腫瘤靶向性基因傳遞非病毒載體的構建與製備的製作方法

2024-01-21 16:43:15 1

專利名稱：腫瘤靶向性基因傳遞非病毒載體的構建與製備的製作方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學腫瘤基因治療用載體領域，涉及一種供外源基因靶向性導入腫瘤局部的非病毒載體的構建與製備。
背景技術：
基因載體是在基因治療中使用的將外源基因導入機體細胞的傳遞系統。外源性基因進入靶細胞有3種障礙①細胞膜；②胞漿內的吞噬泡-溶酶體；③細胞核膜。為了通過這幾道屏障基因載體的結構一般包括載體骨架、靶向性配體、吞噬泡釋放劑和核定位信號肽。首先載體骨架用來承載並保護DNA分子；其次靶向性配體可以與細胞膜受體特異性結合，加強細胞內吞作用，形成吞噬泡，吞噬泡的pH值逐漸下降形成溶酶體，外源基因將在溶酶體中被降解，病毒來源的兩性分子肽(amphipathic peptides)是目前常用的一種吞噬泡釋放劑，起到幫助基因複合物逃脫吞噬泡進入胞漿，避免溶酶體降解的作用；最後核定位信號肽可幫助目的基因從胞漿轉入細胞核，完成整個基因導入過程。如果是癌細胞靶向，外源基因可利用頻繁的細胞分裂進入染色體，那麼核定位就不重要了。
目前研究的基因載體可分為兩大類病毒載體和非病毒載體。病毒載體是靠病毒對細胞的天然感染能力將外源基因整合進宿主細胞，具有較高的轉染效率，容易獲得對外源基因的長時表達。其缺點是生產不便，毒性尤其是免疫源性大，不宜反覆使用以及對所攜帶的外源基因片斷的大小有限制等。非病毒載體雖然在轉基因效率和獲得長時表達方面不如病毒載體，但不存在上述這些缺點，經過修飾改造的新型非病毒載體在安全、有效、靶向等方面均有所突破，因此成為基因治療載體的研究熱點。本項發明涉及的非病毒載體系統同時具備了以上幾種特徵，以求做到安全、有效、靶向幾方面。
基因治療的靶向性問題直接影響其安全性和有效性，現在解決的方法通常是對載體進行靶向性配體修飾。
腫瘤血管保持著一種不斷新生的狀態，其表面有與增生有關的分子標誌，整個瘤體就是一個新生組織，他依賴新血管為其供應養分、維持代謝。整合素alpha(v)beta3、alpha v beta5在腫瘤的脈管系統內皮細胞過表達[ErkkiRuoslahti，Drug targeting to specific vascular sites，DDT Vol.7，No.22 November2002]，與腫瘤部位促血管新生作用有關，在某些腫瘤細胞表面也高表達，國內外許多研究者早就將它作為腫瘤的靶標進行研究。通過噬菌體展示技術人們找到的RGD肽是αv整合素配體的結合域，用含有RGD的肽作為配體修飾載體，可將基因靶向αv整合素表達的部位[Erkki Ruoslahti，Targeting tumorvasculature with homing peptides from phage display，seminars in CANCERBIOLOGY，Vol.10，2000pp.435-442]。例如在表達整合素的Mewo細胞上，用RGDC四肽修飾的PEI載體比沒有修飾的PEI載體基因轉染率提高1-2個數量級[Klaus Kunath，Thomas Merdanl，Oliver Hegener，Hanns H aberlein，Thomas Kissel，Integrin targeting using RGD-PEI conjugates for in vitro genetransfer，J Gene Med 2003；5588-599]。又如用RGD肽修飾的脂質體在人的支氣管上皮細胞株(16HBE)的基因表達率提高10-200倍[Scott ES，Wiseman JW，Evans MJ，Colledge WH.Enhanced gene delivery to human airway epithelial cellsusing an integrin-targeting lipoplex.J Gene Med 2001 Mar-Apr；3(2)125-34]。還有研究發現，PEG化的脂質-魚精蛋白-DNA複合物(LPD-PEG)使得LPD的基因轉染率下降，估計是由於PEG鏈阻礙了粒子與細胞表面的接觸所致，但當用RGD-4C肽(CDCRGDCFCG)修飾LPD-PEG後，對表達整合素受體的腫瘤細胞的結合率上調了5-15倍，轉染率在MDA-MB-231細胞提高100倍，而對於整合素αvβ3和αvβ5均低表達的Huh7細胞株則未見轉染增強。