一種澱粉黴新菌株及其應用的製作方法

2023-11-01 20:04:07 2

一種澱粉黴新菌株及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種澱粉黴（Amylomyces?rouxii）新菌株CZ1，其保藏號為CGMCC?No.6874，保藏日期為2012年11月23日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。本發明還公開了含有其的菌劑。在堆體中接種本發明的澱粉黴新菌株CZ1，在北方低溫季節能迅速提高堆體溫度，且能使堆體保持50℃以上的高溫15天，縮短了發酵周期，能有效殺滅動物糞便中的病原物和寄生蟲。堆肥發酵結束後，堆肥產物養分含量高，pH8.0左右，可作為優良的植物有機肥使用。
【專利說明】一種澱粉黴新菌株及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於堆肥領域，具體涉及一種堆肥用微生物及其應用。
【背景技術】
[0002]我國畜禽養殖業經過近30年的快速發展，極大的滿足了城鄉居民對於肉蛋奶的需求。然而我國畜禽養殖迅速發展的同時，不可避免帶來每年超過20億噸畜禽糞汙的產生，同時有大量的畜禽糞便不能及時消納，特別是快速興起的養殖小區的出現，導致糞汙大面積堆積或隨意丟棄，不但使農業資源不能及時有效地利用，也已成為土壤、水體汙染的主要汙染源，並且將限制養殖業的可持續發展。2013年中共中央國務院一號文件再次重申了「強化農業生產過程環境監測，積極開展農業面源汙染和畜禽養殖汙染防治」工作；北京市十二五發展規劃也將「研究廢棄物無害化處理和資源利用技術與裝備的系列化、標準化，提高生產能力」和「在調整高端農業產業布局的同時，高度關注農業發展對環境、能源和水資源的影響」列入工作重點。因此，在確保畜禽養殖產業有效發展、確保農民收入的前提下，有效地處置、利用畜禽廢棄物、減少環境和生態的汙染風險迫在眉睫。
[0003]目前好氧堆肥是實現畜禽糞便資源化利用的最主要手段。然而傳統自然堆肥法由於堆肥初期有益微生物數量少，繁殖速度慢，因此發酵時間長、易產生臭味，堆肥效率低下。而在堆肥化過程中添加外源菌劑有利於畜禽糞便堆肥腐熟。但是當前市場上成熟的商品菌劑多為國外引進，價格昂貴，種類不多，應用範圍寬泛。接種這些外源菌劑，在初期容易出現堆料中土著微生物與之激烈的競爭，導致外源菌劑無法在堆料中快速定殖，因此發揮的作用大打折扣。同時，由於已有的商品菌劑大多缺乏針對性，在北方低溫季節接種後，堆料很難迅速升溫，無法及時發揮應有的作用。目前我國北方地區在低溫季節存在糞汙無法及時的連續處理導致大量堆積、需要增加額外的糞汙存儲場地或設施、有機肥生產在低溫季節無法正常運行等問題。因此篩選能在低溫季節使堆料迅速升溫的微生物菌株，對於解決北方地區糞汙的連續處理和有機肥生產周年進行具有重要的實用價值。

【發明內容】
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[0004]本發明首先提供澱粉黴(Amylomyces rouxii)新菌株CZl。
[0005]本發明還提供含有所述澱粉黴CZl的菌劑。
[0006]本發明的菌株分離與篩選過程如下:
[0007]①採用平板稀釋法分別從新鮮牛糞、高溫發酵階段牛糞以及腐熟後的牛糞中進行微生物分離。稱取各樣品各IOg分別放入裝有90mL無菌水的三角瓶中，在搖床上振蕩30min，使樣品充分分散，靜置20min後即為KT1稀釋液，然後連續稀釋製成10_2_10_8濃度的稀釋液備用。取100 μ L各濃度的稀釋液，採用常規塗抹法用塗布器在改良高氏I號固體培養基上塗布，每個濃度梯度三個重複，分別置於25°C、35°C、50°C恆溫培養箱中培養。3d後挑取平板上長出的單菌落，進一步純化培養，並於4°C保存。
