍電穿孑L。這才羊的月永沖可以順序i也在單個或"i午多對中，或交錯廿也由一個以上的電才及對施力口樂:K衝，例如，第一和第二對電極發送脈沖，接著是第二和第三對發送月永沖，然後是第三和第四對發送脈沖，等等。在一種優選的具體實施方式中，本發明的專交大容積室保證將來自用於整個室的單脈沖的電脈沖載荷分為一系列更小的載荷，以避免自然發生的物理限制，其是起因於給定表面積的電極能夠施加的最大極限能量，尤其是在使用高電導率介質的情況下。在一種有關的具體實施方式中，本發明的室還便於避免特殊的處理要求，而如果採用許多單獨的單個標準小池或如果採用特殊選#^的低離子強度介質，則將需要上述特殊的處理要求。在固定尺寸的電穿孔中可以逐漸減小脈衝載荷，但鑑於適應各種各樣的容積的實際需要，本發明克服了採用特殊處理要求的需要，而對固定尺寸的室而言則是必要的，如容積調節、起因於容積調節的離子強度變化，以及需要泵或其它裝置來輸送介質進出這樣的室。在另一種具體實施方式中，本發明包括一種使用本發明的室的方法，其中含有細^^的介質的電導率大於50毫西門子(電阻小於20歐姆)並且甚至大於500毫西門子(電阻小於2歐姆)。這相反於常夫見系糹充如由Bio-Rad製造的系糹充(即，GenePulserXcellElectroporationSystem),其被規定用來在大於20歐姆的條件下進行操作，即，優選用於這樣的裝置的介質電導率(低電導率)是小於50毫西門子。雖然〗吏用高電導率溶液可以導致發生電弧或與其它性能問題有關，但僅當同時將電穿孔脈沖傳送到整個室時才可能發生這樣的問題。然而，本發明的室並不易於發生電弧，這是由於它使用來自單獨電極對的一系列脈衝，從而在被電穿孔的總容積的任4可給定部分逐漸減小了電^永沖載荷。現轉向本發明的室，在第一優選的具體實施方式中，如圖1所示，室10優選包括矩形室，其內部容積(取決於其構造)能夠接收多達並且甚至大於100ml的流體介質的容積。實際上，雖然較大容積室的設計便於容積按比例擴大到任何容積，但本發明的裝置通常被構造成處理在實驗室和臨床裝置中通常要處理(experienced)的容積，即，小於100ml的容積。因此，通常，本發明的室可以優選被構造成容納5、10、15、20、25、30、35、40、50或甚至100ml的最大容積或在5至100ml之間的任何遞增容積的流體介質。本發明的室10的構造類似於注射器和柱塞，其中通過將矩形柱塞12插入矩形室來增加或減少所述室的容量。矩形柱塞^皮構造成典型的注射器柱塞式樣，其中半彈性惰性橡膠減震墊16連接於柱塞的室側面以及柱塞杆13在另一側。在室開口(其中柱塞被插入室內部)的末端附近，存在至少一個由調整片(tab)或室本身的端壁形成的柱塞止動件，其使柱塞免於完全脫離室內部。可以經由埠14進入室內部，其中埠14可以^f立於室的端壁或可替才奐i也在端壁附近〗旦在頂部、底部或側壁上。該室進一步包括許多對置陽極和陰極11。在一種優選的具體實施方式中，對置陰極與陽極(即，在室的相反側上的電極)之間的3巨離或間隙是在0.4cm至0.1cm之間。在特別優選的具體實施方式中，每個電極的寬度大於對置電極之間間隙的測量結果並且優選大於間隙距離的兩倍。因此，電極的寬度可以在0.4至5cm的範圍內。該特徵可以保證電場的強度在間隙距離的範圍內保持相對均勻，而如果距離大於電極的寬度，則電場將易發生顯著的減弱。在一種有關的具體實施方式中，布置在室中的電才及11可以垂直於柱塞的4立伸方向、或這樣設置在室中使得它們平行於柱塞拉伸的方向延伸室的長度。如圖l進一步示出的，通過將室設置到基底接觸器託盤200中用電穿孔脈衝給室電極11供能，其中基底接觸器託盤200保證室中的電極和基底託盤200中電極接頭之間的接觸以及電能源。基底4妾觸器託盤200可以包括另外的實施方式，用於控制如電極脈沖的順序。可替換地，電才及脈衝的控制可以集成到電脈衝源，即，電穿孔發生器。在又一種具體實施方式中，本發明的室可以構造成具有任何數目的電極對(即，包括陽極和陰極的對)，但優選對的數目將取決於每個電才及的表面積與它們之間的間隙。