而且轉染增強可被游離的RGD肽阻斷[Harvie P，Dutzar B，Galbraith T，Cudmore S，O′Mahony D，Anklesaria P，Paul R.Targeting of lipid-protamine-DNA(LPD)lipopolyplexes using RGD motifs.J Liposome Res.2003Nov；13(3-4)231-47]。腫瘤鼠在體實驗也表明合成肽CDCRGDCFC可抑制由整合素alpha v beta 5和alpha v beta3介導的細胞黏附，抑制效果較其只有一條硫化物骨架結構的類似肽至少強20倍，較完全線性的RGD肽抑制效果強近200倍，該合成肽有靶向腫瘤新生血管及腫瘤的作用[Koivunen E，Wang B，Ruoslahti E Phage libraries displaying cyclic peptides with different ring sizesligand specificities of the RGD-directed integrins.Biotechnology(N Y).1995Mar；13(3)265-70]。
在眾多血管新生因子中，血管內皮生長因子(VEGF)在腫瘤血管新生中起了至關重要的作用[Napoleone Ferrara.Vascular endothelial growth facor.Trends Cardiovasc Med 1993；3244-50]，VEGF主要由腫瘤細胞表達，與血管新生和腫瘤轉移有關[Erika Hatva，Arta Kaipainen，Panu Mentula et al.Expression of endothelial cell specific receptor tyrosine kinases and growthfactors in human brain tumors，American Journal of Pathology.1995；146(2)368-78]，有研究表明，在許多實體瘤中，伴隨腫瘤細胞VEGF表達的上調，腫瘤血管內皮細胞中VEGF受體的表達也相應上調[Kunio Suzuki，NorioHayashi，Yasuhide Miyamoto et al.Expression of vascular permeabilityfactor/vascular endothelial growth factor in human hepatocellular carcinoma，Cancer Res 1996；563004-9]，VEGF受體在某些擴散了的癌細胞中有表達[Christine A Boocock，D Stepjen Charnock-Jones，Andrew M Sharkey et al.Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors flt and KDR inovarian carcinoma.J Nat Cancer Inst 1995；87506-16.]。而在正常組織中，血管生成處於靜止狀態，VEGF受體不表達或極低水平表達[Adrian L Harris，Huatang zhang，Amir Moghaddam et al.Breast cancer angiogenesis-newapproaches to therapy via antigiogenesis，hypoxic activated drugs and vasculartargeting，Breast Cancer Reasearch and Treament.1996；3897-108.]，因此人們可以將VEGF受體作為腫瘤靶點，將治療基因靶向性傳遞到腫瘤血管內皮細胞或某些表達VEGF受體的腫瘤細胞，而不影響正常細胞的生長。由上海腫瘤所國家癌基因及相關基因研究室的研究人員李運民等人按照公認的VEGF-VEGF受體的結合域，加之計算機同源模建設計併合成了兩條寡肽GV1和GV2。
GV1(CHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSPVPLMRP)GV2(PVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCE)希望可以將基因靶向傳遞到腫瘤血管內皮細胞。實驗中將GV1或GV2與吞噬泡釋放劑HA20連接到多聚賴氨酸或魚精蛋白這些可以通過靜電吸附作用結合DNA的陽離子骨架上，用pSV2-galactosidase(半乳糖苷酶)作為報告基因，體外試驗證實外源報告基因轉染到牛主動脈弓來源的內皮細胞(ABAE)和人惡性黑色素瘤細胞(A375)後有表達，體內試驗顯示，外源基因在腫瘤血管內皮細胞以及皮下移植腫瘤細胞的裸鼠的腫瘤細胞有表達，移植物包括人結腸癌細胞(LOVO)、人惡性黑色素瘤細胞(A375)和人肝癌細胞。說明靶向VEGF受體的配體短肽GV1、GV2成功地將外源基因複合物靶向傳遞到腫瘤血管內皮細胞和多種實體瘤細胞並表達。
