一種多功能免疫晶片及其製法和在免疫檢測中的應用的製作方法

2023-12-02 00:45:11 1

專利名稱：一種多功能免疫晶片及其製法和在免疫檢測中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種多功能免疫晶片以及一種用該晶片以CdTe量子點為光學或電化學 標記物的免疫檢測方法。
背景技術：
在免疫晶片的研究領域，在固體載體上保持所固定的生物分子的活性與穩定性是一 個長期存在的目標。在所發展的多種固定方法上，自組裝法可以有效地控制其物理與化 學性質，因此，可對生物分子選擇性固定、有效地消除非特異性結合。金膠納米粒子已 經廣泛地應用於生物分子的固定基質，[參見(a) K. R. Brown， A. P. Fox, M. J. Natan. J v4肌C7ze肌1996， //S， 1154-1157. (b) I. Willner, N. Lapidot， A. Riklin, R. Kasher, E. Zahavy, E. Katz. 爿m. C/2e肌Soc. 1994, 1428-1441. (c) M. Dequarie, C. Degrand, B. Limoges. j a/. CTzew. 2000， 72, 5521-5528.]。但是金納米粒子自組裝在銦錫氧化物半導體 透明導電膜(ITO)上同時用於光學與電化學免疫晶片還未見報導。
量子點(quantum Dots,以下簡稱QDs)是一種具有優良的光譜特徵和光化學穩定性 半導體納米晶體，因其具有發光效率高、寬的激發譜線範圍、窄的發射譜線、粒徑與生 物分子相近、表面修飾的多功能化，利用量子點作為生物螢光探針，在免疫生物學和臨 床檢驗學等研究中將會有廣闊的應用前景[參見(d) k. Jaiswal J， H. Mattoussi， J. M. Mauro， S. M. Simon, Ato.歷o/ec/wo/. 2003， 2/, 47-51. (e) J. K. Jaiswal, S. M. Simon， 7Vemfc Ce//. 2004， ", 497-504. (f) B. Ballou, B. C. Lagerholm， L. A. Ernst, M. P. Bruschez， A. S. Waggoner,2004，/5, 79-86.〗。 一系列量子點，如CdS、 PbS、 CuS、 ZnS因其具有固有的小型化、高靈敏性、低消耗等優良的特性，在電化學免疫分析中也 具有一定的應用前景[參見(g) J. A. Hansen, R. Mukhopadhyay,丄Hansen, K. V. Gothelf， / Zm. Cte肌5bc. 2006， 3860-3861. (h) J. A Hansen,. J. Wang, A,N. Kawde， Y. Xiang, K. V. Gothelf, G. Collins, / 力肌C7je肌Soc. 2006， 2228-2229. (i) G. Liu，丄Wang, J. Kim， M. R. Jan, j"a/. CAew. 2004， 76, 7126-7130. (j) J. Wang, G. Liu, A. Merkoci, ^肌Cte肌 Soc. 2003， 725, 3214-3215.]。目前，利用CdTe量子點同時作為電化學與光學免疫分析探 針還未見報導。

發明內容
本發明的目的是提供一種多功能免疫晶片，用該晶片以CdTe量子點作為光學或電 化學標記物的免疫檢測方法。 本發明的技術方案如下
一種多功能免疫晶片，它是在銦錫氧化物半導體透明導電膜(ITO)上吸附有金膠 納米粒子，再在其表面上覆蓋有留有空洞的聚二甲基矽氧垸(PDMS)矽橡膠，上述的 空洞區域為免疫反應區域。
一種上述多功能免疫晶片的製法，它由下列步驟組成
步驟l.將銦錫氧化物半導體透明導電膜(ITO)依次經過丙酮、乙醇、水超聲清洗，
然後在h l的乙醇與lM的NaOH混合溶液裡超聲15分鐘或者在l:l:5 (v/v)
H2O2(30%)/NH4OH(30%)/ 1120混合溶液中浸泡1小時；
