提高出芽短梗黴靜息細胞生物合成普魯蘭多糖產量的方法

2023-11-02 06:16:52 4

提高出芽短梗黴靜息細胞生物合成普魯蘭多糖產量的方法
【專利摘要】本發明涉及一種普魯蘭多糖的製備方法，具體公開了一種提高出芽短梗黴靜息細胞生物合成普魯蘭多糖產量的方法，包括利用出芽短梗黴靜息細胞生物轉化合成普魯蘭多糖，在所述利用出芽短梗黴靜息細胞生物轉化合成普魯蘭多糖的轉化液中添加斯潘類非離子型表面活性劑，斯潘類非離子型表面活性劑在轉化液中的濃度為1～30g/L。本發明通過向轉化液中添加斯潘類非離子型表面活性劑，促進了胞內合成的多糖向胞外分泌，縮短了轉化時間，提高了普魯蘭生產效率。
【專利說明】提高出芽短梗黴靜息細胞生物合成普魯蘭多糖產量的方法

【技術領域】
[0001]本發明屬於微生物轉化領域，涉及一種普魯蘭多糖的製備方法，具體涉及一種提高出芽短梗黴靜息細胞生物合成普魯蘭多糖產量的方法。

【背景技術】
[0002]普魯蘭多糖(pullulan)是由出芽短梗黴(Aureobasidium pullulans)生產的一種粘性胞外多糖，它是由葡萄糖分子按α-1，4_糖苷鍵結合成麥芽三糖，兩端再以α-1，6-糖苷鍵同另外的麥芽三糖結合，如此反覆連接而形成高分子量的中性線性多糖。此多糖無色、無味、無毒、無臭，含有豐富的羥基，是非離子性、非還原性多糖，極易溶於水並呈中性，不溶於醇類、油脂、丙酮、醚和氯仿等有機溶劑。普魯蘭多糖分子內獨特的連結方式賦予了它獨特的理化性質，例如:膠粘性、成膜性、成纖性、可塑性及阻氣性等，因而被廣泛應用於食品、醫藥、化工等各個領域。如:(1)用於食品保鮮；(2)作為低熱量食品和保健食品的添加劑；(3)作為食品品質改良劑和增稠劑；(4)用於製備膠囊、微膠囊、藥物包裝袋等藥物包裝材料和藥物緩釋製劑；(5)作為血漿增量劑；(6)用於製備疫苗；(7)用於汙水處理；
(8)用於環保型包裝材料；(9)用做保護膜、粘合劑和凝固劑。
[0003]普魯蘭是一種證明有多種實際用途的獨特多糖，最早的許多普魯蘭專利涉及大量的工業化應用，例如作為一種絮凝劑用在造紙和塗料的生產中。同樣地，普魯蘭已經被認為是生物降解材料的取代物，可取代尼龍、人造絲、聚苯乙烯和聚乙烯醇等。然而，普魯蘭昂貴的價格限制了它的許多潛在應用，包括那些作為可生物降解的聚合物取代石油衍生聚合物。儘管普魯蘭能用相對便宜的原料來發酵生產，但它目前的價格仍然是右旋糖苷和黃原膠價格的近三倍。