一種高產g418工程菌及其構建方法與應用的製作方法

2023-12-01 15:15:41

一種高產g418工程菌及其構建方法與應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種高產G418工程菌及其構建方法與應用，屬於抗生素製藥領域。高產G418工程菌為編碼C-6』羥基氧化還原酶的基因genQ功能缺失的棘孢小單孢菌ΔgenQ，其保藏編號為CCTCCNO：M2013729。其構建方法為通過同框敲除的方法缺失棘孢小單孢菌中的基因genQ，包括genQ基因同框敲除質粒的構建、同框敲除質粒轉化棘孢小單孢菌和雙交換突變株的篩選。本發明利用同框敲除技術對慶大黴素產生菌棘孢小單孢菌中的genQ基因進行缺失，以阻斷慶大黴素C組分及其相關中間產物的合成，使其主要產生G418。本發明ΔgenQ的G418產量和純度高，簡化了生產G418的生產工藝，降低了生產成本。
【專利說明】—種高產G418工程菌及其構建方法與應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於抗生素製藥領域，涉及一種高產G418工程菌及其構建方法與應用。
【背景技術】
[0002]G418 (Geneticin)是由紅澄小單抱菌(Micromonospora rhodorangea)產生的一種結構與新黴素、慶大黴素和卡那黴素相似的氨基糖苷類抗生素，其化學結構式如下式所示。在分子遺傳學中，G418是穩定轉染最常用的抗性篩選試劑。近年來，G418還被廣泛應用於去除細胞培養中沾染的成纖維細胞。最新研究報導，G418及其衍生物可以用於治療無
義突變引起的人類遺傳性疾病以及具有抑制病毒功效。
【權利要求】
1.一株高產G418工程菌，其特徵在於:為編碼C-6』羥基氧化還原酶基因genQ功能缺失的棘孢小單孢菌。
2.根據權利要求1所述的高產G418工程菌，其特徵在於:為棘孢小單孢菌AgenQ，保藏編號為 CCTCC NO:M 2013729。
3.權利要求1或2所述的高產G418工程菌的構建方法，其特徵在於包括以下步驟: (1)genQ基因同框敲除質粒的構建 構建含有棘孢小單孢菌基因genQ的上下遊同源交換臂的鏈黴菌-大腸桿菌重組穿梭質粒; (2)同框敲除質粒轉化棘孢小單孢菌 採用疋coli ET12567/pUZ8002介導的接合轉移方法，將上述構建的重組穿梭質粒導入野生型的棘孢小單孢菌中，得到接合轉移子； (3)雙交換突變株的篩選 根據抗性表型篩選在DNA水平上發生兩次同源重組的供敲除突變株，得到高產G418工程菌。
4.根據權利要求3所述的高產G418工程菌的構建方法，其特徵在於:步驟(1)中所述的上下遊同源交換臂為各2000 bp左右。
5.根據權利 要求3所述的高產G418工程菌的構建方法，其特徵在於:步驟(1)中所述的重組穿梭質粒為PYH7。
6.根據權利要求3所述的高產G418工程菌的構建方法，其特徵在於步驟(1)具體為:使用如下引物PCR擴增野生型棘孢小單孢菌中基因上下遊同源臂片段，再通過酶切和酶連，將上下遊同源臂片段克隆到PYH7上，得到基因同框敲除質粒； 左臂上遊引物 L1:5』 -CTGCATATGCTCACCGCCCGGC-3』， 左臂下遊引物 L2:5』 -CCCGAATTCTCCCTGTGACCTGTCG-3』 ； 右臂上遊引物 Rl:5』 -ACCGAATTCGCCGCTACCGATCACAC-3』， 右臂下遊引物 R2:5』 -GGCAAGCTTGATCGGAACCATCCGG-3』。
7.權利要求1或2所述的高產G418工程菌在生產G418中的應用。
8.權利要求1或2所述的高產G418工程菌在合成抗菌藥物中的應用。
【文檔編號】C12R1/01GK103667162SQ201410004713
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2014年1月6日 優先權日:2014年1月6日
【發明者】孫宇輝, 郭俊紅, 鄧子新 申請人:武漢大學