用於製備抗血管生成、抗腫瘤侵襲和轉移藥物的土貝母苷乙的製作方法

2023-12-01 13:57:41 3

專利名稱：用於製備抗血管生成、抗腫瘤侵襲和轉移藥物的土貝母苷乙的製作方法
背景技術：
抗腫瘤藥物有沒有新靶點，是判斷該藥物有沒有開發前景的一個很重要的標誌。原發腫瘤的生長和轉移有賴於新生血管生成。腫瘤既可通過腫瘤血管從宿主獲取營養和氧氣，又可通過腫瘤血管源源不斷地向宿主輸送轉移瘤細胞，並在機體其他部位繼續生長和誘導血管生成，導致腫瘤轉移。異常活躍的血管發育是惡性腫瘤生長的一個重要條件。成年人的血管內皮細胞基本上是靜止的，而腫瘤的血管系統都在迅速增殖，腫瘤組織中內皮細胞的周轉率是成人脈管系統內皮細胞的50倍，處於高度生長狀態的腫瘤血管內皮細胞遂成為突出目標；腫瘤血管細胞是從正常組織進入腫瘤的正常細胞，基因組穩定，不象基因組極不穩定的癌細胞那樣容易產生多種抗藥性；儘管各種腫瘤細胞差異極大，其血管細胞因為是正常細胞，差異較小，同一藥物如果針對腫瘤血管則可能對不同腫瘤均有療效。鑑於上述3點理由，腫瘤的血管系統已經成為一個嶄新的、有希望的抗腫瘤治療靶點，抗血管生成療法(antiangiogeneasis therapy)業已成為重要的腫瘤治療策略(therapy strategies)之一。能破壞或抑制血管生成，有效阻止腫瘤生長和轉移的腫瘤新生血管生成(tumor angiogenesis)抑制劑，是當今新型抗腫瘤藥物研究開發最活躍的領域之一。腫瘤新生血管生成抑制劑治療具有下述優勢(1)腫瘤發生時，血管形成已被啟動，故具有良好的特異性；(2)血管內皮細胞暴露於血流中，藥物能直接發揮作用，故劑量小、療效高、副作用少；(3)內皮細胞基因表達相對穩定、不易產生耐藥性。在腫瘤血管新生過程中，血管生成的開關通路與血管生成中正負調控因子的平衡有關。在正調控因子中，血管內皮生長因子(VEGF)等起著重要的促進作用，而血小板反應蛋白(TBS)、血管抑制素(angiostatin)和內皮抑制素(endostatin)等則屬血管生成的負調控因子。另外，一氧化氮(NO)在VEGF誘導的血管生成和血管高通透性中起著關鍵作用。
目前已有30多種腫瘤新生血管生成抑制劑分別在進行臨床前和臨床研究。抑制內皮細胞增殖/轉移的有TNP-470，血管抑制素，內皮抑制素，linomide，金雀異黃素IFN，蘇拉明，抗血管生成生長因子或其受體的抗體，血小板刺激素，血管抑制素類固醇等；抑制蛋白水解酶的有TIMPS，金屬蛋白酶抑制劑，源於軟骨的抑制劑，纖維蛋白溶酶原，激活子抑制劑，美滿黴素，四環素等；抑制血管形成及誘導凋亡的αvβ3整聯蛋白抑制劑vataxin，17E6，環狀多肽及其類似物，IFN，血管抑制素，內皮抑制素等。
進入I-III期臨床實驗的腫瘤新生血管生成抑制劑大致可分為五大類a、抑制基底膜降解的腫瘤新生血管生成抑制劑，如金屬蛋白酶抑制劑AG3340、Marimastat(BB-2561)、Bay12-9566、Neovastat等；b、直接抑制內皮細胞增殖的腫瘤新生血管生成抑制劑，如TNP-470、Angio-statin、Endostatin和PF4等；c、抑制血管生長因子活化的腫瘤新生血管生成抑制劑，如VEGF單抗、VEGF-毒素偶合物、VEGFR單抗、SU-5416、Ribozyme等；d、抑制內皮細胞特異性整合素/生存信號的腫瘤新生血管生成抑制劑，如整合素αvβ3、單抗(Vi-taxin)和αvβ3小分子拮抗劑(EDM121974)等；以上四類藥物是特異性抑制劑，能特異性地抑制腫瘤血管內皮細胞；e、非特異性抑制劑，即對內皮細胞和腫瘤細胞都有抑制作用的腫瘤新生血管生成抑制劑、如碳氧氨咪唑(Carboxyaminoinidazole，CAI)、Suramin、IL-12和IFNα-2a等。
近年來，我國的科技工作者也開始進行腫瘤新生血管生成抑制劑的尋找和研究工作，取得了一些進展，如中國科學院上海藥物研究所發現來源於天然產物的新化合物PAA、DYB、ZH-1等具有抑制新生血管形成作用，中山大學正在研製的內皮抑素已進入I期臨床。
美國基因技術研究所的科學家在1989年成功克隆血管內皮生長因子(VEGF)，1993年又製造出VEGF的抗體Avastin。Avastin是一種抗血管生成的新型抗癌藥，其作用機制是抑制新生血管生成，從而阻斷腫瘤生長的血液供應，抑制腫瘤生長與轉移。與傳統化療藥物結合使用，可延長結腸癌患者的生存期，這種「餓死腫瘤」的療法被美國《科學》雜誌評為2003年十大科學突破。