步驟2.將步驟1衝洗乾淨的ITO浸在質量百分比濃度為0.05%-0.5%的聚二烯丙基
二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)的水溶液中20分鐘或者是浸在質量百分比濃度為1%-5%的
矽烷偶聯劑KH550的水溶液中5-10小時，然後把清洗乾淨的ITO浸入粒徑為20 nm左
右的金膠溶液裡20分鐘；
歩驟3.將步驟2的ITO晶片清洗乾淨，經氮氣吹乾後，把一個2-3mm厚的、中間
開有一個直徑為4-6 mm圓形空洞的聚二甲基矽氧烷(PDMS)片粘貼在ITO晶片表面
上，即製得本發明的多功能免疫晶片，所述的PDMS片上的圓形空洞為免疫反應區域。
一種用本發明的多功能免疫晶片的免疫檢測方法，它由下列歩驟組成
步驟l.把1(^L濃度為0.4-lmg/mL的羊抗人IgG抗體滴於多功能免疫晶片的免疫 反應區域，將其置於4'C、飽和的溼度環境下，反應12-18小時，然後用50mM的PBS 緩衝液與吐溫-20的混合溶液清洗，其中吐溫-20在PBS中的質量百分濃度為0.05%，幹 燥後的晶片浸入質量百分濃度為3-5%的脫脂奶粉室溫封閉1-2小時，
歩驟2.將步驟1所得的晶片清洗後再滴入10 //L要檢測的樣品(人的IgG)，在 37'C下溫育50分鐘。然後再滴入CdTe量子點-鼠抗人IgG抗體結合物進行反應， 經過50分鐘的溫育以後，完全清洗後的晶片進行下一步的測試，
步驟3.光學檢測方法用凝膠成像體系檢測步驟2得到的晶片上量子點的螢光強 度，光強度可用Quantity One軟體計算，其響應與每個晶片所測的抗原(人的IgG)的
濃度成線性關係(在0.1-500ng/mL範圍內)。
上述的多功能免疫晶片的免疫檢測方法，所述的步驟3可以用下列步驟替代 步驟3.溶出伏安檢測方法將步驟2得到的晶片上的CdTe量子點用100 //L濃度 為0.10M的HNO3溶液超聲溶解，使CcP釋放出來，然後把其溶液移入900^L濃度為 0.2 M、 pH為4.6的醋酸緩衝溶液中，然後採用方波溶出伏安法測定Cdh的濃度，其濃 度與晶片上所測的抗原(人的IgG)的量成線性關係。所述的方波溶出伏安法是以玻碳 電極為工作電極、Pt電極為對電極、甘汞電極為參比電極的三電極體系，電化學過程包 括在0.6V預處理1分鐘，在-1.00V處富集10分鐘，然後以4mV的電位階躍、25 Hz 的頻率、25 mV的振幅從-1.00 V至lJ-0.45 V進行伏安掃描。
本發明的多功能免疫晶片經原子力顯微鏡(AFM)測定，結果表明有序的金膠納米 粒子均勻的吸附在ITO上(見圖la)。羊抗人IgG抗體也均勻的吸附在金膠納米粒子 上(見圖lb)。光學檢測方法表明抗原濃度在0.1到500 ng/mL範圍內，晶片的螢光強 度隨著濃度的增大而增大，檢測限達到0.03ng/mL。溶出伏安檢測方法表明抗原濃度範 圍在0.005~100 ng/mL，伏安峰電流隨著抗原濃度的增大而增大，成線性關係，檢測限 達至U 1.5pg/mL
本發明的多功能免疫晶片對於光學檢測方法和電化學檢測方法都表現出了優良的 準確性、高靈敏性與重現性，此晶片可用於實際樣品的檢測。另外，採用凝膠成像技術 的光學免疫分析檢測迅速、方便，而電化學檢測方法更加靈敏。


圖1 (a)為本發明的多功能免疫晶片的原子力顯微鏡(AFM)表徵結果；(b)為 本發明的羊抗人IgG抗體固定在本發明的多功能免疫晶片上後的原子力顯微鏡(AFM) 的表徵結果。
圖2採用凝膠成像技術，在檢測範圍內， 一系列不同濃度的人的IgG (0、 0.1、 1.0、 10、 100、 500ngmL'1)的光學免疫分析結果，及標準曲線；
圖3採用溶出伏安檢測方法，在檢測範圍內， 一系列不同濃度的人的IgG(O、 0.005、 0.01、 0.1、 1.0、 10、 50、 lOOngml/1)的電化學免疫分析結果及標準曲線。
具體實施例方式
實施例1.多功能免疫晶片的製備及免疫檢測