NG2是可調節的跨膜硫酸軟骨素糖蛋白，是鼠人同源的黑色素瘤糖蛋白，也稱為高分子量黑色素瘤相關抗原。人類黑色素瘤糖蛋白HMP(humanmelanoma proteoglycan)與之同源。NG2廣泛地表達在新生血管的周皮細胞，屬於血管基質部分，包括正常發育組織中的新生血管，修復中的粗糙傷口和腫瘤基質中新生血管基質，靜止的血管則沒有發現。在成年動物，NG2僅局限性地表達在腫瘤細胞和新生腫瘤血管基質部位，而且NG2/HMP廣泛的表達在多種不同腫瘤，包括膠質胚細胞瘤、軟骨肉瘤、黑色素瘤和某些白血病的細胞上。Michael A等人於1999年通過噬菌體展示技術找到兩個有靶向NG2作用的短肽分子，TAASGVRSMH(TAA)和LTLRWVGLMS(LTL)，兩肽均能靶向異種移植黑色素瘤小鼠NG2陽性的腫瘤血管基質部位[Michael A.Burg，Renata Pasqualini，Wadih Arap，Erkki Ruoslahti，and William B.Stallcup，NG2 Proteoglycan-binding Peptides Target Tumor Neovasculature，CANCERRESEARCH 59，2869-2874，June 15，1999]。目前人們認為周皮細胞是通過調節內皮細胞的增生、微血管發生以及穩定毛細血管壁來影響血管發生的。我們認為NG2既表達在多種腫瘤細胞又表達在腫瘤血管周皮細胞，而且只有在腫瘤新生血管內皮細胞間隙變大時，周皮細胞才得以暴露，因此NG2的配體短肽可同時靶向腫瘤細胞和腫瘤新生血管基質，且靶向性較靶向新生血管內皮的配體來說更為特異。
EGFR是具有內源洛氨酸激酶活性的受體超家族的成員之一，它廣泛的分布在許多細胞類型，包括表皮和間葉來源的細胞，在某些腫瘤細胞過表達。EGFR的激活可增加細胞增殖能力，和運動能力。HA20(GLFEAIAEFIEGGWEGLEG)是一段與流感病毒衣殼蛋白血凝素區N-端同源的兩性肽，被合成作為吞噬泡釋放寡肽endosome-releasing oligopeptide(EROP)，它對靶向和穿膜過程沒有意義，其作用在於對通過形成吞噬小體進入細胞的外源物質進行及時地釋放，避免被逐漸形成的溶酶體所降解，起到保護外源基因的作用[Masayuki Murata，Satoshi Kagiwada，Sho Takahashi et al.Membrane Fusion induced by mutual interaction of the two charge-reversedamphiphilic peptides at neutral pH.J Biol Chem 1991；266(22)14353-8.]。劉翔等人通過計算機軟體設計了靶向到EGFR的EGF結合域短肽GE7(NPVVGYIGERPQYRDL)，通過化學方法用兩肽GE7和HA20分別修飾多聚賴氨酸，然後將修飾過的多聚賴氨酸作為骨架與一定量的DNA混合，通過靜電吸附作用形成複合物GE7-PLL/DNA/HA20-PLL，DNA為質粒p21WAF-1/pGM-CSF，建立鼠的肝細胞瘤移植模型，複合物於瘤周注射給藥每周一次，持續一個月，實驗證實三部分聯合比兩部分效果好[Xiang Liu，Jianren Gu，Enhanced antitumor effect of EGF R-targeted p21WAF-1 andGM-CSF gene transfer in the established murine hepatoma by peritumoralinjection，Cancer Gene Therapy(2002)9，100-108]。
穿膜肽(cell-penetrating peptides)是近年來研究發現的一些富含鹼性胺基酸殘基並參與核轉運及細胞粘附的短肽，可以通過一種無耗能、無受體介導的方式穿過真核細胞的質膜。有十多種來源於Tat的短肽顯示出可穿過不同細胞質膜的功能，並且內在化過程僅在數分鐘內完成，溫度降低至4℃時，該過程無明顯變化[王莉，穿膜肽研究展望，免疫學雜誌，第17卷，第3期2001年6月]。