[0008]改良高氏I號培養基，其中葡萄糖10.0g/L、蛋白腖5.0g/L、KNO3L Og/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4.7Η200.5g/L、NaCl0.5g/L、FeSO40.01g/L、水 1000ml、pH7.2、瓊脂
1.5%-2.0%。
[0009]②根據菌株在纖維素一剛果紅平板上形成透明圈的快慢、透明圈明晰程度、透明圈與菌落直徑比值(D/d)的大小，篩選出了 I株中溫菌，該菌株在培養的第2天即出現清晰的透明圈，在培養第4天D/d達到10.7。該菌株菌落邊緣不整齊絨毛長，草叢狀，潔白色，毛上有黑色孢子。
[0010]③測定該菌株的ITS序列進行分子生物學鑑定，所用引物為ITSl:TCCGTAGGTGAACCTGCGG (SEQ ID N0.2) ；ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC (SEQ ID N0.3)，序列如SEQ ID N0.1所示，與其它公布的澱粉黴的ITS序列同源性為99%以上，鑑定為澱粉黴(Amylomyces rouxii),命名為CZl,並於2012年11月23日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC N0.6874。
[0011]本發明的澱粉黴CZl可製備成菌劑，其中，澱粉黴CZl的活菌數可為50億/克以上，優選為100億/克以上。
[0012]本發明還提供所述生物菌劑的製備方法，其為在液體發酵培養基中發酵澱粉黴CZ1，將得到的發酵液即為生物菌劑。
[0013]其中，優選的發酵培養基為高氏I號液體培養基。
[0014]優選的，所述的製備方法可具體包括如下步驟:
[0015]將澱粉黴CZl接種至改良高氏I號固體培養基斜面，於35°C恆溫條件培養48_72h得到斜面種子；`
[0016]將斜面種子接種至改良高氏I號液體培養基，於35°C恆溫條件，120-200r/min轉速振蕩培養48-72h得到液體種子；
[0017]將液體種子以0.5-10% (V/V，即每100ml液體培養基接種0.5-lOml液體種子)接種量，接種到液體發酵罐中的生產培養基中，進行菌種生產，於持續通氣條件下，35°C恆溫培養3-4天。培養結束後，將菌種盛放於滅菌的容器內，置於陰涼乾燥處保存。
[0018]優選的，還可以根據本領域常規方法將製備的澱粉黴CZl發酵液進行冷凍乾燥，從而製備凍乾粉形式的生物菌劑。
[0019]在堆體中接種本發明的澱粉黴新菌株CZ1，能在環境溫度為8°C左右的條件下，使堆肥迅速起爆，且能使堆體保持50°C以上的高溫15天，縮短了發酵周期，能有效殺滅動物糞便中的病原物和寄生蟲。堆肥發酵結束後，堆肥產物養分含量高，PH8.0左右，可作為優良的植物有機肥使用。該菌株適於北方低溫季節畜禽糞便的堆肥化處理，對於解決北方地區低溫季節糞汙無法及時處理而導致糞汙堆積、額外增加糞汙存儲場地或設施、有機肥生產暫停等問題具有重要的應用價值，可以實現北方地區養殖糞汙的連續處理和有機肥生產周年進行。
[0020]本發明提供了一種適於北方低溫季節畜禽糞便堆肥化處理的微生物菌株。該菌株來源於不同發酵階段的畜禽糞便，經過馴化配比後又應用於畜禽糞便堆肥過程，保證了菌劑的分離環境與目標應用環境的相似性，提高了菌劑的有效性，解決了通常情況下堆肥添加外源菌劑無法與堆料中土著微生物競爭，導致在堆料中難於快速定殖的困難。同時解決了北方地區低溫季節糞汙無法及時處理而導致的糞汙堆積、額外增加糞汙存儲場地活設施，有機肥生產暫停等局面，可以實現北方地區糞汙的連續處理和有機肥生產周年進行。
