小麥黑胚病優勢病原鏈格孢菌的檢測引物及分子檢測方法
2023-11-04 06:26:22
專利名稱：小麥黑胚病優勢病原鏈格孢菌的檢測引物及分子檢測方法
技術領域：
本發明屬於農作物病害檢測技術領域，具體涉及一種小麥黑胚病優勢病原鏈格孢菌的檢測弓I物及分子檢測方法。
背景技術：
小麥黑胚病是一類小麥的穎果表面有不同形狀和程度的黑色、褐色、粉紅色、紅色、灰白色等病變的病害，病因複雜。研究表明弓I起小麥黑胚病的主要病原菌有鏈格孢菌、麥類根腐離蠕孢菌、禾穀鐮刀黴等，其中鏈格孢菌是河南省小麥黑胚病的優勢病原菌。鏈格孢菌不僅感染小麥籽粒，在根部、莖部、葉片都能引起不同病症，對小麥危害嚴重。帶菌量大的小麥種子會導致幼苗弱、根腐、莖腐，影響小麥的生長和產量，嚴重者甚至會導致麥苗的枯萎死亡。鏈格孢菌侵染葉片會引起小麥葉枯病，初期在葉片上形成較小的黃色褪綠斑，後擴展至中央成灰褐色，邊緣黃褐色長圓形病斑，潮溼時病斑表面可形成灰黑色黴層。由鏈格孢菌引起的小麥黑胚病影響小麥產量和品質，更嚴重的是鏈格孢菌產生鏈格孢毒素，如鏈格孢酚、鏈格孢酚甲基乙醚、細交鏈孢菌酮酸、鏈格孢黴素、細格菌毒素1、
I1、ΠΙ和AAL毒素。長期食用含這些毒素的食品會引起慢性中毒、誘發癌變。建立快速、準確的病原檢測技術是小麥抗病遺傳研究、抗病育種、病害防治的需要。目前對小麥黑胚病優勢病原菌的檢測方法主要是平板培養菌落分離、顯微鏡觀察鑑定法，依據的是菌落形態、以及菌絲和孢子結構， 鑑定操作複雜，步驟多，周期長，難以定量，無分子檢測技術報導。對鏈格孢屬真菌的分子檢測在十字花科蔬菜、石榴、胡蘿蔔中已有一些報導。然而，上述物種病原鏈格孢菌與小麥病原鏈格孢菌雖同歸一屬，但為不同小種，由於鏈格孢菌侵染寄主的專化性，其他物種上的病原均不侵染小麥，其基因序列也具有明顯差另Ij，所以，這些方法不能用於小麥病原鏈格孢菌的分子檢測。
發明內容
針對常規小麥黑胚病病原菌鑑定技術操作複雜、步驟多、周期長、效率低等問題，本發明提供了一種小麥黑胚病優勢病原鏈格孢菌的檢測引物，該檢測引物對小麥病原鏈格孢菌有很強的特異性，本發明還提供了一種小麥病原鏈格孢菌的快速巢式PCR檢測技術，該分子檢測方法具有特異性強、靈敏度高的特點。本發明包括以下技術方案:
本發明提供了一種小麥黑胚病優勢病原鏈格孢菌的檢測引物，所述引物的核苷酸序列為:上遊引物AalF:5 ' -TATGAAGGCGGGCTGGAA-3 '，下遊引物AalR:5' -TTTGCTGATAGAGAGTGCGAC-3'。本發明提供了上述引物在對小麥病原鏈格孢菌的鑑別或檢測中的應用。本發明還提供了一種利用上述引物檢測小麥病原鏈格孢菌的方法，包括以下步驟:(1)提取小麥種子或植株上待檢測組織的基因組DNA；
(2)以所述DNA為模板用病原真菌通用引物ITSl5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和ITS4 5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'進行第一輪 PCR 擴增:PCR 擴增採用 25 μ L 反應體系，其中包括:0.25 μ L 的 5 U/μ L Taq DNA 聚合酶，2.5 yL 含 15mmol/L MgClJAlOXPCRBuffer, 2 μ L 的 2.5 mmol/L dNTP Mixtrue,各 I μ L 的 10 μ mol/L ITSl 和 ITS4 引物，I μ L 的 50 ng/ μ L DNA, 17.25 μ L 的 ddH20 ；PCR 擴增程序:95°C預變性 5 min, 30 個循環的95°C變性30 s、58°C退火30 s和72°C延伸50 S，最後在72°C延伸10 min ；
