仿生磷脂聚合物細胞膜及其製備方法和用途的製作方法

2023-12-03 18:13:36 2

專利名稱：：仿生磷脂聚合物細胞膜及其製備方法和用途的製作方法
技術領域：
：本發明屬高分子材料膜
技術領域：
，涉及一種新型模擬組織細胞膜及其製備方法和在藥物滲透中的應用。
背景技術：
：生物利用度是衡量一種藥物能否開發成有效的臨床藥物的重要指標之一。藥物的生物利用度受一系列因素的影響，具有關報導，80%的藥物通過腸上皮細胞的被動擴散滲透進入血液。有研究表明，吸收性的數據能夠用於早期藥物開發中的體外活性分析。近十餘年來，國外已普遍採用組織細胞模型作為藥物吸收性研究的工具，主要有Caco-2細胞單層模型、MDCK細胞模型和BBMEC模型等。Caco-2細胞模型來源於人的結腸癌細胞，是著名的小腸吸收模型，該模型的研究結果與體內藥物的處置有較好的相關性。Caco-2細胞模型現已被認可為小分子藥物口服吸收的體外篩選模型，已為發達國家的藥物研究機構或開發公司廣泛採用。MDCK細胞模型來源於犬科動物的腎細胞，可以形成緊密結合的單細胞層。BBMEC模型，在建立初期即成為血腦屏障研究的重要工具，至今仍被應用。是目前模擬血腦屏障的最常用的體外模型。上述細胞模型在使用時均需要實驗室培養，傳統的培養方法需要培養至少21天才具有模擬細胞膜的性質，不同研究者建立細胞模型的方法存在一些差異，不同實驗室對同一模型的評價結果也可能不盡相同，除此之外，還存在儲存時間短，操作麻煩，成本高等缺陷。建立一種用於分析藥物滲透和吸收性的體外仿生膜模型已成為世界藥物學家關注的前沿。2002年7月在舊金山召開了第一屆人工膜滲透性研究的國際會議，會上介紹了一種新的人工膜PAMPA模型，但該模型尚存在不足之處，主要在於(l)PAMPA價格雖然比Caco-2細胞模型低，但此模型自動化程度高，對少量樣品的試驗來說，其成本較大，對於普通實驗室的少樣測試不方便；(2)PAMPA是溶液成膜，會對某些試驗測試造成誤差；(3)PAMPA是小分子磷脂製成的雙分子膜，很不穩定，不僅影響膜的穩定性，還影響藥物檢測的結果；(4)目前PAMPA採用卵磷脂膜以模擬腸的吸收性能，模擬的細胞膜部位尚嫌單一。-CH2、CH—COOHH3N+
發明內容本發明的目的是克服現有技術的缺陷，提供一種自組裝仿生磷脂聚合物組織細胞膜及其製備方法。本發明的另一目的是提供上述仿生磷脂聚合物組織細胞膜在藥物吸收中的用途。本發明自組裝仿生磷脂聚合物組織細胞膜含有疏水性脂肪烴端和親水性磷脂基團齊聚物，所述仿生膜其單體包括含親水性磷脂極性頭部端基和疏水性脂肪烴尾部鏈段，其齊聚物作為成膜聚合物的原料。所述的齊聚物包括a,b，c三類齊聚物，各由R1，R2，R3三部分組成,其中Rl代表各種不飽和烷烴，，R2代表不同鏈長的脂肪烴，R3代表不同磷脂極性基團，每部分均可根據需要進行調節。所述的a類齊聚物具有式I的化學結構-R1R2R3所述的b類齊聚物具有式II的化學結構為所述的C類齊聚物具有式ffl的化學結構為:0——CH2~^~CF2+CH2—0-\7n0■P—0IIoZCH2zNH3IIH\c3Hformulaseeoriginaldocumentpage7上述齊聚物的特徵在於原料中水份為01%;分子量為10009xl(f;疏水鏈段碳原子或氟原子或矽原子的數目為820;極性磷脂含量為O.lwt%99wt%。所述的親水性的磷脂基團或其衍生物連接端基含有雙鍵的疏水性脂肪烴上，合成出能自組裝形成與生物膜非常相似的結構。所述的連接端基含有雙鍵的不飽和疏水性脂肪烴，包括脂肪鏈或矽氧烷鏈或氟碳鏈。所述的親水性的磷脂基團或其衍生物(式IV)選自卵磷脂，腦磷脂，肌醇磷脂，絲氨酸磷脂或二棕櫚醯磷脂醯膽鹼。formulaseeoriginaldocumentpage7IV其中X基團和磷脂的名稱如表1所示。