以下是幾種已經證實了的穿膜肽序列Tat fragment(48-60)GRKKRRQRRRPPQTat fragment(49-57)RKKRRQRRR(Tat肽中具穿膜效應的最短片斷)Signal-sequence-basedpeptides IGALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKVSignal-sequence-based peptides IIAAVALLPAVLLALLAP來源於魚精蛋白的魚精蛋白簡短型，是一段含有28個胺基酸的小肽，它富含正電荷，可與質粒DNA高親和力結合[Li S，et al Characterization ofcationic lipid-protamine-DNA(LPD)complexes for intravenous gene deliveryGene Ther. 1998；5(7)930-7.]，因此可作為基因的載體骨架成分。糖基化磷脂醯肌醇(GPI)，是對蛋白質進行翻譯後修飾的一種脂性結構，蛋白質可通過GPI結構錨定於細胞膜表面，而不跨越其磷脂膜雙層結構[Cimino AM，et alCancer vaccine developmentprotein transfer of membrane-anchored cytokinesand immunostimulatory molecules.Immunol Res.2004；29(1-3)231-40]。我們設想將腫瘤靶向複合靶向分子的基因與魚精蛋白簡短型的基因融合，然後通過GPI結構將融合基因錨錠表達在細胞膜上，破碎細胞，分離得到細胞膜，由於細胞膜本身含有豐富的磷脂和膽固醇等脂性材料，在一定的緩衝條件下能夠自組裝形成脂質顆粒[Westerman LE，Jensen PE.Liposomes composed ofreconstituted membranes for induction of tumor-specific immunity.MethodsEnzymol.2003；373118-27]，因此該細胞膜來源的脂質顆粒同時具有腫瘤細胞內靶向性、與質粒DNA靜電吸附性以及脂質自身重組性，是一種具有腫瘤靶向性的非病毒基因細胞內傳遞載體。

發明內容
本發明的目的是設計併合成一種新型的具有腫瘤靶向性的非病毒基因載體，在腫瘤靶向性方面，本發明提出將多個具有腫瘤局部靶向性的短肽序列，以及穿膜肽和吞噬泡釋放劑的基因序列融合到一起，形成一個複合靶向分子，通過計算機輔助設計各短肽柔性連接臂，使複合靶向融合肽中各短肽構象不變，從而保證了複合靶向分子中各短肽的功能。希望在增加腫瘤靶向的適用範圍的同時，通過增加外源基因向靶細胞內傳遞，避免其降解，提高外源基因向腫瘤局部細胞內傳遞的效果。
本發明所說的多個具有腫瘤局部靶向性的短肽序列，包括所有靶向到腫瘤內皮和腫瘤細胞表面某些整合素的含RGD的配體短肽、靶向到腫瘤細胞和新生血管內皮細胞VEGF受體的配體短肽、靶向到新生血管的周皮細胞表面NG2的短肽和靶向到多種腫瘤細胞EGF受體的配體短肽。
本發明所說的穿膜肽包括具有穿膜作用的所有適合本系統的短肽序列。
本發明所說的吞噬泡釋放劑包括具有吞噬泡釋放作用的所有適合本系統的短肽序列。
本發明將上述複合靶向分子的基因與魚精蛋白簡短型的基因融合，然後通過GPI結構將融合基因錨錠表達在真核細胞膜上，通過一定工藝獲取細胞膜，在一定條件下該膜自行組裝成脂質顆粒。該細胞膜來源的脂質顆粒同時具有腫瘤細胞內靶向性、與質粒DNA靜電吸附性以及脂質自身重組性，是一種具有腫瘤靶向性的非病毒基因細胞內傳遞載體。
本發明所說的魚精蛋白簡短型基因包括所有由魚精蛋白分子衍生出來的帶正電性可以與核酸靜電結合的短肽序列。
本發明所說的一定工藝分離提取細胞膜包括所有適用的實驗室分離提取細胞膜的方法。
本發明作為基因傳遞的載體將靶向性、正電性和脂質形式巧妙融為一體，擁有良好的基因傳遞載體的功能。其中靶向性又集靶向腫瘤新生血管和多種腫瘤細胞於一身，同時通過穿膜肽、吞噬泡釋放劑使該載體具有增加外源基因向腫瘤細胞內轉運，避免外源基因在溶酶體中被降解的作用。同時，本發明在工藝上巧妙避開了常規生物技術藥物所不可避免的蛋白質純化等複雜昂貴的工藝，有利於進行產業化開發和應用。


圖1為單獨L1的立體結構圖2為單獨L2的立體結構圖3為單獨L3的立體結構圖4為單獨L4的立體結構圖5為單獨P的立體結構圖6為單獨R的立體結構圖7為模擬融合分子的立體結構圖8為P6的合成鑑定1.P1 2.P2 3.P3 4.P45.P5 6.P6 7.DL2000圖9為pCI-P6-pr+-GPI雙酶切鑑定1.DL2000 2.pCI-P6-pr+-GPI雙酶切 3.pCI-P6-pr+-GPI具體實施方式
本發明提出的腫瘤靶向性基因傳遞非病毒載體的構建與製備實施方式如下首先，通過計算機輔助設計柔性短肽連接臂，將多個具有腫瘤局部靶向性的短肽序列，以及穿膜肽和吞噬泡釋放劑的基因序列融合到一起，形成一個複合靶向分子，並保證各個短肽在複合靶向融合肽中的構象與其天然構象一致。