首先ITO (江蘇省金壇康達克應用薄膜中心提供，下同)依次經過丙酮、乙醇、水 超聲清洗後，在l: l的乙醇與lM的NaOH混合溶液裡超聲15分鐘。然後將衝洗乾淨的ITO 浸在質量百分濃度為0.05% PDDA的水溶液中20分鐘，然後把清洗乾淨的ITO浸入20 nm 左右的金膠溶液(上海華美生物工程公司提供，下同)中20分鐘，其形貌見圖la。清洗 乾淨的ITO晶片經氮氣吹乾後，把一個3mm厚的PDMS (Sylgard 184， Dow Coring提供， 前聚物與固化劑比例為10: 1 ，下同)粘在ITO晶片上，PDMS上有個直徑為6mm的 圓形空洞作為免疫反應區域，即得本發明的多功能免疫晶片。
將10^L 0.4 mg/mL羊抗人IgG抗體滴入多功能免疫晶片上，將其置於4'C飽和的溼 度環境反應12小時，然後用含有質量百分比濃度為0.05%吐溫-20的PBS (50mM)緩 衝液清洗，其形貌見圖lb。乾燥後的晶片浸入3。/。的脫脂奶粉25'C封閉1小時，清洗後 再滴入10/zL要檢測的樣品(人的IgG)，在37'C下溫育50分鐘。抗體與抗原反應後， 與10 CdTe QDs -鼠抗人IgG抗體結合物(武漢珈源量子點開發技術有限公司提供， 下同)反應。經過50分鐘的溫育以後，完全清洗後的晶片可用於光學與電化學檢測。
晶片用光學檢測用凝膠成像體系檢測上述得到的晶片上量子點的螢光強度，光強 度可用Quantity One軟體計算，其響應與每個晶片所測的抗原(人的IgG)的濃度成線 性關係(在0.1-500ng/mL範圍內)。
晶片用電化學檢測將上述得到的晶片上的CdTe量子點用100 濃度為0.10 M 的HN03溶液超聲溶解，使C(^+釋放出來，然後把其溶液移入900 濃度為0.2 M、 pH 為4.6的醋酸緩衝溶液中，然後採用方波溶出伏安法測定Cd^的濃度，其濃度與晶片上 所測的抗原(人的IgG)的量成線性關係。所述的方波溶出伏安法是以玻碳電極為工作 電極、Pt電極為對電極、甘汞電極為參比電極的三電極體系，電化學過程包括在0.6V預 處理1分鐘，在-1.00 V處富集10分鐘，然後以4 mV的電位階躍、25 Hz的頻率、25 mV 的振幅從-1.00 V到-0.45 V進行伏安掃描。
實施例2.多功能免疫晶片的製備及免疫檢測
將實施例1的"1: 1的乙醇與1M的NaOH混合溶液裡超聲15分鐘"改為"浸泡 在1:1:5 (v/v) H2O2(30%)/NH4OH(30%)/H2O混合溶液1小時"，"3mm厚的PDMS"改為 "2mm厚的PDMS"， "6mm的圓形空洞"改為"4mm的圓形空洞"，製備的其他條件 同實施例l，得到形貌與性質類似於實施例1的晶片。免疫檢測結果同實施例l。
實施例3.多功能免疫晶片的製備
將PDDA的濃度改為0.5%,製備的其他條件同實施例1，得到形貌與性質類似於 實施例1的晶片。免疫檢測結果同實施例1。 實施例4.多功能免疫晶片的製備
將"PDDA溶液浸泡20分鐘"改為"質量百分比濃度1%KH550的水溶液中浸泡5 小時"，製備的其他條件同實施例1，得到形貌與性質類似於實施例1的晶片。免疫檢測 結果同實施例l。
實施例5.多功能免疫晶片的製備及免疫檢測
將"PDDA溶液浸泡20分鐘"改為"質量百分比濃度1% KH550的水溶液中浸泡 IO小時"，製備的其他條件同實施例1，得到形貌與性質類似於實施例1的晶片。免疫 檢測結果同實施例1。
實施例6.多功能免疫晶片的製備及免疫檢測
將"PDDA溶液浸泡20分鐘"改為"質量百分比濃度5% KH550的水溶液中浸泡5 小時"，製備的其他條件同實施例1，得到形貌與性質類似於實施例1的晶片。免疫檢測 結果同實施例l。
實施例7.多功能免疫晶片的製備及免疫檢測
將"10/iL0.4mg/niL羊抗人IgG抗體滴入ITO晶片上"改為"10^L 1.0mg/mL羊 抗人IgG抗體"，製備的其他條件同實施例l，得到形貌與性質類似於實施例1的晶片。 免疫檢測結果同實施例l。
實施例8.多功能免疫晶片的製備及免疫檢測
將"置於4'C飽和的溼度環境反應12小時"改為"置於4'C飽和的溼度環境反應 16小時"製備的其他條件同實施例1,得到形貌與性質類似於實施例1的晶片。免疫 檢測結果同實施例l。
實施例9.多功能免疫晶片的製備及免疫檢測