是的。表l式(IV)x基團和磷脂的名稱tableseeoriginaldocumentpage7所述的親水性的磷脂基團或其衍生物具備下述帶電荷的磷脂結構。formulaseeoriginaldocumentpage8本發明的自組裝仿生磷脂聚合物組織細胞膜的製備方法基於下列原則-分子生物學理論表明，細胞膜結構具有親水的頭、疏水的尾，膜中磷脂呈液晶結構，這種結構容許離子傳遞和分子運動。將極性磷酸膽鹼基或其衍生物引入疏水脂肪鏈上，這種材料在水溶液中或在生理條件下可以自組裝成親水頭、疏水尾的結構。材料自組裝以後，將疏水鏈末端的雙鍵打開，使分子間疏水端縮合，從而保證了疏水鏈始終在內部，親水端始終在表面。這種磷脂聚合物保證了材料在成膜以後，更好模擬組織細胞膜的結構和性能。本發明通過控制聚合物的分子量大小、疏水性脂肪烴端的長度和磷脂含量，調節合成磷脂聚合物的穩定性和彈性，製備仿生膜。本發明的顯著特色體現在合成的磷脂聚合物含有陰陽兩性端基和垸烴非極性分子鏈，這使得磷脂聚合物容易自組裝形成與生物膜非常相似的微觀非均相結構。這種自組裝使得磷脂聚合物容易自動形成液晶態，表現出液晶行為。由於兩性端基的存在，磷脂聚合物的分子形態隨著周圍環境pH值的變化而變化，因而表現出環境敏感性，當周圍環境pH值在26.5時，表現為脂質雙分子層樣結構，周圍環境pH值在7.310.5時，表現為單分子層，厚度〈0.75mm，周圍環境pH值在MO.5時，表現為雙分子層微管，厚度X).75mm，可以調節滲透液體的PH值的大小，而模擬不同器官組織的pH值變化。本發明用磷脂聚合物在疏水鏈上引入不同極性磷脂基或其衍生物如卵磷脂、腦磷脂、肌醇磷脂、絲氨酸磷脂和二棕櫚醯磷脂醯膽鹼等，根據含不同磷脂的聚合物為主要成膜材料建立不同靶目標的模擬細胞膜藥物滲透模型。如含卵磷脂的磷脂聚合物為主要成膜材料可以構建腸吸收滲透模型，含腦磷脂的磷脂聚合物為主要成膜材料可以構建血腦屏障BBB滲透吸收模擬模型。圖1磷脂聚合物在水溶液中可能的形態。圖2PAMPA-CN的工作示意圖。圖3PAMPA-CN模型與Caco-2細胞/DS-PAMPA滲透性值比較。具體實施例方式下面以實施例對本發明加以進一步的說明，但是不限制本發明的內容。實施例l:磷脂聚合物的製備方法(1)a.按式(V)的路線合成單體formulaseeoriginaldocumentpage9(V)稱取一定量脂肪族二元醇，三乙胺溶於乾燥的四氫呋喃中，冷卻至O'C，攪拌緩慢滴加一定量甲基丙稀醯氯，保持溫度在03r，混合物升溫至5(TC反應2h,經過濾，洗滌，層析柱分離得無色液體甲基丙稀酸脂肪族二元醇酯，展開劑為乙酸乙酯/正己烷:20/80和乙酸乙酯/正己垸50/50。稱取一定量甲基丙稀酸脂肪族二元醇酯,三乙胺溶於千燥的四氫呋喃中，冷卻至-2(TC，一定量COP溶於乾燥的四氫呋喃中，攪拌緩慢滴加溶液，保持溫度在-20-3CTC3h，經過濾，洗滌，乾燥得單體中間體無色液體。稱取一定量單體中間體和乾燥乙腈，冷卻至-2(TC，快速向溶液中加入無水三甲胺，混合物升溫至6(TC反應16h,冷卻至-2(TC，氮氣下過濾沉澱，乾燥的乙腈洗滌，減壓乾燥得磷脂聚合物單體。所述合成仿生膜單體的一般具有式(VI)的結構formulaseeoriginaldocumentpage10(VI)其中n=820，X基團和磷脂名稱如表l所示。或，b.按式(VD)的路線合成單體formulaseeoriginaldocumentpage10(VII)稱取一定量(S)-1-醯基_2-苄基甘油，三乙胺溶於乾燥的二氯甲烷中，冷卻至O'C，攪拌緩慢滴加一定量氯乙氧基磷醯二氯，保持溫度在05'C，混合物反應4h，經過濾，洗滌，層析柱分離得無色液體(S)-1-醯基-2-苄基-6-氯磷脂，展開劑為乙酸乙酯/正己烷20/80和乙酸乙酯/正己烷50/50。