沙門氏菌rDNA間隔子核酸分子探針及其應用方法

2023-12-01 14:24:41

專利名稱：沙門氏菌rDNA間隔子核酸分子探針及其應用方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學，具體地說就是一種用於檢驗沙門氏菌的生物探針，它可以直接應用於食品衛生檢驗，環境檢測、海關檢疫及醫學臨床中的沙門氏菌檢驗。
屬沙門氏菌的菌種繁多，迄今已發現2000種以上是常見的致病菌。沙門氏菌檢驗是食品衛生和環境檢疫的必檢項目，目前，我國衛生部頒布的沙門氏菌檢驗方法，主要是根據沙門氏菌的形態，生理生化特徵以及血清反應來檢驗定型，其過程複雜、操作繁煩，周期長，並且易與其相接近的細菌發生交叉反應而影響準確性。在現有沙門氏菌檢驗方法中甚至還要使用劇毒試劑(氫化鉀)，對工作人員健康有危害。
迄今為止，中國尚未有任何有關沙門氏菌核酸分子探針的研究和專利發表，但是國際上發達國家都已投入大量資金和人力開展沙門氏菌新的檢驗方法和核酸分子探針的研製。在rDNA核酸分子探針中包括rRNA編碼區探針和非RNA編碼區探針兩類不同的探針。在美國專利VS5147778中公開了一種沙門氏菌rDNA探針，它以rRNA或rDNA中rRNA編碼區序列為探測的目標基因，雖然它建立了一種快速、無毒的沙門氏菌的檢驗方法，但是靈敏度仍不夠高。而尋找專一性更高的探測目標，難度很大，研製探針的難度就更大。美國、日本等研究人員都正在向這一方向發展。但目前，國內外都沒有任何有關的研究報導。
本發明的目的在於克服背景技術存在的不足之處，把以核酸分子探針為基礎的基因檢測和鑑定技術應用於沙門氏菌的檢驗，研製出一種專一性更高的核酸分子探針及其應用方法。由此建立一種快速、準確、無毒又具有高靈敏度的沙門氏菌檢驗新方法。
一種沙門氏菌核酸分子探針，其特徵在於以沙門氏菌rDNA中非RNA編碼區作探測目標基因，設計沙門氏菌rDNA間隔子核酸分子探針，其結構是由23個核苷酸組成，它的核苷酸序列如下5′CGAAGCATACATCAGTATGTTAG 3′。
rRNA及其基因rDNA是研製沙門氏菌核酸分子探針的一個很好的目標基因，在rDNA中存在著rRNA編碼區和非RNA編碼區(即間隔區)，rRNA序列和rDNA中rRNA編碼區序列可以被用來研製沙門氏菌rRNA探針和rDNA探針，而rDNA中非RNA編碼區則可用來研製沙門氏菌rDNA間隔子核酸分子探針。
細菌rDNA間隔區是一個高變區，不同細菌類群的rDNA間隔區結構差別很大，這種差別還可以反映不同細菌之間親緣關係的遠近(即親緣關係越遠，差別越大，反之亦然)。在rDNA間隔區中，存在沙門氏菌與其它非沙門氏菌完全不同的核苷酸序列，即沙門氏菌特徵核苷酸序列，根據該特徵序列建立起的沙門氏菌rDNA間隔子核酸分子探針，具有極高的沙門氏菌專一性。該探針能與沙門氏菌DNA發生專一性反應，但不與其它的非沙門氏菌DNA發生交叉反應，所以可以用於沙門氏菌的鑑定和樣品中沙門氏菌的檢驗。
建立沙門氏菌rDNA間隔子核酸分子探針，首先要對沙門氏菌rDNA間隔子進行分子克隆和DNA序列測定，並且對沙門氏菌屬中不同的菌種分別加以考察，最後根據DNA序列測定和分析的結果，設計和合成沙門氏菌rDNA間隔子核酸分子探針，該探針可以分子雜交或者PCR的方式對待測樣品加以檢驗，如存在沙門氏菌，就出現陽性標誌，如無沙門氏菌，則出現陰性標誌。