[0021]說明書附圖
[0022]圖1所示為不同堆肥處理溫度變化情況。
【具體實施方式】
[0023]以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。
[0024]若無特別說明，本發明中所述的「份」是指「重量份」;
[0025]實施例1澱粉黴菌劑的製備
[0026]將澱粉黴CZl接種至改良高氏I號固體培養基斜面，於35°C恆溫條件培養72h得到斜面種子；
[0027]將斜面種子接種至改良高氏I號液體培養基，於35°C恆溫條件，180r/min轉速振蕩培養72h得到液體種子；
[0028]將液體種子以5% (V/V,即每100ml液體培養基接種5ml液體種子)接種量,接種到液體發酵罐中的生產培養基中，進行菌種生產，於持續通氣條件下，35°C恆溫培養4天。培養後的發酵液即可作為菌劑使用。
[0029]所述的改良高氏I號固體培養基成分為:其中葡萄糖10.0g/L、蛋白腖5.0g/L、KNO3L Og/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4.7Η200.5g/L、NaCl0.5g/L、FeSO40.01g/L、水 1000ml、pH7.2、瓊脂2.0%，分裝入試管中，每管5-10ml，塞上棉塞，高溫高壓滅菌20min，之後擺成斜
面。`
[0030]所述的改良高氏I號液體培養基成分同前，無瓊脂。
[0031]實施例2
[0032]將新鮮牛糞與粉碎秸杆以一定比例進行混合，調整堆料的C/N為28-32，含水量為60%。
[0033]將實施例1生產的菌劑按照質量比5%。接種到堆料混合物中，定期翻堆通氣，進行堆肥發酵。同時以不接入本發明的菌劑的堆體為對照。
[0034]接種本發明所述微生物菌劑的堆料與自然堆肥的堆料相比(見表1及圖1)，在低溫環境條件(5°C左右)下，堆料起爆速度快，升溫迅速，堆體最高溫度高，發酵周期短，其C/N下降迅速，這些結果表明向以牛糞為主的堆料中接種本發明所述的微生物菌劑能夠在北方低溫季節加快堆料的腐熟進程。
[0035]堆肥結束後及時取樣，用小土鑽鑽取堆體表層下40~50cm處樣品，風乾後研磨，測定有機質、全氮、全磷、全鉀含量。通過對比分析接種本發明所述微生物菌劑的堆肥產物與自然堆肥的產物中養分含量(見表2)，發現接種本發明所述微生物菌劑的堆肥產物中，其全氮、全磷、全鉀以及有機質含量均顯著高於自然堆肥的產物，這表明向以牛糞為主的堆料中接種本發明所述的菌劑更有利於堆料中養分轉化與保存。
[0036]表1本發明所述微生物菌劑對堆肥腐熟程度的影響
[0037]
【權利要求】
1.一種澱粉黴(Amylomyces rouxii)新菌株 CZl，其保藏號為 CGMCC N0.6874。
2.含有權利要求1所述菌株的生物菌劑。
3.根據權利要求2所述的生物菌劑，其中澱粉黴CZl的活菌數為50億/克以上。
4.製備權利要求2或3所述的生物菌劑的方法，其為在液體發酵培養基中發酵澱粉黴CZ1，將得到的發酵液即為生物菌劑。
5.如權利要求4所述的方法，其還包括將澱粉黴CZl發酵液進行冷凍乾燥，製備成的凍乾粉為生物 菌劑。
【文檔編號】C12R1/645GK103497898SQ201310425145
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月17日 優先權日:2013年9月17日
【發明者】劉克鋒, 王順利, 王紅利, 高程達, 石愛平 申請人:北京農學院