然後，將上述複合靶向分子的基因與魚精蛋白簡短型的基因融合，利用錨錠蛋白GPI將融合基因錨錠表達在真核細胞膜上，通過一定工藝獲取細胞膜，在一定條件下該膜自行組裝成脂質顆粒。
本發明更詳細的實施方法可參見實施例，本實施例是用於解釋、而不是以任何方式限制本發明。
實施例一、計算機輔助設計各配體短肽連接臂通過計算機輔助設計短肽連接臂，使各配體短肽的構象在融合肽中保持不變，從而保證其功能。
複合靶向分子P65』-XhoI-靶向整合素的配體短肽基因(L1)-靶向VEGF受體的配體短肽基因(L2)-靶向NG2的配體短肽基因(L3)-靶向EGF受體的配體短肽基因(L4)-穿膜肽Tat(48-60)的基因(P)-吞噬泡釋放劑(HA20)的基因(R)-EcoRV-3』L1CDCRGDCFCL2PVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCEL3TAASGVRSMHL4NPVVGYIGERPQYRDLPGRKKRRQRRRPPQRGLFEAIAEFIEGGWEGLEGL1---GGGGS---L2---GGGSAAA---L3---GSPT---L4---GGGSA---P---GGGSGA---R從圖7可以看出通過計算機輔助設計出來的這五條連接臂，可以達到使六條短肽保持其原有構象的目的。融合分子的空間構象舒展，六條短肽的立體結構得到充分展現。
實施例2全合成複合靶向分子P62.1用哺乳動物偏愛密碼子將多肽序列翻譯成基因序列Code and PeptideC D C R G D C F C G G G G S P V P T E E STGC GAC TGT CGC GGC GAC TGT TTC TGC GGC GGA GGC GGG AGC CCT GTG CCC ACC GAG GAA TCC
N I T M Q I M R I K P H Q G Q H I G E M SAAC ATC ACC ATG CAG ATC ATG AGG ATC AAG CCC CAC CAG GGC CAG CAC ATT GGC GAG ATG AGCF L Q H N K C E G G G S A A A T A A S G VTTC CTG CAG CAC AAC AAG TGC GAG GGC GGG GGA TCC GCT GCC GCA ACA GCC GCT AGC GGC GTGR S M H G S P T N P V V G Y I G E R P Q YCGC TCC ATG CAC GGC AGC CCA ACA AAC CCC GTC GTG GGC TAC ATC GGC GAG CGG CCC CAG TACR D L G G G S A G R K K R R Q R R R P P QAGG GAC CTG GGG GGC GGA TCC GCT GGC CGC AAG AAA CGC AGG CAG AGG CGG CGC CCA CCT CAGG G G S G A G L F E A I A E F I E G G W EGGA GGC GGC AGC GGC GCT GGC CTG TTC GAG GCC ATC GCC GAG TTC ATT GAG GGA GGG TGG GAGG L E GGGC CTG GAG GGCP6的基因序列TGC GAC TGT CGC GGC GAC TGT TTC TGC GGC GGA GGC GGG AGC CCT GTG CCCACC GAG GAA TCC AAC ATC ACC ATG CAG ATC ATG AGG ATC AAG CCC CAC CAGGGC CAG CAC ATT GGC GAG ATG AGC TTC CTG CAG CAC AAC AAG TGC GAG GGCGGG GGA TCC GCT GCC GCA ACA GCC GCT AGC GGC GTG CGC TCC ATG CAC GGCAGC CCA ACA AAC CCC GTC GTG GGC TAC ATC GGC GAG CGG CCC CAG TAC AGGGAC CTG GGG GGC GGA TCC GCT GGC CGC AAG AAA CGC AGG CAG AGG CGGCGC CCA CCT CAG GGA GGC GGC AGC GGC GCT GGC CTG TTC GAG GCC ATC GCCGAG TTC ATT GAG GGA GGG TGG GAG GGC CTG GAG GGC2.2用中心模辦法設計12條引物，請博亞公司合成。