(3)用小麥病原鏈格孢菌特異引物進行第二輪特異性擴增:將第一輪PCR產物稀釋200倍，取I μ L進行第二輪PCR擴增，PCR擴增採用25 μ L反應體系；其中包括:0.25 μ L的 5 U/μ L Taq DNA 聚合酶，2.5 μ L 含 15mmol/L MgCl2 的 10XPCR Buffer, 2 μ L 的 2.5mmol/L dNTP Mixtrue，各 I μ L 的 10 μ mol/L AalF 和 AalR 引物，I yL 的第一輪 PCR 擴增產物稀釋模板，17.25 μ L的ddH20 ；PCR擴增程序:94°C預變性5 min, 20個循環的94°C變性30 s、56°C退火30 s和72°C延伸40 S，最後在72°C延伸10 min ；
(4)取10μ L上述PCR產物，用質量濃度為1.5% 2.0%的瓊脂糖膠電泳分離，電泳緩衝液為1ΧΤΑΕ，電壓為Γ5 V/cm,電泳結束後用溴化乙錠染色，凝膠成像系統分析；在443bp處出現特異條帶，說明小麥籽粒帶有病原鏈格孢菌，反之則不攜帶鏈格孢菌。根據上述的檢測小麥病原鏈格孢菌的方法，所述步驟(4)中瓊脂糖膠的質量濃度為2%，電泳電壓為5 V/cm。本發明積極有益的效果: 我們在河南省小麥黑胚病籽粒上分離了 7個鏈格孢小種，對這些小種和I個標準鏈格抱菌小種進行了測序分析，另外參考的序列還有tenuissima strain EGS34-015 (GenBank 查詢號:AF347032.1UJtemaria a I terna ta strain EGS 34-016(GenBank 查詢號:AF347031 UJtemaria tenuis EU732734.1 (GenBank 查詢號:FJ040178.1)，設計了能特異性鑑定小麥鏈格孢菌的引物，建立了本發明的巢式PCR分子檢測技術。1.本發明特異性引物對小麥病原鏈格孢菌有很強的特異性，能夠區別小麥病原鏈格孢菌與小麥其他主要病原菌麥類根腐離蠕孢菌、小麥白粉菌、禾穀絲核菌、禾穀鐮刀菌、串珠鐮刀菌。2.本發明分子檢測方法操作簡便、快速、特異性強、靈敏度達0.05 ng/yL、可進行相對定量分析，且檢測成本較低，可用於檢測小麥籽粒、根、莖、葉、穗各組織所攜帶的鏈格孢菌，用於小麥鏈格孢菌引起病害顯症之前的早期監測，對於確定病害防治最佳時期具有重要的作用，為防治策略的制定提供科學依據。3.鏈格孢菌和麥類根腐離蠕孢菌是小麥黑胚病的2大主要病原菌，廣泛存在於小麥生產區，在沒有快速、特異性鑑定和相對定量分析病原菌技術的情況下，無法就小麥對這2種病原的專化抗病性進行研究。本發明的建立使小麥抗鏈格孢黑胚病的遺傳和基因定位研究成為可能，有利於推進小麥抗鏈格孢黑胚病遺傳研究和抗病育種工作。本發明正是為了解決我們進行小麥抗鏈格孢黑胚病的遺傳和基因定位研究中遇到的這些問題而攻克的技術難題。
:圖1本發明對不同樣品進行的檢測試驗電泳圖。圖中M為分子量標準DL2000，第廣8泳道分別為鏈格孢菌標準菌株EGS34-016、河南省分離菌株Ta-Aa-1 Ta_Aa_7，第9泳道為麥類根腐離蠕孢菌，第10泳道為小麥白粉菌，第11泳道為禾穀絲核菌，第12泳道為禾穀鐮刀菌，第13泳道為串珠鐮刀菌，第14泳道為彎孢黴，第15泳道為小麥葉片DNA，第16泳道為空白對照水；
圖2本發明對病原鏈格孢菌檢測靈敏度試驗電泳圖。圖中Γ8泳道分別對應的病原鏈格孢菌DNA濃度為 I pg/ μ L、10 pg/ μ L、50 pg/ μ L、100 pg/ μ L、500 pg/ μ L、1 ng/ μ L、10ng/ μ L 和 50 ng/ μ L ；
圖3本發明實施例2對鏈格孢菌葉枯病葉片樣品檢測的電泳圖。圖中f 5泳道分別對應接囷後發病O 4級的葉片樣品，弟6泳道為未接囷的對照葉片樣品；
圖4本發明實施例1對接種鏈格孢菌和自然發病的小麥黑胚病籽粒進行的檢測電泳圖。圖中I 5泳道分別對應接菌收穫的黑胚病級O 4級種子樣品，第6、7泳道為自然發病O級、I級黑胚病籽粒樣品，第8泳道為鏈格孢菌，第9泳道為麥類根腐離蠕孢菌，第10泳道為小麥健康葉片樣品，第11泳道為空白對照水。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明進一步詳細說明，但本發明不限於這些實施例。本發明小麥黑胚病優勢病原鏈格孢菌的檢測引物核苷酸序列為:上遊引物AalF:5' -TATGAAGGCGGGCTGGAA-3'和下遊引物 AalR:5' -TTTGCTGATAGAGAGTGCGAC-3'。利用該引物可以從小麥病原鏈格孢菌上特異性擴增出443 bp的產物。實施例1