這是因為，在有具有生理範圍、即離子強度範圍類似於磷酸緩衝鹽溶液(PBS)的電導率的細胞介質存在的情況下，對可以施加通過給定尺寸的間隙而沒有發生電弧的電力負載量存在物理性限制。例如，如表1所示，電極可以設計成具有各種表面積供各種間隙距離之用，從而利用各種各樣的月永沖條件來電穿孔才羊品。在每種情況下，電穿孔的實際容積與實際月永沖條件無關，因為室^皮構造成併3正容易地在遠^氐於最大載荷的脈衝載荷下使用電極，其中如果同時對所有電極施加脈沖則最大載荷是必要的。因此，在一種優選的具體實施方式中，電極可以被構造成具有0.8至20cm2之間的表面積。對於另一個實例，對於具有最大容積20ml的室，電極數目可以在1至50之間，每個具有1至20cm2之間的表面積，其取決於對置電極之間的間隙距離。表1tableseeoriginaldocumentpage15沒有陰影=所期望的電穿孔載荷；灰色陰影=可工作的電穿孔載荷；深色陰影=不可工作的電穿孔載荷如表1所示，室可以被構造成具有各種各樣的最大容量、各種各樣的電才及間隙、各種各樣的電極數目，其保證逐漸減小每個脈衝的電力負載，並同時保持與在生理範圍的細胞介質電導率相容。用於電穿孔的最廣泛-使用的介質之一是PBS,由於溶液的離子含量，其是內在導電的。因為PBS具有0.017西門子/cm的電導率，所以在標準0.8ml小池中使用PBS將產生大約12歐姆的電阻負載。用小於IOO歐姆的負載電阻進行電穿孔是難以實現的，因為最常規的電穿孔設備不能在低電阻的範圍內進行操作。例如，由Biorad製造的電穿孔設備，具體地說，GenePulserXcell具有/>布的20歐姆的低載荷限制。其它設備如BTX電穿孔發生器具有限制，其是基於設備、導線以及連接(connections)的固有容量。在導線、連接器以及電容器中要求0.2歐姆至1歐姆電阻並不是不合理的。當在這樣的系統中對2歐姆載荷施加脈沖時，在設備中可以損失多達33%的電穿孔電壓(和能量)。另外，低電阻載荷還引起其它困難，其是起因於需要較大的沖擊電流。這些複雜情況可以進一步包括瞬時轉:換信號噪聲、4義器可靠性以及樣品加熱。就本發明而論，我們已發現，將載荷分為負栽電阻為2歐姆或用於^寺電穿孔的介質的整個容積的單個電相^於施加力永衝。在一種有關的具體實施方式中，使用生理離子強度可保證電穿孔過程的簡化，因為細胞可以摘:取自細胞培養物、用PBS洗滌、以及直接放入可變容積室中。如本領域技術人員明了的，使用中，製備患者細胞群體樣品，如擴大的幹細胞或其它祖細胞的群體，用於分送到室中。通常，在其中對細l包進4亍處理的介質具有相當於生理鹽水的離子強度。另外，取決於特定的細胞樣品，樣品的容積大約在5至50ml的範圍內。在用包含細胞的介質填充室以後，將該室力文置在基底託盤中並將傳感器加入託盤中以確定暴露於流體介質的電極數目。在包括載荷才企測器、或電極暴露於流體介質的具體實施方式中，檢測器可以測量這才羊的要素如電流。然後，在4全測了脈衝的適當電一及以後，從室的一端到另一端，對暴露於介質的電極的每個相反對逐步施加脈衝。可^^糹奐地，可以以各種各樣的形式對電才及施加力永沖。例如，不是一個^妄一個地逐步給一對對置電糹及施加^永沖，而是可以對兩個對置電招J寸同時施加萬永衝，^接著乂於第二個兩個相反對施加月永衝。可以以重疊形式對電才及進一步施加力永衝，其中，例如，在對電才及的兩個相反對施加脈沖以後，接著的要給予脈沖的電才及可以和已經剛一皮給予脈沖的相鄰電極同時糹皮施加脈沖。在每種情況下，脈沖的形式將可能提供足夠的電能來電穿孔在樣品中的所有細胞。另外，如本領域技術人員所很好明了的，填充室的每個操作、柱塞的移動、以及電才及的〖敫活者卩可以通過單調方式來完成，如通過電子i殳備或電動機。實施例以下實施例是用來i兌明本發明的某些方面具體實施方式、以及用途，以及幫助本4頁i或才支術人員實施它。該實施例並不以<壬<可方式限制本發明的範圍。該實施例描述了一系列實驗，其中利用了一系列三個小池對單個小池。