稱取一定量(S)-1-醯基-2-節基-6-氯磷脂，三甲胺溶於乾燥的乙醇/氯仿混合溶液中，密封混合物升溫至607(TC反應60h，冷卻至-2(TC，氮氣下過濾沉澱，乾燥的乙腈洗滌，減壓乾燥得磷脂聚合物單體。(2)按式(VID)的路線製備齊聚物2007formulaseeoriginaldocumentpage11一定量的單體在引發劑偶氮二異丁腈(AIBN)存在下507(TC反應1024h，得到齊聚物產物。實施例2精確稱取1，8-辛二醇28.76g(0.197mol)'三乙胺33.lg(0.327mol)溶於200mL乾燥的四氫呋喃中，冷卻至0t:，攪拌緩慢滴加甲基丙稀醯氯20.6g(0.197mol)，保持溫度在03'C，混合物升溫至5(TC反應2h，經過濾，洗滌，層析柱分離得無色液體甲基丙稀酸辛二醇酯，展開劑為乙酸乙酯/正己垸20/80和乙酸乙酯/正己烷50/50。精確稱取甲基丙稀酸辛二醇酯32.96g(0.154mol),15.6g三乙胺(0.154mol)溶於200mL乾燥的四氫呋喃中，冷卻至-2(TC，21.9g(0.154mol)COP溶於lOOmL乾燥的四氫呋喃中，攪拌緩慢滴加溶液，保持溫度在-20-3(TC3h，經過濾，洗滌，乾燥得2-(2-oxo-l，3,2-dioxaphospholoyloxy)ethylmethacrylate無色液體。精確稱取2-(2-oxo-l，3，2-diox印hospholoyloxy)ethylmethacrylate5.0g禾口30ml乾燥乙腈，冷卻至-2(TC，快速向溶液中加入2ml無水三甲胺，混合物升溫至6(TC反應16h，冷卻至-2(TC，氮氣下過濾沉澱，乾燥的乙腈洗滌，減壓乾燥得磷脂聚合物單體。稱量適當的磷脂聚合物單體和AIBN溶於甲醇一四氫呋喃混合液中置入聚合試管中，氮氣保護下封閉試管，試管60'C振蕩反應16h，冷卻停止反應，減壓收集得到磷脂聚合物。實施例3精確稱取1，9-壬二醇31.52g(0.197roo1),三乙胺33.lg(0.327mol)溶於200mL乾燥的四氫呋喃中，冷卻至0'C，攪拌緩慢滴加甲基丙稀醯氯20.6g(0.197mol)，保持溫度在03'C，混合物升溫至50'C反應2h，經過濾，洗滌，層析柱分離得無色液體甲基丙稀酸辛二醇酯，展開劑為乙酸乙酯/正己烷20/80和乙酸乙酯/正己垸50/50。精確稱取甲基丙稀酸辛二醇酯34.25g(0.154mol)，15.6g三乙胺(0.154mol)溶於200mL乾燥的四氫呋喃中，冷卻至-20°C，21.9g(0.154mol)COP溶於lOOmL乾燥的四氫呋喃中，攪拌緩慢滴加溶液，保持溫度在-20-3(TC3h，經過濾，洗滌，乾燥得2-(2-oxo-l，3,2-dioxaphospholoyloxy)ethylmethacrylate無色液體。精確稱取2-(2-oxo-l，3,2-dioxaphospholoyioxy)ethylmethacrylate5.0g禾口30ml乾燥乙腈，冷卻至-2(TC，快速向溶液中加入2ml無水三甲胺，混合物升溫至6(TC反應16h，冷卻至-2(TC，氮氣下過濾沉澱，乾燥的乙腈洗滌，減壓乾燥得磷脂聚合物單體。稱量適當的磷脂聚合物單體和AIBN溶於甲醇一四氫呋喃混合液中置入聚合試管中，氮氣保護下封閉試管，試管6(TC振蕩反應16h，冷卻停止反應，減壓收集得到磷脂聚合物。實施例4將少量的合成的含卵磷脂聚合物放置在P層PA-CN的微孔上，PAMPA-CN由上下兩個腔室組成，上層為供體液(緩衝溶液和藥物)，下層為接收液(緩衝溶液)，緩衝溶液由50mM磷酸鈉(pH6.0-7.5)，50mM檸檬酸鈉(pH3.0-5.5)，50mM硼酸鈉(pH8.0-10.0)組成，3(TC培養215小時形成卵磷脂聚合物仿生細胞膜。