根據發明人已測定的沙門氏菌rDNA間隔子核苷酸序列，並與已公開發表的其它非沙門氏菌rDNA序列數據相比較。本發明選擇了五組9種沙門氏菌用於研製沙門氏菌rDNA間隔子核苷酸分子探針。這五組9種沙門氏菌，菌種均來源於廣州市防疫站致病菌室，它們的中文及拉丁文名稱如下甲(A)組甲型副傷寒沙門氏菌(Salmonella paratyphi A)乙(B)組乙型副傷寒沙門氏菌(S.paratyphi B)鼠傷寒沙門氏菌(S.typhi murium)丙(C1)組丙型副傷寒沙門氏菌(S.paratyphi C)田納西沙門氏菌(S.tennessee)丁(D)組傷寒沙門氏菌 (S.typhi)腸炎沙門氏菌 (S.enteritidis)戊(E1)組鴨沙門氏菌(S.anatum)韋太夫雷登沙門氏菌(S.weltevreden)本發明設定的由23個核苷酸組成，其核苷酸序列為5′CGAAGCATACATCAGTATGTTAG 3′的沙門氏菌rDNA間隔子核酸分子探針，可採用任何一種常規DNA合成方法，進行大批量生產，例如可使用已商業化的DNA自動合成儀合成。
本發明研製的沙門氏菌rDNA間隔子核酸分子探針，可以用核酸分子雜交法或常規PCR法對於食品、醫學、環境等各種樣品中的沙門氏菌進行檢驗，該探針僅與沙門氏菌DNA發生專一性反應，而與非沙門氏菌DNA無交叉反應。另外還建立了一種本發明特有的參照引物PCR法。
下面分別介紹上述應用方法(一)、核酸分子雜交法沙門氏菌rDNA間隔子核酸分子探針可以用各種核酸分子雜交的方式(例如點雜交方式)對樣品中的沙門氏菌進行檢驗或者對某一已知細菌加以鑑定。
核酸分子雜交的過程(包括探針的標記和待測樣品的預處理)，按常規的分子生物學方法進行。
以核酸雜交法可以對食品、醫學、環境中的樣品直接檢驗，也可以先將樣品中的沙門氏菌DNA擴增，再加以檢驗，樣品中有非沙門氏菌並不幹擾沙門氏菌rDNA間隔子核酸分子探針對沙門氏菌的專一性檢出。
(二)、常規PCR方法沙門氏菌rDNA間隔子核酸分子探針可以作為一種PCR引物與另一PCR引物配對，例如細菌rDNA通用引物的PCR方式，快速、準確地檢驗樣品中微量的沙門氏菌DNA，樣品中存在其它非沙門氏菌DNA並不幹擾沙門氏菌rDNA間隔子核酸分子探針對沙門氏菌專一性檢出。
以沙門氏菌rDNA間隔子核酸分子探針對沙門氏菌進行PCR檢驗的過程可按照常規PCR操作規程進行。
(三)、參照引物PCR方法採用一對以上專一性不同的引物在同一試管中對同一樣品進行PCR反應，不同的引物擴增放大的目標序列不同，其PCR產物的分子量也按設計有顯著差異。根據一支試管中最終PCR產物的種類，可以判別樣品中是否含沙門氏菌，或其它細菌以及是否無菌。由於不同引物對的PCR產物可以互為參照，所以稱其為參照引物PCR方法。PCR法結果可以瓊脂糖凝膠電泳檢驗。
參照引物PCR法用於沙門氏菌檢驗，其PCR引物選擇設置如下①以細菌rDNA 16S rRNA編碼區3′未端保守區設置一個細菌通用PCR引物，在rDNA中的間隔子設置具有沙門氏菌專一性的另一個引物即沙門氏菌rDNA間隔子核酸分子探針與引物之間的距離為207個核苷酸。
②在細菌rDNA 16S rRNA編碼區5′未端保守區另設置一對細菌類rDNA通用引物，它們之間的距離為950個核苷酸。


圖1為實施例1即採用常規PCR法用沙門氏菌rDNA間隔子核酸分子探針檢驗鼠傷、寒沙門氏菌等五種沙門氏菌的電泳結果。
圖2為實例例2即採用參照引物PCR法用沙門氏菌rDNA間隔子核酸分子探針檢驗的甲型副傷寒沙氏門菌等五種沙門氏菌的電泳結果。