上述引物用於小麥籽粒攜帶鏈格孢菌情況分子檢測方法，包括以下步驟:
(I)樣品米集
選取收穫的田間接種鏈格孢菌的小麥籽粒和自然發黑胚病的小麥籽粒，-20°C保存備用。(2)樣品研磨
分別將上述小麥籽粒在滅菌的研缽中研磨，研磨過程中應注意避免樣品的交叉汙染；也可採用組織研磨機研磨:取一粒小麥種子，先粗略捏碎，放入2 mL滅菌離心管中，每管放入一粒直徑5 mm的鋼珠，將離心管放於液氮中預冷，預冷後用組織研磨機30 Hz研磨I min。(3) DNA 提取
①向研磨粉碎好的樣品中加入800μ L的SLS細胞裂解液(陳廣進，李紅葉，張志芳.一種快速提取真菌DNA的SLS裂解液及其應用[P].CN: 200810059177，2008-07-30)，由於種子中含多糖較多，在SLS裂解液中加入佔其體積2%-6%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，再放入65°C水浴鍋中水浴加熱10-15 min，期間輕微搖晃離心管，使樣品裂解液不沉降於管底，以便充分裂解；
②向離心管中加入800μ L的體積比為25:24:1的苯酚、氯仿、異戊醇混合溶劑，輕微搖動I min左右，使之成乳濁狀，即混合均勻；
③在12000r/min下離心10 min,用剪過的槍頭輕輕地吸取上清液600 μι,轉入含有360 μ L異丙醇的1.5 mL離心管中，將離心管慢慢上下搖動30 S，使異丙醇與上清液充分混合；
④室溫下靜置30min或-20°C下10 min沉澱DNA ；
⑤在12000r/min下離心10 min,倒掉液體,注意勿將DNA沉澱倒出；
⑥向離心管中加入ImL的體積濃度為75%的乙醇，上下晃動，用手指輕彈管尖，使DNA沉澱懸浮於乙醇中；
⑦在12000r/min下離心5 min,倒掉液體,重複上一步的操作；
⑧在12000r/min下離心3 min，將管內的液體徹底倒乾淨後，於室溫下自然乾燥
DNA ；
⑨在DNA乾燥後加入40μ L的TE緩衝液，_20°C保存備用。(4) PCR擴增檢測
①第一輪通用引物PCR擴增:
PCR擴增採用25 μ L反應體系，其中包括:0.25 μ L的5 U/μ L Taq DNA聚合酶，2.5μ L 含 15mmol/L MgCl2 的 10XPCR Buffer, 2 μ L 的 2.5 mmol/L dNTP Mixtrue，各 I μ L的 10 μ mol/L ITSl 和 ITS4 引物，I μ L 的 50 ng/ μ L DNA, 17.25 μ L 的 ddH20 ;PCR 擴增程序:95°C預變性5 min ；30個循環的95°C變性30 s、58°C退火30 s和72°C延伸50 S ;最後在 72 延伸 10 min ;ITS1 5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' , ITS4 5' -TCCTCCGCTTATTG-ATATGC-3'(劉春來，文 景芝，楊明秀，李永剛.rDNA-1TS在植物病原真菌分子檢測中的應用.東北農業大學學報，2007，38(1): 101-106)；
②第二輪特異引物PCR擴增:
將第一輪PCR產物稀釋200倍，取I UL進行第二輪PCR擴增；PCR擴增採用25 μ L反應體系，其中包括:0.25 μ L的5 U/μ L Taq DNA聚合酶，2.5 「1^含15臟01/1 MgCl 2的 10XPCR Buffer, 2 μ L 的 2.5 mmol/L dNTP Mixtrue,各 I μ L 的 10 μ mol/L AalF和AalR引物，I μ L的第一輪PCR擴增產物稀釋模板，17.25 μ L的ddH20 ;PCR擴增程序:94°C預變性5 min;20個循環的94°C變性30 s、56°C退火30 s和72°C延伸40 s ;最後在72°C延伸 10 min ；