(1)GGAGGTTCTGCTGCCGCAACAGCAGCTTCTGGAGTCAGGAGTATGCACG(2)CCAATATATCCGACAACGGGGTTGGTAGGGCTCCCGTGCATACTCCTGA(3)GATGTCATTCCTGCAGCACAACAAGTGCGAGGGAGGAGGTTCTGCTGCC(4)TCCGCCACCGAGGTCCCTGTACTGCGGCCTCTCTCCAATATATCCGACA(5)GCATCAAGCCCCATCAAGGACAGCACATTGGCGAGATGTCATTCCTGCA(6)GTCTCCTTTGCCTTCTTTTCTTACGCCCGGCAGATCCGCCACCGAGGTC(7)ACCGAAGAGTCAAACATCACCATGCAGATCATGCGCATCAAGCCCCATC(8)AGTCCAGCACCACTACCTCCGCCTTGAGGTGGTCGTCTCCTTTGCCTTC(9)TTGCTTCTGTGGTGGCGGTGGGTCTCCAGTGCCTACCGAAGAGTCAAAC(10)GCCTCCCTCAATAAACTCGGCAATGGCTTCGAACAGTCCAGCACCACTA(11)GCCTCGAGTGCGACTGTAGAGGAGATTGCTTCTGTGGTGG(12)GCGATATCGCCCTCCAACCCTTCCCAGCCTCCCTCAATAA
2.3通過六輪重疊延伸PCR獲得P6基因，克隆到pMD 18-T載體測序正確。
2.3.1合成P6基因在GeneAmp PCR System 2400型PCR以上進行如下反應第一輪PCR合成P1反應體系50μl10×PCR buffer(without MgCL2)5μl，MgCL2(25mmol/L)5μl，dNTPs(10mmol/L)4μl，引物(1)(20μmol/L)1μl，引物(2)(20μmol/L)1μl，Taq DNA Polymerase(2.5U/μl)1μl，滅菌蒸餾水33μl(Taq DNA聚合酶、Buffer、dNTPs均購自於Tacara生物技術有限公司)。
反應條件95℃1分鐘(95℃1分鐘，56℃1分鐘，72℃30秒)循環5次，72℃5分鐘，4℃∞第二輪PCR合成P2反應體系50μl10×PCR buffer(without MgCL2)5μl，MgCL2(25mmol/L)5μl，dNTPs(10mmol/L)4μl，引物(3)(20μmol/L)1μl，引物(4)(20μmol/L)1μl，Taq DNA Polymerase(2.5U/μl)1μl，模板(P1稀釋10倍)1μl，滅菌蒸餾水32μl反應條件95℃1分鐘(95℃1分鐘，56℃1分鐘，72℃1分鐘)循環32次，72℃10分鐘，4℃∞第三輪至第六輪PCR反應分別合成P3、P4、P5、P6反應體系除了引物分別改用(5，6)(7，8)(9，10)(11，12)以外，其他與第二輪相同。
反應條件與第二輪相同。
產物鑑定

見圖82.3.2純化P6取5μl P6跑1.2％瓊脂糖凝膠電泳作分子量鑑定，之後將全部剩餘P6跑1.2％瓊脂糖凝膠製備電泳，切膠，用博大泰克公司的PCR產物膠回收試劑盒，回收P6。步驟紫外燈下切下P6亮帶，放入1.5ml離心管，加入溶膠液700μl/100μg膠，12000rpm離心30s，重複離心一次，加入500μl washing buffer，12000rpm離心30s，重複空離心一次，加入35μl滅菌蒸餾水，37℃放置5分鐘，12000rpm離心，既得純化後的P6溶液。
2.3.3插入連接pMD 18-T載體取滅菌PCR管加入Ligation Solution I 5μl，滅菌雙蒸水3μl，純化後的P61μl，pMD 18-T載體1μl，放16℃過夜。
2.3.4轉化無菌取100μl感受態細胞(DH5α菌株按《分子克隆》—科學出版社，第二版的CaCl2方法製備)，至於冰浴中，加入連接產物10μl，輕輕旋轉以混勻內容物，在冰浴中放置30分鐘，立即轉移到42℃水浴中靜置2分鐘，然後每管加入0.5ml不加抗生素的LB培養基，37℃水浴15分鐘後，37℃搖床輕搖45分鐘；取200μl轉化菌體，均勻塗布於含有100mg/ml氨苄的瓊脂平板培養基上，在超淨工作檯吹乾約10分鐘，37℃倒置培養過夜。從平板中挑取菌落約10個，分別接種於含100mg/ml氨苄LB培養基中(5ml/管)，37℃搖床培養過夜。