發明效果沙門氏菌rDNA間隔子核酸分子探針及其應用方法的發明，代表了一種對沙門氏菌進行基因鑑定和檢測的新方法，該方法與現行常規方法基於完全不同的原理。新的方法具有簡便快速、準確、靈敏、無毒等優點。可以用來加強或取代我國衛生部頒布的常規沙門氏菌檢驗方法。
與現行沙門氏菌檢驗方法相比，新方法優點如下1、簡便快速常規檢驗操作繁煩，實驗周期長(有時要長達一個星期)，新方法只需要幾個小時(如需要進行菌的擴增，擴增時間除外)。
2、準確沙門氏菌rDNA間隔子核酸分子探針只與沙門氏菌rDNA雜交反應，而不與非沙門氏菌DNA發生交叉反應。
3、靈敏度高沙門氏菌rDNA間隔子核酸分子探針可以與PCR方法聯合使用，沙門氏菌的理論檢出值可達一個細菌。
4、不使用有毒試劑。
實施例11、核酸分子探針和PCR引物的製備①按核苷酸序列為5′CGAAGCATACATCAGTATGTTAG 3，選用DNA自動合成儀，採用常規DNA合成法，合成沙門氏菌rDNA間隔子核酸分子探針。
②沙門氏菌rDNA間隔子核酸分子探針(沙門氏菌專一性)和另三種細菌rDNA PCR通用引物P1486(20個核苷酸長)，P16+(22個核苷酸長)，P16-(22個核苷酸長)，均用DNA自動合成儀合成，溶於TE(Tris-Hcl Tomm，EDTA 1mmPH7.6)溶液，濃度為0.5微克/微升。
2、沙門氏菌rDNA間隔子核酸分子探針檢驗沙門氏菌操作過程(常規PCR方法)①沙門氏菌樣品預處理取1毫升含沙門氏菌(105菌)的培養液放入1.5毫升小指管中，離心(5000轉/分)2分鐘，傾去上清，在小管中加入0.2M氫氧化鈉適量(以溶解菌力度)，立即加入500微升TE溶液(PH7.0)再根據菌數稀釋至1000菌/微升。
②100微升I號PCR混合液中成份沙門氏菌rDNA間隔子核酸分子探針 0.5微克
P1486核酸分子探針 0.5微克10倍Tap DNA聚合酶緩衝劑10微升2mmdNTP溶液10微升Tap DNA聚合酶 2.5單位以無菌水定容為100微升③100微升II號PCR混合液中成份以細菌rDNA PCR通用引物P16s+，P16s-分別代替沙門氏菌rDNA間隔子核酸分子探針和P1486，其它成份同I號PCR混合液。
④PCR操作取9個0.5毫升小指管，1～8管中分別加入1號PCR混合液20微升，然後分別加入鼠傷沙門氏菌等5種沙門氏菌樣以及大腸桿菌樣(對照)。在第9管中加入II號PCR混合液20微升，然後加入大腸桿菌樣(對照)。在各管中加50微升礦物油，放於PCR儀上，按下列程序進行PCR反應94℃5分鐘，94℃、50℃和72℃各1分鐘，並且連續循環30次，然後72℃5分鐘。
反應完後，每管加入5微升載樣液(30％Ficol 0.25％溴酚蘭)。
取4微升點樣於2％的瓊脂糖凝膠中，電泳結果如圖1所示。
圖1表明1、2、121Kb分子量梯度3、鼠傷寒沙門氏菌(相當於40個菌量)4、田納西沙門氏菌(相當於40個菌量)5、無菌水6、腸炎沙門氏菌 (相當於40個菌量)7、鴨沙門氏菌(相當於40個菌量)8、韋太夫雷登沙門氏菌(相當於40個菌量)9、大腸桿菌 (相當於400個菌量)10、大腸桿菌 (相當於40個菌量)11、大腸桿菌 (相當於40個菌量)採用沙門氏菌rDNA間隔子核酸分子探針和P1486組成PCR引物對，鼠傷寒等五種不同的沙門氏菌(3、4、6、7、8號)都可準確檢出(出現207個核苷酸的陽性標誌)而與大腸桿菌(9、10號)無交叉反應。採用P16s+和P16s-組成的PCR引物對，對與10號樣相同的大腸桿菌DNA樣(11號)進行檢驗，作為對照，出現950個核苷酸的陽性標誌，說明有細菌DNA存在。