接收液中溶液的濃度由UV光譜來測量。少量測試磺胺撒克西啶，諾福克，雙氫克尿塞，立痛定，心得安，戊脈安等幾種藥物滲透率分別為16.0，45.0，16.0，128.0，133.0,148.0nm/s。研究結果表明，構建的模型與Caco-2細胞模型有相似的藥物滲透吸收功能，通過比較發現，採用該模型得出的參數與體內藥物特別是那些被動吸收的藥物的研究結果有較大的相關性。本發明的建立不同靶目標的模擬細胞膜模型是與體內實驗數據或藥物參數比較，建立模擬模型公式P^dC/ACodT;P—滲透率，V—接受液體積，A—膜表面積，Co—供體液濃度，dC/dT—濃度變化速率。通過人工膜的表觀滲透率由方程計算。其計算公式為formulaseeoriginaldocumentpage12Vdn(ml)=供體槽的體積(0.2ml),Vac(ml)=接受槽的體積(0.30or0.35ml),Cac=接收槽在加入藥物孵化後的濃度(mM)，Cdo-供體槽最初的濃度(mM)，S(cm2)=膜的面積(0.3cm2)，t(s)-孵化時間.formulaseeoriginaldocumentpage13(3)formulaseeoriginaldocumentpage13(4)戶m是膜的滲透性,屍o是未解離樣品固有的滲透性，p尺a是解離常數111"、屍am是表觀滲透性，UWL表示不攪拌水層。聯合G)—(5)得到:formulaseeoriginaldocumentpage13(6)formulaseeoriginaldocumentpage13(7)實施例5將幾種卵磷脂聚合物溶解於十二垸中配製成0.2mg/ml溶液，準確取4ul磷脂聚合物溶液放置在PAMPA-CN的微孔上，PAMPA-CN由上下兩個腔室組成，上層為供體液(緩衝溶液和藥物)，下層為接收液(緩衝溶液)，緩衝溶液由50mM磷酸鈉(pH6.0-7,5)，50mM檸檬酸鈉(pH3.0—5.5)，50mM硼酸鈉(pH8.0-10.0)組成，30。C培養215小時形成卵磷脂聚合物仿生細胞膜。接收液中溶液的濃度由UV光譜來測量。少量測試諾氟沙星，法莫替丁，阿替洛爾，西米替丁，布洛芬等幾種藥物的滲透率。研究結果表明，幾種合成磷脂的藥物滲透性能與商用PAMPABLM-0磷脂模型有相似的藥物滲透吸收功能，通過比較發現，採用該模型得出的參數與體內藥物特別是那些被動吸收的藥物的研究結果有較大的相關性。滲透率計算公式同實施例5。表2是四種不同磷脂在pH7.4下的滲透率。表2.tableseeoriginaldocumentpage14權利要求1、仿生磷脂聚合物細胞膜，其特徵在於含有疏水性脂肪烴端和親水性磷脂基團齊聚物，其單體包括含親水性磷脂極性頭部端基和疏水性脂肪烴尾部鏈段，其齊聚物作為成膜聚合物的原料。2、按權利要求1所述的仿生磷脂聚合物細胞膜，其特徵在於所述的親水性磷脂選自卵磷脂，腦磷脂，肌醇磷脂，絲氨酸磷脂或二棕櫚醯磷脂醯膽鹼；所述的疏水性包括脂肪鏈或矽氧烷鏈或氟碳鏈等。3、按權利要求1所述的仿生磷脂聚合物細胞膜，其特徵在於所述的疏水性脂肪烴尾部鏈段是不飽和烴鏈。4、按權利要求1所述的仿生磷脂聚合物細胞膜，，其特徵在於所述的親水性的磷脂基團帶電荷。5、按權利要求1所述的仿生磷脂聚合物細胞膜，其特徵在於其分子形態隨環境pH值變化，當pH值為26.5時，表現為脂質雙分子層樣結構;pH值為7.310.5時，表現為單分子層；pH值〉10.5時，表現為雙分子層微管。6、按權利要求5所述的仿生磷脂聚合物細胞膜，其特徵在於所述分子形態為單分子層時其厚度〈0.75mm，分子形態為雙分子層時其厚度>0.75mm。7、權利要求1的仿生磷脂聚合物細胞膜的製備方法，其特徵在於通過控制聚合物的分子量大小、疏水性脂肪烴端的長度和磷脂含量，調節合成磷脂聚合物的穩定性和彈性。