2.3.5菌落PCR初步鑑定P6取0.5μl過夜培養菌10倍稀釋液用PCR法進行初步鑑定，引物選用P6兩端序列1.1和1.2。用PCR儀進行PCR擴增，擴增體系為10×PCR Buffer(without MgCL2)2.5μl，MgCL2(25mmol/L)2.5μl，1.1、1.2(均為20μmol/L)各0.5μl，dNTPs(2.5mM)2μl，Taq DNA聚合酶(2.5U/μl)0.5μl，加水至25μl。(Taq DNA聚合酶、Buffer、dNTPs均購自於Tacara生物技術有限公司)。擴增條件95℃1分鐘(95℃1分鐘，56℃1分鐘，72℃1分鐘)循環30次，72℃10分鐘，4℃∞2.3.6挑兩個菌測序挑取2號和6號菌去三博公司測序，結果兩者均含有正確的複合靶向分子的基因。
2.3.7用鹼變性法提取測序正確的質粒pMD 18-T-P6按照博大泰克公司質粒快速提取試劑盒的說明操作(1)收集菌液於1.5ml滅菌Eppendorf管中，12000rpm離心，去掉上清；(2)加入150μl溶液I，振蕩至徹底懸浮；(3)加入150μl溶液II，立即輕柔顛倒數次，使菌體裂解，室溫放置1-2分鐘；(4)加入300μl溶液III，立即輕柔顛倒數次，室溫放置5分鐘，12000rpm離心12分鐘；(5)向離心吸附柱中預先加入400μl結合緩衝液，然後加入上步離心的上清，混勻，12000rpm離心30秒，廢液棄去；(6)加入750μl離心漂洗液於離心吸附柱中，12000rpm離心30秒，廢液棄去；(7)重複一次第6步，然後空離心2分鐘，徹底去除漂洗液；(8)小心取出離心吸附柱，將其放入備好的1.5ml滅菌Eppendorf管中，加入35μl滅菌蒸餾水，37℃放置2-5分鐘，12000rpm離心30秒，取掉吸附柱，獲取的質粒溶液於-20℃保存。
實施例3構建腫瘤靶向性真核細胞錨錠表達載體pCI-P6-pr+-GPI我室在pCI-neo真核表達載體基礎上構建了pCI-pr+-GPI通用載體，是在真核表達質粒pCI-neo原多克隆位點NheI和XhoI之間插入信號肽(sig)序列，在EcoRV和EcoRI之間插入5』-GGGSSGGG-魚精蛋白簡短型-3』的基因序列，在EcoRI和XbaI之間插入5』-IgGFc-GPI-3』錨錠蛋白及相關基因序列。因此，只要在XhoI和EcoRV之間插入複合靶向分子P6的基因序列，就可以獲得腫瘤靶向性真核細胞錨錠表達載體pCI-P6-pr+-GPI。
雙酶切上述用鹼變性法提取的質粒pMD 18-T-P6和我室構建的pCI-pr+-GPI通用載體質粒，分別用XhoI和EcoRV雙酶切。酶切體系5μl的10×NEBbuffer3，10u/μl的XhoI 2μl，10u/μl的EcoRV 2μl，100×BSA0.5μl，質粒30μl，加水至總體積50μl，37℃水浴8小時。酶切後產物割膠回收目的片段，具體方法同上參見2.3.2醇化P6一項。
插入連接取滅菌PCR管加入雙酶切純化後的質粒pCI-pr+-GPI片段和P6基因片段各1μl，10×T4DNA連接緩衝液1μl，T4DNA連接酶(12u/μl)1μl，加滅菌雙蒸水至10μl，16℃過夜。
轉化具體步驟同上參見2.3.4轉化鑑定具體步驟同上參見2.3.5菌落PCR，和2.3.6雙酶切鑑定用上述鹼變性法提取的質粒pCI-P6-pr+-GPI，用XhoI和EcoRV雙酶切。酶切體系2μl的10×NEBbuffer3，20u/μI的XhoI 1μl，20u/μl的EcoRV 1μl，10×BSA 2μI，質粒14μl，總體積20μl，37℃水浴6小時。產物取15μl進行瓊脂糖凝膠電泳鑑定，結果見圖9所示。
基因測序鑑定基因測序證明有正確的P6基因插入pCI-pr+-GPI通用載體中，至此，獲得了正確的pCI-P6-pr+-GPI。用promega公司的質粒提取試劑盒WizardPureFection Plasmid DNA Purification System提取轉染級質粒pCI-P6-pr+-GPI。
實施例4獲得穩定表達靶向複合分子的腫瘤細胞株
Renca細胞為Balb/c小鼠來源的腎癌細胞系。用上述載體pCI-P6-pr+-GPI轉染腫瘤細胞，篩選獲得穩定表達靶向複合分子的腫瘤細胞株。Renca細胞轉染前傳代，接種於六孔板上，使次日細胞能鋪滿孔底面地80％，轉染步驟按Invitrogen公司的Lipofectamine2000Reagent說明書進行。分別取1μg質粒，用無雙抗DMEM培養基稀釋到250μl，為A液；另取7μl Lipofectamine2000用無雙抗DMEM培養基稀釋到250μl，為B液，將B液室溫放置5分鐘後，立即將A液B液輕輕混勻，為C液，室溫放置20分鐘。取出六孔板用新鮮培養基洗一次後，每孔加入2.5ml新鮮培養基。將C液分別加入到各孔中，混勻，置CO2培養箱培養。轉染48小時後，至細胞密度達到50-70％融合時，棄培養液，換用含有G-418(400μg/ml)培養基進行抗性篩選，同時用未轉染的細胞作對照。當對照細胞幾乎全部死亡時，G-418的濃度降至200μg/ml以維持篩選作用。待2wk左右出現陽性細胞克隆時，擴大培養進行後續實驗。
