用酪氨酸酶反義脫氧寡核苷酸防止皮膚的色素沉著的製作方法

2023-12-03 06:01:31 2

專利名稱：用酪氨酸酶反義脫氧寡核苷酸防止皮膚的色素沉著的製作方法
黑色素細胞來自胚胎的神經嵴，在胚胎早期移至皮膚。這種細胞合成棕褐色、紅色和黃色的色素顆粒，使人類有不同膚色。黑色素細胞含有一種特殊的細胞器官即黑色素小體，黑色素即在這些細胞器官中合成。黑色素小體內有一種特殊的酶即酪氨酸酶，將酪氨酸氧化成多巴，繼而氧化成多巴醌，最後生成黑色素。一旦黑色素小體完全黑色素化，生成的黑色素顆粒通過黑色素細胞的樹枝突被輸送到鄰近的表皮細胞中產生色素。黑色素是一種大聚合體，它具有吸收波長從200-2400mm大範圍光線的獨特能力。已經證明不同人種的皮膚中黑色素細胞的數量是一致的，其主要差異是黑色素合成的多少而造成皮膚顏色的差異。因此，黑色素細胞中產生黑色素的關鍵酶即酪氨酸酶的活性對於調節皮膚色素的沉著起著至關重要的作用。
皮膚的色素沉著主要是指皮膚的黑色素產生過多所致。在日常的皮膚保護方面主要針對因紫外照射或日曬引起的色素沉著，以及生理因素等引起的色素沉著，如雀斑和黃褐斑等。這都與黑色素細胞中的酪氨酸酶的活性增強有關。目前應用在皮膚化妝品中防止色素沉著的物質主要是通過篩選可抑制酪氨酸酶的方法而獲得，有天然提取物和化學合成物。
隨著生物技術的發展，人酪氨酸酶的基因被發現、克隆和深入研究。人酪氨酸酶基因編碼區由1590bp組成，編碼含536個胺基酸殘基的蛋白酶，位於116號染色體，含有5個外顯子，具有5′端的基因表達調控區。近年在酪氨酸酶基因研究中，對其調控區的基因分析取得了非常大的進展。已知它具有獨特的增強子和啟動子等調控單元，這些區域對酪氨酸酶基因的表達起到開關的作用。無論是內源性的還是外源性的物質，均通過作用於其基因調控區來影響酪氨酶基因的表達，從而抑制或增強酪氨酸酶的活性，起到調節黑色素產生多少的作用。
紫外線照射可引起皮膚色素沉著。一般日曬3-4天，皮膚形成新的黑色素，從而使皮膚逐漸變黑。
面部黃褐斑是黑色素細胞所產生的黑色素比正常時增多，為對內分泌激素的一種反應，並與紫外線射有關。其形成與酪氨酸酶活性增強密切相關。
雀斑是見於暴光區的殘紅色棕色斑，為黑色素形成增多所致，而黑色素細胞數目正常，
與酪氨酸酶活性增強相關。
反義核酸其實是能與一段特異基因序列互補結合的寡核苷酸片段。這種寡核苷酸片段可以是DNA或RNA，除了人工方法合成外，也可通過重組技術生物合成。反義寡核苷酸片段一般由十至幾十個鹼基組成，通過全自動人工合成而得。為了有利於進入細胞和防止核酸酶水解，多進行修飾處理，最常見的是鹼基磷酸根上的羥基被硫基或甲基取代。應用反義核酸技術在研究基因表達調控方面，在治療感染性疾病和腫瘤等方面取得了重要進展。反義核酸藥物已應用於臨床，反義核酸的農副產品已供人們食用。
近年有文獻報導應用針對酪氨酸酶反義核酸來研究酪氨酸酶基因的表達調控和對酪氨酸酶活性的影響，證明能有效抑制酪氨酸酶在黑色素細胞中的產生，使黑色素形成減少。
本專利在於提供一種在防止皮膚沉著方面，用反義核酸技術來抑制酪氨酸酶的產生，從而使皮膚細胞中黑色素減少。這種由人工合成針對酪氨酸酶基因5′端編碼區的15-20鹼基的反義脫氧寡核苷酸片段，經硫代化修飾後，具有較好的穩定性和細胞穿透性。在加入皮膚日常的化妝品基質中，能起到抑制因多種因素引起的皮膚黑色素細胞中酪氨酸酶基因表達，從而減少黑色素的產生，達到防止皮膚色素沉著的作用。