8、按權利要求7的方法，其特徵在於該方法包括下列步驟(1)單體製備取脂肪族二元醇，三乙胺溶於乾燥四氫呋喃，冷卻至O'C，攪拌滴加甲基丙稀醯氯，溫度為03'C，混合物升溫至50'C反應2h，過濾，洗滌，層析柱分離得甲基丙稀酸脂肪族二元醇酯液體，展開劑為乙酸乙酯/正己垸20/80和乙酸乙酯/正己垸50/50;取甲基丙稀酸脂肪族二元醇酯，三乙胺溶於乾燥四氫呋喃中，冷卻至-20。C，一定量COP溶於乾燥四氫呋喃中，攪拌滴加溶液，溫度為-20-30'C，3h，過濾，洗滌，乾燥得單體中間體無色液體；取單體中間體和乾燥乙腈，冷卻至-20'C，向溶液中加無水三甲胺，混合物升溫至608(TC反應1650h，冷卻至-2(TC，氮氣下過濾沉澱，乾燥的乙腈洗滌，減壓乾燥得磷脂聚合物單體；(2)齊聚物製備上述單體在引發劑偶氮二異丁腈存在下507(TC反應1024h，得到齊聚物產物。9、按權利要求8的方法，其特徵在於所述齊聚物原料中水份為01%;分子量為10009xl06;疏水鏈段碳或氟或矽原子的數目為820;極性磷脂含量0.l90wt%;玻璃轉化溫度為3773.2°C;接觸角為70°120°。10、權利要求1的仿生磷脂聚合物細胞膜在製備建立不同靶目標的模擬細胞膜模型中的用途。11、按權利要求10的用途，其中所述的建立不同靶目標的模擬細胞膜模型是卵磷脂基仿生膜建立小腸模擬細胞膜模型，或腦磷脂基仿生膜建立腦組織模擬細胞膜模型，或肌醇磷脂基仿生膜建立胃組織模擬細胞膜模型以及各磷脂基的調控與組合模擬人體各種組織器官模擬模型如皮膚或口腔黏膜模型。12、按權利要求10的用途，其中所述的建立不同靶目標的模擬細胞膜模型是與體內實驗數據或藥物參數比較，建立模擬模型公式P=VdC/ACodT;其中，P—滲透率，V—接受液體積，A—膜表面積，Co—供體液濃度，dC/dT一濃度變化速率；通過人工膜的表觀滲透率由方程計算，其計算公式formulaseeoriginaldocumentpage3F/mx%=-x-x100Vdn(ml)=供體槽的體積(0.2ml)，(0.30or0.35ml)，Cac=接收槽在加入藥物孵化後的濃度(mM)，(mM)，(1)(2)Vac(ml)=接受槽的體積Cdo=供體槽最初的濃度S(cm2)=膜的面積(0.3cm2),t(s)-孵化時間.formulaseeoriginaldocumentpage4(3)formulaseeoriginaldocumentpage4(4)Pm是膜的滲透性，屍o是未解離樣品固有的滲透性，p尺a是解離常數111"、屍am戶mWPam是表觀滲透性，UWL表示不攪拌水層，聯合(3)_(5)得到:1i+1oh1formulaseeoriginaldocumentpage4(6)formulaseeoriginaldocumentpage4(7)全文摘要本發明屬高分子材料膜
技術領域：
，提供了一種自組裝仿生磷脂聚合物組織細胞膜及其製備方法和在藥物吸收中的用途。本發明克服現有技術的缺陷，將親水性的磷脂基團或其衍生物連接端基含有雙鍵的疏水性脂肪烴上，合成出能自組裝形成與生物膜非常相似的微觀非均相結構。本發明的自組裝仿生磷脂聚合物組織細胞膜穩定，儲存時間長，成本低，製備方法簡單快速。本發明構建的模型與Caco-2細胞模型有相似的藥物滲透吸收功能，通過比較發現，採用該模型得出的參數與體內藥物特別是那些被動吸收的藥物的研究結果有較大的相關性，可以用於藥物開發的早期篩選研究。文檔編號A61L27/16GK101181647SQ20071012955公開日2008年5月21日申請日期2007年6月30日優先權日2006年7月18日發明者暉於,劉培峰,鈞張,段友容,許金萍,鄢祝兵申請人:上海市腫瘤研究所