收集pCI-P6-pr+-GPI和空載體pCI-neo轉染的Renca細胞，用4oC預冷的PBS(含20ml/L小牛血清)洗滌3次，加入螢光標記的鼠抗人IgG(1∶1000稀釋)，於冰浴中震蕩孵育45min，再用PBS洗3次。加5g/L多聚甲醛固定後，於螢光顯微鏡下觀察並照相，結果證明轉染成功P6-pr+p被GPI很好地展示在宿主細胞膜上。
實施例5細胞膜成分的提取和複合膜脂顆粒的形成收集複合靶向分子修飾的Renca細胞共108個，用含有蛋白酶抑制劑的低滲buffer(25mmol/L Tris-HCl.PH7.4)裂解細胞，用27號針頭(4.5號)抽吸3次以上，混勻2,300rpm(2,000g)離心10min，取上清(含有膜成分)。25,400rpm(22,000g)離心30min，取沉澱。
用溶液I(0.15mol/LNaCl，10mmol/L Tris，pH8.0)洗兩次，用溶液II(0.14mol/L NaCl，25mmol/L Tris-HCl，pH7.4，其中含有2％1-S-OctylBeta-D-thioglucopyranoside)溶解，達到濃度相當108個/mL，4℃震蕩30min。離心取上清，用透析液(0.14mol/L NaCl，25mmol/L Tris-HCl，pH7.4)透吸過夜，更換三次透析液，收集形成的膜脂顆粒，即為腫瘤靶向性基因傳遞非病毒載體，可以通過複合物中的陽離子肽結合核酸成分，進行腫瘤靶向基因治療生物技術藥物的研發。
權利要求
1.一種用於腫瘤靶向性基因傳遞的非病毒載體，其特徵在於由腫瘤靶向複合體和細胞膜嵌和膜脂共同形成的膜脂顆粒，可作為腫瘤靶向基因治療的載體。
2.按照權利要求1腫瘤靶向複合體是指將腫瘤靶向性短肽、穿膜肽、吞噬泡釋放劑、陽離子蛋白依次連接得到的複合物，通過GPI結構嵌和到細胞膜上。
3.按照權利要求2依次連接靶向性短肽、穿膜肽、吞噬泡釋放劑、陽離子蛋白得到的複合物是通過計算機輔助設計每一個連接臂，使得每一成分在複合物中的空間立體構象和本身構象一致，從而保證其功能。
4.按照權利要求2在腫瘤靶向複合體中起靶向到腫瘤局部和腫瘤細胞作用的短肽包括靶向到某些整合素的含RGD的配體短肽、靶向到腫瘤細胞和新生血管內皮細胞VEGF受體的配體短肽、靶向到新生血管的周皮細胞表面NG2的短肽和靶向到多種腫瘤細胞EGF受體的配體短肽。
5.按照權利要求2在腫瘤靶向複合體中起穿膜肽作用的包括多種具有無需耗能無需受體分子介導就可將多肽、蛋白質分子、DNA片斷導入多種哺乳動物細胞功能的多肽。
6.按照權利要求2在腫瘤靶向複合體中起吞噬泡釋放劑作用的包括多種具有將進入細胞吞噬小體的DNA片斷釋放出來，進入細胞漿，避免溶酶體的降解作用的多肽。
7.按照權利要求2在腫瘤靶向複合體中的陽離子蛋白包括多種帶有正電，可以通過靜電作用結合質粒的陽離子多肽。
8.按照權利要求1腫瘤靶向性基因傳遞非病毒載體的製備方法，其特徵在於1)通過計算機輔助設計，依次連接靶向性短肽、穿膜肽、吞噬泡釋放劑、陽離子蛋白，獲得腫瘤靶向複合體P6，並將蛋白分子序列轉換為基因序列。2)通過全基因合成的方法，獲得完整的腫瘤靶向複合體基因。3)將腫瘤靶向複合體基因插入到pCI-pr+-GPI載體中，構建錨定真核表達載體pCI-P6-pr+-GPI。4)轉染相應的腫瘤細胞株，並鑑定腫瘤靶向複合體分子的細胞膜表面的錨定表達情況。5)收穫上述細胞，將細胞膜裂解，在一定的緩衝條件下通過脂質的重組性自組裝形成膜脂顆粒。該膜脂顆粒同時具有腫瘤靶向性與核酸結合性，是新型的腫瘤靶向性非病毒基因傳遞載體。
全文摘要
本發明屬於分子生物學腫瘤基因治療用載體領域，涉及一種供外源基因靶向性導入腫瘤局部的非病毒載體的構建與製備，該載體的特徵在於同時具有多種腫瘤局部靶向性、核酸結合性和脂質自發重組性。通過構建真核細胞錨定表達載體，將靶向肽、陽離子肽等多種成分錨定表達在腫瘤細胞表面，裂解並提取細胞膜，獲得具有核酸結合性和脂質自發重組性的非病毒基因靶向傳遞載體。本發明的特點在於，該載體除了具有通過腫瘤新生血管和多種腫瘤細胞靶向性配體將外源基因靶向到腫瘤局部組織的作用，同時通過穿膜肽、吞噬泡釋放劑使該載體具有增加外源基因向腫瘤細胞內轉運和避免降解的作用。
文檔編號A61P35/00GK1927402SQ200510095888
公開日2007年3月14日 申請日期2005年9月7日 優先權日2005年9月7日
發明者於繼雲, 黃悅, 劉荷中, 閻瑾琦, 修冰水, 陳興, 宋曉國, 劉穎 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所