特別是涉及到人類健康的產品。在很大程度上普魯蘭的生產規模決定了生產成本。目前，關於研宄普魯蘭多糖的生產方法很局限，一般都是採用微生物發酵法，包括搖瓶發酵，發酵罐發酵，生物膜反應器發酵，並通過優化營養環境條件及發酵工藝學手段來提高普魯蘭的產量。普魯蘭生產水平許多年來一直相當穩定，而在食品上的應用是其主要的市場。普魯蘭的另一個新的市場是膳食增補劑和藥品的膠囊產品。日益增長的需求證明擴大普魯蘭生產是正確的，並會催生這種獨特的生物聚合物的新的市場前景。
[0004]然而靜息細胞轉化法也是一種合成普魯蘭的方法，它是將微生物培養至一定階段後分離出菌絲體，將其重新懸浮於緩衝液或不完全培養基(缺少某種營養物質如氮源等)中，使其處於不再生長但仍保持原有各種酶活的狀態，然後添加底物，在適當溫度、PH和振蕩條件下進行轉化的方法。此法不僅能提高轉化效率，還可有效地控制轉化液的組成，以適應底物轉化的最佳條件；同時減少了培養基成分對轉化過程的影響，便於後期轉化產物的分離與提純。此法已廣泛應用於天然化合物的生物合成、藥物前體化合物的轉化、生物催化的有機化合物不對稱合成、活性成分篩選及新藥開發、藥物代謝研宄等諸多領域，但在普魯蘭生產中還未見報導。
[0005]普魯蘭多糖是在細胞內合成的，然後通過載體脂蛋白作用穿過細胞壁而分泌到細胞外。表面活性劑能夠改變細胞膜的通透性，利於多糖向胞外分泌，降低發酵產物在胞內的濃度，減少產物抑制，縮短發酵周期。常天俊在2006年報導，在搖瓶中添加0.05%的吐溫80，吐溫60，吐溫40，結果表明:這幾種表面活性劑均能促進細胞釋放多糖，其中以吐溫80的效果最佳。斯潘是Span的譯音，在國內還有各種譯法，如「斯盤」，「司本」等。但根據GB-13481-92標準，準確的譯法應為「斯潘」，化學名為失水山梨醇脂肪酸酷或山梨糖醉脂肪酸酷。它同吐溫一樣，是良好的非離子型表面活性劑，既溶於水也溶於油，能形成水包油和油包水型兩種乳濁液。廣泛地被作為冰淇淋、麵包、糕點、起酥油製作過程中的乳化劑，也可作為巧克力、速溶可口、牛奶的分散劑及蜜糖、砂糖、酵母等濃縮時作為消泡劑等。因此可以通過添加非離子型斯潘類表而活性劑，通過改變細胞膜的通透性而達到提高普魯蘭產量的目的。
[0006]雖然已有通過添加吐溫系列的非離子型表而活性劑以提高普魯蘭產量的研宄報導，但國內還沒有通過添加斯潘系列的非離子型表面活性劑對普魯蘭產量影響的文獻報導。