將3%的脫脂奶粉改為5%，製備的其他條件同實施例I，得到形貌與性質類似於實 施例1的晶片。免疫檢測結果同實施例1。
實施例10.多功能免疫晶片的製備及免疫檢測
將封閉1小時改為封閉2小時，製備的其他條件同實施例l,得到形貌與性質類似 於實施例1的晶片。免疫檢測結果同實施例1。
權利要求
1.一種多功能免疫晶片，其特徵是它是在銦錫氧化物半導體透明導電膜上吸附有金膠納米粒子，再在其表面上覆蓋有留有空洞的聚二甲基矽氧烷矽橡膠。
2. —種製備權利要求1所述的多功能免疫晶片的方法，其特徵是它由下列步驟組成步驟l.將銦錫氧化物半導體透明導電膜依次經過丙酮、乙醇、水超聲清洗，然後在1: l的乙醇與濃度為lM的NaOH混合溶液裡超聲15分鐘或者在體積比為l:l:5的濃度為30M的H2O2溶液/濃度為30o/。的NH4OH溶液/H2O混合溶液中浸泡l小時；步驟2.將步驟1衝洗乾淨的銦錫氧化物半導體透明導電膜浸在質量百分比濃度為 0.05%-0.5%的聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽的水溶液中20分鐘或者是浸在質量百分比濃 度為1%-5%的矽烷偶聯劑KH550的水溶液中5-10小時，然後把清洗乾淨的銦錫氧化物 半導體透明導電膜浸入粒徑為20 nm的金膠溶液裡20分鐘；歩驟3.將步驟2的銦錫氧化物半導體透明導電膜清洗乾淨，經氮氣吹乾後，把一 個2-3 mm厚的、中間開有一個直徑為4-6 mm圓形空洞的聚二甲基矽氧烷矽橡膠粘貼在 銦錫氧化物半導體透明導電膜晶片表面上，即製得本發明的多功能免疫晶片。
3. —種用權利要求1所述的多功能免疫晶片的免疫檢測方法，其特徵是它由下列步 驟組成步驟l.把1(^L濃度為0.4-lmg/mL的羊抗人IgG抗體滴於多功能免疫晶片的免疫 反應區域，將其置於4"飽和溼潤的環境，反應12-16小時，然後用濃度然後用50mM 的PBS緩衝液與吐溫-20的混合溶液清洗，其中吐溫-20在PBS中的質量百分濃度為 0.05%，乾燥後的晶片浸入質量百分濃度為3-5%的脫脂奶粉室溫封閉1-2小時，步驟2.將步驟1所得的晶片清洗後再滴入要檢測的樣品，在37'C下溫育50 分鐘。然後再滴入lO^L CdTe量子點-鼠抗人IgG抗體結合物進行反應，經過50分鐘的 溫育以後，完全清洗後的晶片進行下一步的測試，步驟3.光學檢測方法用凝膠成像體系檢測步驟2得到的晶片上量子點的螢光強 度，光強度可用Quantity One軟體計算，其響應與每個晶片所測的抗原的濃度成線性關 系。
4. 根據權利要求3所述的多功能免疫晶片的免疫檢測方法，其特徵是所述的步驟 3可以用下列步驟替代 步驟3.溶出伏安檢測方法將步驟2得到的晶片上的CdTe光量子用100 //L濃度 為0.10M的HNO3溶液超聲溶解，使Cc^+釋放出來，然後把HNO3溶液移入卯0^L濃 度為0.2 M、 pH為4.6的醋酸緩衝溶液中，然後採用方波溶出伏安法測定CcP+的濃度， 其濃度與晶片上所測的抗原的量成線性關係。
全文摘要
一種多功能免疫晶片，它是在ITO上吸附有金膠納米粒子，再在其表面上覆蓋有留有空洞的PDMS，上述的空洞區域為免疫反應區域。本發明的多功能免疫晶片可用於免疫檢測把10μL濃度為0.4-1mg/mL的羊抗人IgG抗體滴於多功能免疫晶片上，將其置於溼潤的環境，4℃過夜，然後用含有0.05％的吐溫-20的50mM的PBS緩衝液清洗，乾燥後的晶片浸入3-5％的脫脂奶粉室溫封閉1-2小時，清洗後再滴入10μL要檢測的樣品(人的IgG)，在37℃下溫育50分鐘。然後再滴入10μL CdTe量子點-鼠抗人IgG抗體結合物進行反應，經過50分鐘的溫育以後，完全清洗後的晶片進行光學檢測晶片上的量子點的螢光強度，其響應與每個晶片所測的人的IgG的濃度成線性關係(在0.1-500ng/mL範圍內)。本發明公開了多功能免疫晶片的製法。
文檔編號G01N33/52GK101109749SQ20071002558
公開日2008年1月23日 申請日期2007年8月7日 優先權日2007年8月7日
發明者崔榮靜, 朱俊傑 申請人:南京大學