氯黴素化學發光酶聯免疫檢測試劑盒的製作方法

2023-12-03 13:09:16

專利名稱：氯黴素化學發光酶聯免疫檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種水產品中氯黴素殘留檢測用試劑盒，尤其是一種操作簡單、快捷、成本低廉、靈敏度高的氯黴素化學發光酶聯免疫檢測試劑盒。
背景技術：
氯黴素是一種廣譜抗生素，曾經被廣泛應用於水產養殖業。但是，氯黴素存在著嚴重的毒副作用，能引起人的再生障礙性貧血，新生兒、早產兒灰色症候群等；低濃度的殘留可引起人體內細菌的抗藥性，對人體健康存在潛在的威脅。為此，歐盟對進口水產品中氯黴素的殘留量定為O. Iyg /kg，美國FDA對進口水產品中氯黴素的殘留量定為O. 3yg /kg。目前對水產品中氯黴素殘留的檢測方法主要有氣象色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、色譜質譜聯用技術(LC-MS)、酶聯免疫檢測(ELISA)，氣象色譜法、高效液相色譜法、色譜質譜聯用技術均能夠滿足檢測需要，但是其設備昂貴、操作複雜。ELISA法具有檢測快捷、成本低廉等優點，但是，卻存在著檢測靈敏度低的缺點。

發明內容
本發明是為了解決現有技術所存在的上述技術問題，提供一種靈敏度高高、檢測快捷、成本低廉的氯黴素化學發光酶聯免疫檢測試劑盒。本發明的技術解決方案是一種氯黴素化學發光酶聯免疫檢測試劑盒，其特徵在於包含酶標板及如下試劑· 酶標板氯黴素與牛血清白蛋白偶聯物作為抗原包被於96孔酶標板中，包被抗原濃度為 5 μ g/ml ；
試劑I :氯黴素單克隆抗體，濃度為1:8000 ;
試劑II :辣根過氧化物酶標記兔抗鼠抗體，濃度為1:1000 ；
試劑III :氯黴素標準品，濃度分別為0ng/ml、0. 01ng/ml、0. lng/ml、lng/ml、10 ng/ml、
20ng/ml ；
試劑IV :含有體積分數為O. 05%吐溫-20的pH7. 4,0. 01mol/L的磷酸鹽緩衝液；
試劑V :魯米諾溶於O. lmol/L的NaHCO3,形成濃度為O. 01mol/L的發光液A ；
試劑VI :體積分數30%的H2O2溶於pH8. 8的HCl-Tris溶液，形成發光劑B。使用本發明可以將抗體與抗原結合的高度特異性與酶催化的高效性相結合，對樣品中氯黴素殘留量進行化學發光酶聯免疫檢測。本發明分析靈敏度為0. 08ng/ml，線性檢測範圍為0. Of 20ng/ml，變異係數2. 6^9. 5，回收率為87°/Γ 14%，與紅黴素、慶大黴素、甲碸黴素、土黴素的交叉反應率小於0. 1%，檢測過程需I. (Tl. 5小時，具有操作簡單、快捷、成本低廉、靈敏度高等優點。