【發明內容】

[0007]本發明的目的是提供一種提高出芽短梗黴靜息細胞生物合成普魯蘭多糖產量的方法。
[0008]為達到上述目的，本發明採用的技術方案是:一種提高出芽短梗黴靜息細胞生物合成普魯蘭多糖產量的方法，包括利用出芽短梗黴靜息細胞生物轉化合成普魯蘭多糖，在所述利用出芽短梗黴靜息細胞生物轉化合成普魯蘭多糖的轉化液中添加斯潘類非離子型表面活性劑，斯潘類非離子型表面活性劑在轉化液中的濃度為I?30g/L。斯潘類非離子型表面活性劑為斯潘20或斯潘40或斯潘60或斯潘80。
[0009]現有技術中，出芽短梗黴的培養條件以及利用出芽短梗黴靜息細胞生物轉化合成普魯蘭多糖的轉化條件為:
[0010]⑴菌株
[0011]出芽短梗黴。
[0012]⑵培養基
[0013]斜面培養基(g/L):土豆汁20% (w/v)，葡萄糖20，自然pH ;
[0014]級利子培養基(g/L):葡萄糖20，酵母粉 2.5，(NH4) 2S040.6，NaCl I，K2HP045，MgSO4.7H20 0.2，pH 6.5 ；
[0015]二級種子培養基(g/L):葡萄糖 70，酵母粉 5，(NH4)2SO40.4，NaCl 1，K2HP045，MgSO4.7H20 0.4，pH 6.5 ；
[0016]轉化液(g/L):葡萄糖50，MgSO4.7H20 0.2，自然 pH。
[0017]⑶種子培養
[0018]將保存在-70 0C冰箱中的菌種接入裝有50mL種子培養基的500mL三角瓶中進行振蕩培養，培養溫度30°C，搖床轉速200rpm，培養時間24小時。按10% (v/v)接種量將一級種子接入二級種子培養基，相同條件下培養36小時。
[0019]⑷搖瓶轉化
[0020]將轉化用的空錐形瓶、轉化液以及配好的斯潘母液於121°C，15min高壓滅菌後備用，收集二級種子培養液並於25°C 12000rpm的條件下離心20min，無菌操作將離心後的細胞按一定比例溶於轉化液中，並按一定的比例添加斯潘表而活性劑。裝液量依然是500mL三角瓶中裝50mL轉化液，在搖床中進行靜息細胞轉化培養。培養溫度30°C，搖床轉速200rpm，轉化時間48小時。
[0021](5)生物量的測定
[0022]以細胞乾重(DCW)表示生物量。取20mL轉化液，80°C水浴鍋滅活20min，冷卻至室溫，12000rpm離心20min，蒸餾水離心洗滌細胞沉澱3次，70°C烘乾至恆重。
[0023](6)普魯蘭多糖的測定
[0024]取上述離心後所得的上清液10mL，加入2倍體積無水乙醇4°C沉澱過夜(或12h)，於4°C、12000rpm離心lOmin，棄去上清，留沉澱於70°C烘箱烘乾至恆重。
[0025](7)葡萄糖濃度的測定
[0026]3，5- 二硝基水楊酸法。
[0027]本發明的提高出芽短梗黴靜息細胞生物合成普魯蘭多糖產量的方法，採用本發明特有的方法，利用出芽短梗黴靜息細胞生物轉化合成普魯蘭多糖的轉化液中添加斯潘類非離子型表面活性劑，有效降低了用於細胞生長所需的底物量，從而提高了普魯蘭的得率；山於通過向轉化液中添加斯潘系列非離子型表面活性劑，促進了胞內合成的多糖向胞外分泌，縮短了轉化時間，提高了普魯蘭生產效率，為提高普魯蘭多糖產量增添了新的方法，也為類似多糖的高產提供了新的思路。因此，本發明的提高出芽短梗黴靜息細胞生物合成普魯蘭多糖產量的方法具有突出的實質性特點和顯著的進步。
[0028]上述說明僅是本發明技術方案的概述，為了能夠更清楚了解本發明的技術手段，並可依照說明書的內容予以實施，以下以本發明的較佳實施例詳細說明如後。