實例一 酪氨酸酶反義脫氧寡核苷酸的製備人源性的酪氨酸酶由527個胺基酸組成，其編碼區由159bp組成，選擇起始密碼子ATG後的18個鹼基序列作為其反義核酸特異封閉的序列是5′-CTC CTG GCT GTT TTG TAC-3′。用DNA合成儀合成經硫代磷酸型修飾的反義脫氧寡核苷酸片段，序列為5′-GTA CAAAAC AGC CAG GAG-3′，命名為S-AON。其寡核苷酸片段由18個鹼基組成，經硫代化修飾，與酪氨酸酶起始密碼子後18個鹼基特異互補。經DNA合成儀合成的酪氨酸酶反義脫氧寡核苷酸S-AON，經反相純化後高效液相色譜(HPLC)純度大於90％，經尿素變性聚丙烯醯胺電泳證實為18鹼基的單片段。
實例二 酪氨酸酶反義脫氧寡核苷酸(S-AON)抑制黑色素產生的作用酪氨酸酶活性測定用小鼠黑色素瘤細胞B16來測定。測定方法是在培養的B16細胞中，加入0.1-10mM的酪氨酸酶反義核酸(S-AON)，37℃繼續培養24小時。細胞經破裂後離心收集上清，加入0.3mg/ml的多巴，25℃5分鐘後用475mm測定OD值，計算酪氨酸酶活性。陽性對照酪氨酸酶和多巴購於Sigma公司，陰性對照用無關隨機的18鹼基長度的寡核苷酸片段。
經過以上方法測得S-AON在1.0mm濃度下對B16細胞中酪氨酸酶活性抑制率為75.2％。
實例三 含酪氨酸酶反義脫氧寡核苷酸(S-AON)皮膚化妝品霜的製備用實例1的方法製備的酪氨酸酶反義核酸(S-AON)配成每毫升含2.5mg的水溶液，按以下配方和配製方法製備配方(質量％)A、三壓硬脂酸 4十八醇 4單硬脂酸甘油脂 1.5平平加O 1白油3肉豆蔻酸異丙脂 3角鯊烷 2DC-200 0.5泥泊金丙脂 0.05B、蒸餾水 78酪氨酸酶反義核酸(S-AON) 2ml(0.005％)甘油6透明質酸0.18VE 0.2C、香精適量製法將A混合加熱至95℃製成油霜，將B加熱至95℃製成水霜，將A緩緩加於B中，勻質5分鐘，不斷攪拌冷卻至50℃時加入C，冷至常溫出料。
權利要求
1.本專利特徵在於採用針對酪氨酸酶的反義脫氧寡核苷酸添加到皮膚化妝品中，防止皮膚的色素沉著。
2.酪氨酸酶反義脫氧寡核苷酸系採用人工自動核酸合成技術製備而成，由15-20個鹼基組成，作用於酪氨酸酶mRNA5′端編碼區，阻止完整的RNA轉錄。
3.條款2中的由15-20鹼基組成的酪氨酸酶反義脫氧寡核苷酸主要是經硫代修飾的寡核苷酸片段。
4.酪氨酸酶反義核酸通過一定比例(0.005-0.01％)添加到化妝品中，可製成其膏劑、乳劑和水劑形式。
全文摘要
本發明屬於生物調節核酸美容,其特徵在於採用針對酪氨酸酶的反義脫氧寡核苷酸添加到皮膚化妝品中,達到防止皮膚的色素沉著的目的。應用本方法製成的化妝品,主要應用於皮膚的美白和祛斑。
文檔編號C12N15/11GK1375277SQ01111589
公開日2002年10月23日 申請日期2001年3月20日 優先權日2001年3月20日
發明者範開, 黃洪濤 申請人:重慶富進生物醫藥有限公司, 重慶思嬌化妝品有限公司