在標準組織培養燒瓶中並在補充有10%胎兒牛血清和90g/ml艮他黴素的Mcoy:s介質中將鼠B16細胞(ATCCCRL6475)培養成單層。利用0.05%月夷蛋白酶和0.02%EDTA的溶液，,人燒並瓦中除去細胞。在除去以後，通過在225xg下的離心作用並用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌細胞三次，然後懸浮在小容積的PBS中。利用標準血細胞計數器和臺盼藍排阻染料對得到的懸浮液進行計數。大約90%的細月包是能生存的。在計lt的懸浮液中細胞的濃度^皮調節到1xio6個細力包/ml。細胞以1:1比率與120新鮮製備的釣黃綠素溶液(在PBS中)進^亍〉'昆合，然後利用BTXT820電穿3U永沖發生器進4亍電處理。在標準4mm間隙電穿孔小池或三寫關(triple)小池中對細胞進行處理，其中三聯小池是通過緊密並置三個4mm間隙電穿孔小池而製成，並在中心小池和每個相鄰小池之間插入有月交質玻璃隔離物。在組裝前，對膠質玻璃隔離物和待並置的中心和末端小池的側面進4亍機械力cr工，以使流體可以在三個小池之間流動。使用了三聯小池的三種不同的才莫型。一種才莫型在相鄰小'池之間具有2mm間隔，另一種模型在小池之間具有3mm間隔，以及第三種模型在相鄰小池之間具有4mm隔離物。通過應用一個電極作為陽極和另一個電極作為陰極(其被集成到裝置中)，將"永沖施加於標準4mm間隙小池。然而，以非常特定的方式將脈衝施加於三聯小池。首先施加脈衝穿過末端小池的4mm間隙。才妄著施力口月永穿過中心小;也的4mm間隙。最後，施力口月永衝穿過另一末端小池的4mm間隙。手控開關盒用來將脈沖,人BTXT820電穿孔電源引導到三聯小池。在單個和所有三個三耳關小池中，通過施加標稱場強為1600V/cm的8個直流脈沖，對與鈣黃綠素混合的B16細胞進行處理。只十於單個小池，施力o—糹且8個月永沖。對於每個三聯小;也，施力口三糹且月永衝，每《且為8個月永衝。4尋一ia施力o穿過每個連#:的d、;;也的4mm間隙。在電處理以後，從小池移走B16細胞並在37。C下溫育20分鐘。用PBS洗滌細胞三次，同時通過離心作用(225xg)在洗滌之間進行造粒。在洗滌以後，將在每個樣品中的細胞再懸浮在400(il的PBS中並利用螢光孩i量滴定4反讀出器(Biotek)進行螢光光i普(spectrafluorametrically)分衝斤。i亥分衝斤包4舌^f來自每個才羊口口口的三個100pl等分的細胞懸浮液進行分析。計算平均螢光數據以獲得每個樣品的單個讀數。匯集來自三份樣品的平均數據。圖8示出了平均螢光讀數，其來自暴露於鈣黃綠素(沒有被施加脈衝)的細胞、暴露於鈣黃綠素並在單個室中被施加脈衝的細胞、以及暴露於鈣黃綠素並在三個三聯室中被施加脈沖的細胞。數據表明，相對於僅暴露於釣黃綠素的細胞，在所有四種類型的小池中施加電場均導致增加的細力包焚光。才艮據本文4皮露的內容，可以進4亍和執行本文4皮露和要求的所有結構(《且成，composition)和方法，而無需過度的實馬全。雖然已通過優選的具體實施方式描述了本發明的結構和方法，但對於本領域技術人員來說明顯的是，可以在不偏離本發明的精神和範圍的情況下，對結構和方法以及本文描述的方法的步驟或步驟順序施加變化。更具體地說，描述的具體實施方式在各個方面都僅是說明性的而不是限制性的。對本領域技術人員來說明顯的是，所有類似置換和改進^皮i人為是在如所附4又利要求所限定的本發明的精神和範圍內。在本說明書中提及的所有專利、專利申請、以及出版物表示在與本發明有關的領域中技術人員的水平。所有專利、專利申請、以及出版物(包括對其要求優先權或另外益處的那些專利、專利申請、以及出版物)以引用方式結合於本文，其結合程度與如單個出版物被具體和單個指明被結合於此作為參考是一樣的。本文描述的發明可以適當地在沒有任何在本文中未具體4皮露的元件的情況下加以實施。因此，例如，在本文的每一種情況下，任何術語"包括"、"基本上由…組成"、以及"由…組成"可以用其它兩個術語的4壬何一個加以代替。