實施例21、核酸分子探針和PCR引物的製備同實施例12、以沙門氏菌rDNA間隔子核酸分子探針檢驗沙門氏菌操作(參照引物PCR方法)①沙門氏菌樣品預處理同實施例1②100微升III號PCR混合液成份沙門氏菌rDNA間隔子核酸分子探針 0.5微克P1486核酸分子探針 0.5微克P16+核酸分子探針 0.5微克P16-核酸分子探針 0.5微克10倍Tap DNA聚合酶緩衝劑10微升2mmdNTP溶液10微升Tap DNA聚合酶 2.5單位以水定容為100微升③PCR操作取9個0.5毫升小指管，各加入20微升上述PCR混合液，然後分別加入甲型副傷寒沙門氏菌等各種沙門氏菌樣以及大腸桿菌樣或無菌水，每管以50微升礦油蓋面，操作程序同實施例1。電泳結果如圖2所示。
圖2表明1、傷寒沙門氏菌 (相當於40個菌量)2、丙型副傷寒沙門氏菌 (相當於40個菌量)3、傷寒沙門氏菌 (相當於1 00個菌量)4、丙型副傷寒沙門氏菌 (相當於100個菌量)5、乙型副傷寒沙門氏菌 (相當於100個菌量)6、甲型副傷寒沙門氏菌 (相當於100個菌量)7、鼠傷寒沙門氏菌 (相當於40個菌量)8、大腸桿菌 (相當於40個菌量)11、1Kb分子量梯度採用兩對引物即沙門氏菌rDNA間隔子核酸分子探針/P1486和P16+/P16-的參照引物PCR方法，①含沙門氏菌的樣品至少可出現一條207個核苷酸的沙門氏菌陽性標誌，此外，還可以出現另一條950個核苷酸的細菌陽性標誌，但在有的樣品中，950個核苷酸的細菌陽性標誌較弱。②在不含沙門氏菌，但含大腸桿菌的樣品(8號)，僅出現950個核苷酸的細菌陽性標誌。③在無菌樣品中，無任何DNA帶(9號)。
權利要求
1.沙門氏菌核酸分子探針，其特徵在於以沙門氏菌rDNA中非RNA編碼區作探測目標基因，設計沙門氏菌rDNA間隔子核酸分子探針，其結構是由23個核苷酸組成，它的核苷酸序列如下5′CGAAGCATACATCAGTATGTTAG 3′。
2.沙門氏菌rDNA間隔子核酸分子探針的應用方法，其特徵在於本探針用於沙門氏菌檢驗時，採用參照引物PCR法，其應用方法是選擇一對以上專一性不同的引物在同一試管中對同一樣品進行PCR反應，其PCR引物選擇設置如下①以細菌rDNA 16S rRNA編碼區3′未端保守區設置一個細菌通用PCR引物，在rDNA中的間隔子設置具有沙門氏菌專一性的另一個引物即沙門氏菌rDNA間隔子核酸分子探針與引物之間的距離為207個核苷酸。②在細菌rDNA 16S rRNA編碼區5′未端保守區另設置一對細菌類rDNA通用引物，它們之間的距離為950個核苷酸。
全文摘要
本發明涉及分子生物學，是一種用於檢驗沙門氏菌的rDNA間隔子核酸分子探針。它以沙門氏菌的rDNA中非RNA編碼區作探測目標基因，選擇了五組9種沙門氏菌作研製材料，採用常規DNA合成法合成，其結構是由23個核苷酸組成，它的核苷酸序列為「5′CGAAGCATACATCAGTATGTTAG 3′」。本探針可用核酸分子雜交法、常規PCR法和參照引物PCR法對於食品、醫學、環境等各種樣品中的沙門氏菌檢驗，具有簡便、快速、準確、靈敏、無毒等優點。
文檔編號C12Q1/68GK1131194SQ9510260
公開日1996年9月18日 申請日期1995年3月10日 優先權日1995年3月10日
發明者周惠, 屈良鴣 申請人:華南理工大學