【具體實施方式】
[0029]下面結合實施例，對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細描述。以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。
[0030]本發明的一種提高出芽短梗黴靜息細胞生物合成普魯蘭多糖產量的方法，包括利用出芽短梗黴靜息細胞生物轉化合成普魯蘭多糖，其特徵在於:在所述利用出芽短梗黴靜息細胞生物轉化合成普魯蘭多糖的轉化液中添加斯潘類非離子型表面活性劑，斯潘類非離子型表面活性劑在轉化液中的濃度為I?30g/L。
[0031]作為本發明的改進，上述斯潘類非離子型表面活性劑的添加時間為在轉化液被配製出來後的30分鐘之內，添加斯潘類非離子型表面活性劑，斯潘類非離子型表面活性劑為斯潘20或斯潘40或斯潘60或斯潘80。
[0032]作為本發明的進一步改進，上述斯潘20的添加時間為在轉化液被配製出來後，立即添加斯潘20，所述斯潘20在轉化液中的濃度為5g/L。
[0033]作為本發明的進一步改進，上述斯潘40的添加時間為在轉化液被配製出來後，立即添加斯潘40，所述斯潘40在轉化液中的濃度為10g/L。
[0034]作為本發明的進步改進，上述斯潘60的添加時間為在轉化液被配製出來後，立即添加斯潘60，所述斯潘60在轉化液中的濃度為5g/L。
[0035]作為本發明的進一步改進，上述斯潘80的添加時間為在轉化液被配製出來後，立即添加斯潘80，所述斯潘80在轉化液中的濃度為20g/L。
[0036]實施例1
[0037]搖瓶轉化起始時不添加表面活性劑的實驗結果:
[0038]轉化體系中的細胞量:14.4g/L ;普魯蘭產量:15.7g/L ;轉化時間48小時；普魯蘭轉化效率:22.7mg/g/ho
[0039]實施例2
[0040]搖瓶轉化起始時添加斯潘20表面活性劑的實驗結果:
[0041]斯潘20添加濃度:1?30g/L ;轉化體系中的細胞量:11.7g/L ;普魯蘭產量:
14.7?17.lg/L ;轉化時間48小時；普魯蘭轉化效率:26.2?30.4mg/g/h ;斯潘20最佳添加濃度為5g/L。
[0042]實施例3
[0043]搖瓶轉化起始時添加斯潘40表面活性劑的實驗結果:
[0044]斯潘40添加濃度:1?30g/L;轉化體系中的細胞量:14.3g/L ;普魯蘭產量:18.3?22.5g/L ;轉化時間48小時；普魯蘭轉化效率:26.7?32.8mg/g/h ;斯潘40最佳添加濃度為10g/L。
[0045]實施例4
[0046]搖瓶轉化起始時添加斯潘60表面活性劑的實驗結果:
[0047]斯潘60添加濃度:1?30g/L;轉化體系中的細胞量:14.4g/L ;普魯蘭產量:
16.1?18.5g/L ;轉化時間48小時；普魯蘭轉化效率:23.3?26.8mg/g/h ;斯潘60最佳添加濃度為5g/L。
[0048]實施例5
[0049]搖瓶轉化起始時添加斯潘80表面活性劑的實驗結果:
[0050]斯潘80添加濃度:1?30g/L;轉化體系中的細胞量:10.9g/L ;普魯蘭產量:
15.7?21.7g/L ;轉化時間48小時；普魯蘭轉化效率:30.0?41.5mg/g/h ;斯潘80最佳添加濃度為20g/L。
[0051]以上所述僅是本發明的優選實施方式，並不用於限制本發明，應當指出，對於本【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和變型，這些改進和變型也應視為本發明的保護範圍。
【權利要求】
1.一種提高出芽短梗黴靜息細胞生物合成普魯蘭多糖產量的方法，包括利用出芽短梗黴靜息細胞生物轉化合成普魯蘭多糖，其特徵在於:在所述利用出芽短梗黴靜息細胞生物轉化合成普魯蘭多糖的轉化液中添加斯潘類非離子型表面活性劑，斯潘類非離子型表面活性劑在轉化液中的濃度為1?308/1。
2.根據權利要求1所述的提高出芽短梗黴靜息細胞生物合成普魯蘭多糖產量的方法，其特徵在於:所述斯潘類非離子型表面活性劑的添加時間為在轉化液被配製出來後的30分鐘之內，添加斯潘類非離子型表面活性劑，斯潘類非離子型表面活性劑為斯潘20或斯潘40或斯潘60或斯潘80。
3.根據權利要求2所述的提高出芽短梗黴靜息細胞生物合成普魯蘭多糖產量的方法，其特徵在於:所述斯潘20的添加時間為在轉化液被配製出來後，立即添加斯潘20，所述斯潘20在轉化液中的濃度為58/1。
4.根據權利要求2所述的提高出芽短梗黴靜息細胞生物合成普魯蘭多糖產量的方法，其特徵在於:所述斯潘40的添加時間為在轉化液被配製出來後，立即添加斯潘40，所述斯潘40在轉化液中的濃度為108/1。
5.根據權利要求2所述的提高出芽短梗黴靜息細胞生物合成普魯蘭多糖產量的方法，其特徵在於:所述斯潘60的添加時間為在轉化液被配製出來後，立即添加斯潘60，所述斯潘60在轉化液中的濃度為58/1。
6.根據權利要求2所述的提高出芽短梗黴靜息細胞生物合成普魯蘭多糖產量的方法，其特徵在於:所述斯潘80的添加時間為在轉化液被配製出來後，立即添加斯潘80，所述斯潘80在轉化液中的濃度為208/1。
【文檔編號】C12R1/645GK104450827SQ201410776656
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月16日 優先權日:2014年12月16日
【發明者】衛功元, 巨曉敏, 王大慧 申請人:蘇州大學