③電泳檢測
取10 μ L PCR產物，用質量濃度為2%的瓊脂糖膠電泳分離，電泳緩衝液用I X TAE緩衝液，電壓為5 V/cm,電泳結束後用溴化乙錠染色，用凝膠成像系統分析。(5)檢測結果
電泳結果見圖4，田間接菌的小麥籽粒和自然發病的小麥籽粒均帶有鏈格孢菌，O級小麥籽粒雖然表面還未出現黑胚症狀，但經檢測亦存在鏈格孢菌。實施例2
上述引物用於小麥葉片攜帶鏈格孢菌情況分子檢測方法，包括以下步驟:
(I)樣品採集
取加入其體積比0.02%吐溫的鏈格孢菌孢子懸浮液噴灑到一葉一心期的小麥葉片上，對照噴灑無菌水，待葉面晾乾後，加上透明塑料板製成的罩子；每12 h向罩子內側噴灑無菌水以保溼；接菌後第10天取不同發病級別的小麥葉片和正常葉片進行檢測。(2)提取樣品DNA①0.05g發病小麥葉片置於滅過菌的2 mL離心管中，每管放入一粒直徑5 mm的鋼珠，將離心管放於液氮中預冷，預冷後用組織研磨機30 Hz研磨I min;也可在滅過菌的研缽中直接研磨；
②向粉碎好的樣品中加入800UL的SLS細胞裂解液，放入65°C水浴鍋中水浴加熱10-15 min，期間輕微搖晃離心管，使樣品裂解液不沉降於管底，以便充分裂解；
③向離心管加入800μ L的體積比為25:24:1的苯酹、氯仿、異戍醇混合溶劑,輕微搖動I min左右，使之成乳濁狀，即混合均勻；
④在12000r/min下離心10 min ;用剪過的槍頭輕輕地吸取上清液600 μ L,轉入含有360 μ L異丙醇的1.5 mL離心管中，將離心管慢慢上下搖動30 S，使異丙醇與上清液充分混合；
⑤室溫下靜置30min或-20°C下10 min沉澱DNA ；
⑥在12000r/min下離心10 min,倒掉液體,注意勿將DNA沉澱倒出；
⑦向離心管中加入ImL的體積濃度為75%的乙醇，上下晃動，用手指輕彈管尖，使DNA沉澱懸浮於乙醇中；
⑧在12000r/min下離心5 min,倒掉液體,重複上一步的操作；
⑨在12000r/min下離心3 min，將管內的液體徹底倒乾淨後，於室溫下自然乾燥
DNA ； ⑩在DNA乾燥後加入40μ L的TE緩衝液，_20°C保存備用。(3) PCR擴增檢測
①第一輪通用引物PCR擴增:
PCR擴增採用25 μ L反應體系，其中包括:0.25 μ L的5 U/μ L Taq DNA聚合酶，2.5μ L 含 15mmol/L MgCl2 的 10XPCR Buffer, 2 μ L 的 2.5 mmol/L dNTP Mixtrue,各 I μ L的 10 μ mol/L ITSl 和 ITS4 引物，I μ L 的 50 ng/ μ L DNA, 17.25 μ L 的 ddH20 ；PCR 擴增程序:95°C預變性5 min ；30個循環的95°C變性30 s、58°C退火30 s和72°C延伸50 S ;最後在72°C延伸10 min ；
②第二輪特異引物PCR擴增:
將第一輪PCR產物稀釋200倍，取I μ L進行第二輪PCR擴增；PCR擴增採用25 μ L反應體系，其中包括:0.25 μ L的5 U/μ L Taq DNA聚合酶，2.5 「1^含15臟01/1 MgCl2的 10XPCR Buffer, 2 μ L 的 2.5 mmol/L dNTP Mixtrue，各 I μ L 的 10 μ mol/L AalF 和AalR引物，I μ L的第一輪PCR擴增產物稀釋模板，17.25 μ L的ddH20 ;PCR擴增程序:94°C預變性5 min ;20個循環的94°C變性30 s、56°C退火30 s和72°C延伸40 s ;最後在72°C延伸10 min ；
③電泳檢測
取10 μ L PCR產物，用質量濃度為2%的瓊脂糖膠電泳分離，電泳緩衝液用I X TAE緩衝液，電壓為5 V/cm,電泳結束後用溴化乙錠染色，用凝膠成像系統分析。(4)檢測結果