已採用的術語和表達是用作描述的而不是限制的術語，因此使用這樣的術語和表達並不意p未著全部或部分地排除所示出和描述的特徵的任何等效替換，而是應當明了，在本發明要求的範圍內各種改進是可能的。因此，應當明了，雖然已通過優選的具體實施方式和可選特徵具體地4皮露了本發明，4旦本領i或，技術人員可以利用本文4皮露的構思的改進和變化，並且這樣的改進和變化被認為是在如由所附權利要求所限定的本發明的範圍內。權利要求1.一種用於在懸浮介質中電穿孔生物細胞和小泡的可變容積電穿孔室，包括形成儲存器的外殼，其中所述外殼包括所述儲存器的四個側壁、頂部以及底部；閥，所述閥包括外孔和內腔，所述內腔將所述孔連接至所述儲存器，所述腔與所述儲存器的所述連接位於所述外殼中；在所述儲存器內的可滑動調節裝置，用於通過所述腔和孔將流體介質吸入或排出所述儲存器；彼此相對平行並且沿著所述儲存器的至少兩個對置內側壁放置的許多隔開的細長陰極和陽極，其中電極是單獨地用電脈衝可尋址的；以及連接於所述電極的電能源，其中可以用足夠電能對所述電極施加脈衝以在所述儲存器中引起包含在流體介質中的生物細胞和小泡的電穿孔。2.才艮據^l利要求l所述的可變容積室，其中，所述可滑動調節裝置包括4主塞。3.才艮據4又利要求1所述的可變容積室，其中，所述室包括矩形。4.根據權利要求1所述的可變容積室，其中，所述室包括圓筒形。5.根據權利要求3所述的可變容積室，其中，所述柱塞包括矩形。6.才艮據4又利要求4所述的可變容積室，其中，所述柱塞包4舌圓筒形。7.才艮據4又利要求1所述的可變容積室，其中，所述孔包括停止旋塞以及用於連接至外部管道或其它裝置的連接器。8.根據權利要求1所述的可變容積室，其中，所述許多電極包括陽極和陰極，所述陽極沿著所述儲存器的一個內側壁排列而所述陰極沿著相反側的內側壁進行排列。9.根據權利要求8所述的可變容積室，其中，所述電極平行於所述柱塞沿其可以在所述々者存器中滑動i也移動的糹從向排列。10.才艮據外又利要求9所述的可變容積室，其中，所述陰才及和所述陽才及在所述儲存器的相反側上相隔0,4至1.0cm。11.根據權利要求8所述的可變容積室，其中，所述電極垂直於所述柱塞沿其可以在所述4諸存器中滑動i也移動的糹從向排列。12.根據權利要求11所述的可變容積室，其中，所述陰極和所述陽才及在所述〗諸存器的相反側上相隔0.4至1.0cm。13.根據權利要求8所述的可變容積室，其中，所述許多電極包括3至20個陰才及以及3至20個陽才及，陰極和陽才及的數目總是彼此相等。14.根據權利要求8所述的可變容積室，其中，所述陰極和陽極包括寬度在0.4至5cm之間的板。15.—種在液體介質中活體外電穿孔生物細月包和小泡以將感興趣的分子遞送到所述細胞和小泡的方法，包括將所述細力包/小泡和所述感興趣的分子》丈置在糹又利要求1所述的電穿孔室中，其中通過在將所述液體介質引導入所述儲存器的方向上滑動所述柱塞而將所述細力包/小泡和分子吸入所述儲存器；將所述室"&置在包括電能源的底座中並激活所述電能源以將電能的至少一個電穿孔脈衝給予每對暴露於所述液體介質的陰才及和陽才及；通過在迫使所述細胞/、泡流出所述儲存器的方向上滑動泡，從而將所述感興趣的分子遞送到所述細胞和小泡。16.根據權利要求15所述的方法，進一步包括通過測量電流信號來才全測穿過電才及間隙的載荷。17.根據權利要求15所述的方法，其中，所述生物細月包包4舌哺乳動物;^且細力包和/或幹細月包。全文摘要本發明披露了一種室式裝置，用於體外電穿孔相對較大容積的含有生物細胞或小泡的流體介質，其中用於含有所述細胞和小泡的儲存器的容積可按照需要加以變化並且其中所選容積直接與待電穿孔樣品的容積有關。該裝置具有進一步的具體實施方式，其中室是易處理的並且可以以與患者分離或與其相連的方式進行操作。文檔編號C12M1/42GK101370927SQ200680046389公開日2009年2月18日申請日期2006年12月7日優先權日2005年12月7日發明者安德烈·S·蓋米林申請人:基因特倫尼克斯公司