圖I是本發明實施例的標準曲線圖。
具體實施例方式本發明的氯黴素化學發光酶聯免疫檢測試劑盒包含酶標板及如下試劑
酶標板以氯黴素與牛血清白蛋白偶聯物(購自廣州艾柏金斯生物公司)為抗原包被於
96孔聚苯乙烯酶標板上，包被抗原濃度為5 μ g/ml ;是用pH值為9. 6的碳酸鹽緩衝液對抗原進行稀釋，按100 mL/孔進行包被，即4°C過夜(12h)，次日以pH值為7. 4的磷酸鹽洗滌液進行洗滌，拍幹，以250 mL/孔含體積分數2%的BSA封閉液封閉2 h後，用洗液洗滌，乾燥後存放於4°C冰箱待包裝測試盒用。試劑I :氯黴素單克隆抗體(購自廣州艾柏金斯生物公司)，濃度為1:8000 ；
試劑II :酶標記物，即辣根過氧化物酶標記兔抗鼠抗體(購自上海生工生物公司)，濃度為 1:1000 ；試劑III :氯黴素標準品，濃度分別為0ng/ml、0. 01ng/ml、0. lng/ml、lng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml ；
試劑IV :含有體積分數為O. 05%吐溫-20的pH7. 4,0. 01mol/L的磷酸鹽緩衝液；
試劑V :魯米諾溶於O. lmol/L的NaHCO3,形成濃度為O. 01mol/L的發光液A ；
試劑VI :體積分數30%的H2O2溶於pH8. 8的HCl-Tris溶液，形成發光劑B。使用本發明實施例進行氯黴素化學發光酶聯免疫檢測程序如下
(I)樣品(水產品)處理
稱取I. 5±0. 05g的樣品均質物至離心管中，加入I. 5ml的去離子水充分混勻再加入3ml乙酸乙酯，震蕩5min，室溫4000r/min離心lOmin。取2ml上層液體50 60 0C空氣流吹乾，用0. 5ml正己烷溶解乾燥物，用0. 5ml復溶液工作液強烈震蕩混合；室溫下(2(T25°C)4000r/min離心5min ;取50ml下層水相用於分析。復溶液工作液PH7.4的0.01mol/L PBS (磷酸鹽緩衝液)+1%BSA (牛血清白蛋白)，即IOOml液體中加入lgBSA。(2)檢測步驟
a.將本發明實施例各組分取出在室溫條件下放置30min，使其恢復室溫；
b.取96孔酶標板，按50ml/孔向各孔中加入試劑III(不同濃度氯黴素標準
品，每種濃度對應N孔)，隨後加入試劑I 50ml/孔，振蕩30s混勻後，置於37 0C孵育30min後取出；
c.洗板用試劑IV按250ml/孔加入，拍幹，重複進行4 5次，每次間隔2(T30s；
d.100ml/孔加入試劑II，37°C孵育30min，取出重複c步驟洗板；
e.將試劑V與試劑VI按I:I混合後，100 ml/孔加入，進行化學發光酶聯免疫檢測，測得各濃度發光值，繪製標準曲線(見圖I)。按照上述a'步驟，將樣品替代試劑III，將測得的發光數據代入標準曲線，即可得到樣品中氯黴素的含量。實驗I :本發明實施例靈敏度檢測
按上述檢測方法同時測定10個試劑IIK氯黴素標準品0ng/ml濃度)發光值，得到樣本
均數(Jf )和標準差⑶，計算:t +2&帶入圖I所示標準曲線，得到的數值為本試劑盒方法學靈敏度。經測定本發明實施例的靈敏度為O. 08ng/ml。實驗2 :本發明實施例的精密度和回收率實驗
取O. 01,0. Ulng/ml三種濃度的氯黴素加入到上述水產品組織中進行精密度和回收率檢測，精密度以變異係數表示，批內變異係數和回收率以同一天內5個重複數據進行檢測，批間變異係數以不同的5天5個重複數據進行檢測。精密度和回收率實驗結果分別如表I、表2 :
權利要求
1.一種氯黴素化學發光酶聯免疫檢測試劑盒，其特徵在於包含酶標板及如下試劑酶標板氯黴素與牛血清白蛋白偶聯物作為抗原包被於96孔酶標板中，包被抗原濃度為 5 μ g/ml ； 試劑I :氯黴素單克隆抗體，濃度為1:8000 ； 試劑II :辣根過氧化物酶標記兔抗鼠抗體，濃度為1:1000 ； 試劑III :氯黴素標準品，濃度分別為0ng/ml、0. 01ng/ml、0. lng/ml、lng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml ； 試劑IV :含有體積分數為O. 05%吐溫-20的pH7. 4,0. 01mol/L的磷酸鹽緩衝液； 試劑V :魯米諾溶於O. lmol/L的NaHCO3，形成濃度為O. 01mol/L的發光液A ; 試劑VI :體積分數30%的H2O2溶於pH8. 8的HCl-Tris溶液，形成發光劑B。
全文摘要
本發明公開一種操作簡單、快捷、成本低廉、靈敏度高的氯黴素化學發光酶聯免疫檢測試劑盒，包含酶標板及如下試劑酶標板氯黴素與牛血清白蛋白偶聯物作為抗原包被於96孔酶標板中，包被抗原濃度為5μg/ml；試劑Ⅰ氯黴素單克隆抗體，濃度為1:8000；試劑Ⅱ辣根過氧化物酶標記兔抗鼠抗體，濃度為1:1000；試劑Ⅲ氯黴素標準品，濃度分別為0ng/ml、0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml；試劑Ⅳ含有體積分數為0.05%吐溫-20的pH7.4、0.01mol/L的磷酸鹽緩衝液；試劑Ⅴ魯米諾溶於0.1mol/L的NaHCO3，形成濃度為0.01mol/L的發光液A；試劑Ⅵ體積分數30%的H2O2溶於pH8.8的HCl-Tris溶液，形成發光劑B。
文檔編號G01N21/76GK102914653SQ20121040179
公開日2013年2月6日 申請日期2012年10月22日 優先權日2012年10月22日
發明者張峰, 鄭峻峰, 呂麗, 盧亞楠 申請人:大連海洋大學, 張峰