電泳結果見圖3，接菌的小麥葉片均帶有鏈格孢，O級發病的小麥葉片雖然表面未出現發病症狀，但經檢測亦存在鏈格孢菌，而未接菌葉片表面未發病，且PCR檢測亦未檢測到鏈格孢菌的存在。
權利要求
1.一種小麥黑胚病優勢病原鏈格孢菌的檢測引物，其特徵在於:所述引物的核苷酸序列為:上遊引物AalF:5 ' -TATGAAGGCGGGCTGGAA-3 '，下遊引物AalR:5' -TTTGCTGATAGAGAGTGCGAC-3'。
2.權利要求1所述引物在對小麥病原鏈格孢菌的鑑別或檢測中的應用。
3.一種利用權利要求1所述引物檢測小麥病原鏈格孢菌的方法，其特徵在於:包括以下步驟: (1)提取小麥種子或植株上待檢測組織的基因組DNA； (2)以所述DNA為模板用病原真菌通用引物ITSl5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和ITS4 5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'進行第一輪 PCR 擴增:PCR 擴增採用 25 μ L 反應體系，其中包括:0.25 yL的5 U/yL Taq DNA聚合酶，2.5MgCl2的IOXPCRBuffer, 2 μ L 的 2.5 mmol/L dNTP Mixtrue，各 I μ L 的 10 μ mol/L ITSl 和 ITS4 引物，I μ L 的 50 ng/ μ L DNA, 17.25 μ L 的 ddH20 ；PCR 擴增程序:95°C預變性 5 min, 30 個循環的95°C變性30 s、58°C退火30 s和72°C延伸50 S，最後在72°C延伸10 min ； (3)用小麥病原鏈格孢菌特異引物進行第二輪特異性擴增:將第一輪PCR產物稀釋200倍，取I μ L進行第二輪PCR擴增，PCR擴增採用25 μ L反應體系；其中包括:0.25 μ L的 5 U/μ L Taq DNA 聚合酶，2.5 μ L 含 15mmol/L MgCl2 的 10XPCR Buffer, 2 μ L 的 2.5mmol/L dNTP Mixtrue，各 I μ L 的 10 μ mol/L AalF 和 AalR 引物，I yL 的第一輪 PCR 擴增產物稀釋模板，17.25 μ L的ddH20 ;PCR擴增程序:94°C預變性5 min, 20個循環的94°C變性30 s、56°C退火30 s和72°C延伸40 S，最後在72°C延伸10 min ； (4)取10 μ L上述PCR產物，用質量濃度為1.5% 2.0%的瓊脂糖膠電泳分離，電泳緩衝液為1ΧΤΑΕ，電壓為Γ5 V/cm,電泳結束後用溴化乙錠染色，凝膠成像系統分析；在443bp處出現特異條帶，說明小麥籽粒帶有病原鏈格孢菌，反之則不攜帶鏈格孢菌。
4.根據權利要求3所述的檢測小麥病原鏈格孢菌的方法，其特徵在於:所述步驟(4)中瓊脂糖膠的質量濃度為2%，電泳電壓為5 V/cm。
全文摘要
本發明屬於農作物病害檢測技術領域，具體公開了一種小麥黑胚病優勢病原鏈格孢菌的檢測引物及分子檢測方法。本發明設計了一對小麥黑胚病優勢病原鏈格孢菌的檢測引物，其核苷酸序列為上遊引物Aa1F5′-TATGAAGGCGGGCTGGAA-3′，下遊引物Aa1R5′-TTTGCTGATAGAGAGTGCGAC-3′，該特異性引物對小麥病原鏈格孢菌有很強的特異性，能夠區別小麥病原鏈格孢菌與小麥其他主要病原菌；本發明還提供了利用所述特異性引物對小麥不同組織所攜帶鏈格孢菌的分子檢測方法，本分子檢測方法操作簡單方便，快速，靈敏度可達0.05ng/μL，檢測成本較低，可用於檢測小麥籽粒、根、莖、葉、穗各組織所攜帶的鏈格孢菌，具有顯著的現實意義和經濟價值。
文檔編號C12Q1/68GK103088138SQ201310028328
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月25日 優先權日2013年1月25日
發明者牛吉山, 李巧雲, 秦召 申請人:河南農業大學