腫瘤侵襲、轉移是一個多步驟的生物學過程，大體上可分為三基本步驟原發灶侵襲、轉移細胞通過與基底膜表面整合素、非整合素受體等結合而粘附其上；釋放多種基質蛋白酶，降解由細胞間質與基底膜組成的細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的成分，打破ECM的動態平衡；穿越ECM破損處，侵入局部血管、淋巴管，在遠端位突破毛細形成「種子」，長出新生血管，供給瘤體營養，最終形成新侵襲、轉移灶。此三個基本步驟可循環反覆、不斷演進。因此，抗粘附、抗運動和抑制基質蛋白酶活性的化合物均可抑制惡性細胞的侵襲和轉移。侵襲和轉移是惡性腫瘤最重要的惡性行為和治療的主要障礙，控制惡性腫瘤的侵襲和轉移成為惡性腫瘤患者預後的關鍵因素。然而，迄今為止還沒有一種理想的抗惡性腫瘤侵襲和轉移的藥物可資臨床應用。
腫瘤的發生發展是多基因改變的結果。包括原癌基因的激活和抑癌基因的失活。腫瘤的轉移與腫瘤的發生發展是兩個既相關又各自獨立的生物學過程，腫瘤的轉移受自身具有正向作用的轉移基因和具有負向作用的轉移抑制基因調控，前者的激活和後者的失活均可誘發腫瘤的轉移。腫瘤相關基因表達的變化在腫瘤轉移中的作用已引起廣泛的重視。
土貝母苷乙是從中藥土貝母中分離出來的一種單體有效成分，分子式為C63H98O30，分子量為1334，化學結構見圖1。它與土貝母苷甲的區別是土貝母苷甲苷元16位碳上是氫，而土貝母苷乙苷元16位碳上是羥基。土貝母苷乙與苷甲一樣，水溶性好、穩定性強，唯得率較苷甲低(土貝母苷乙為0.5％，土貝母苷乙為1.8％)。這裡所謂含土貝母苷乙的土貝母皂苷是指含土貝母苷乙和土貝母苷甲、但不含土貝母苷丙的土貝母中的皂苷組分，它的製備工藝簡單易行，得率也較高，約2.2％。土貝母苷乙或含土貝母苷乙的土貝母皂苷的提取方法參見文獻(王永清、於立堅等陝西新醫藥，1055，1981；Kaisai R，Miyakoshi M，Nie RL，et al.Saponins from Bolbostemmacyclicbisdesmosides，tubeimosides II and III.Phytochem，1998，271439.)。
發明概要本發明涉及土貝母苷乙或含土貝母苷乙的土貝母皂苷用於製備抗血管生成、抗腫瘤侵襲和轉移的藥物的用途。
本發明涉及土貝母苷乙或含土貝母苷乙的土貝母皂苷作為製備抗血管生成、抗腫瘤侵襲和轉移的藥物，該藥物包括土貝母苷乙或含土貝母苷乙的土貝母皂苷及可藥用的載體。
本發明涉及如權利要求1所定義的藥物的製備方法，該藥物包括土貝母苷乙或含土貝母苷乙的土貝母皂苷和/或可藥用的載體。
土貝母苷乙或含土貝母苷乙的土貝母皂苷可與任何可藥用的載體混合或溶解，如經皮膚、黏膜、胃腸內和胃腸外給藥的可藥用載體。該藥物以常規藥用製劑的形式使用，如固體形式的片劑、顆粒劑、粉劑、膠囊劑、扁囊劑、拴劑等，或半固體形式的油膏、軟膏等，或液體形式的針劑、懸浮劑、糖漿劑、乳劑、搽劑等。該藥物中使用可藥用的賦形劑和添加劑，這些可藥用的賦形劑和添加劑包括無毒的可相容的填料、粘合劑、崩解劑、緩衝劑、防腐劑、抗氧化劑、潤滑劑、矯味劑、增稠劑、著色劑、乳化劑、穩定劑等。如乳糖、檸檬酸、硬脂酸、硬脂酸鎂石膏粉、蔗糖、玉米澱粉、滑石粉、明膠、瓊脂、果膠、花生油、可可脂、乙二醇、葡萄糖、鹽酸普魯卡因、鹽酸利多卡因、抗壞血酸等。該藥物可按各種製劑的常規工藝製備。
本發明涉及土貝母苷乙或含土貝母苷乙的土貝母皂苷作為製備抗血管生成，抗腫瘤生長、侵襲和轉移的藥物，可作為食品添加劑、化妝品添加劑加入到食品或化妝品中。
本發明涉及土貝母苷乙或含土貝母苷乙的土貝母皂苷作為製備抗血管生成，抗腫瘤生長、侵襲和轉移的藥物，可用於各種實體形腫瘤，如食道癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、結腸癌、直腸癌、宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、鼻煙癌、口腔癌、唇癌、皮膚癌、膀胱癌、絨毛膜上皮癌、腮腺瘤、淋巴瘤、骨瘤、黑色素瘤和各種顱內腫瘤等。所製成的各種口服藥物中土貝母苷乙或含土貝母苷乙的土貝母皂苷的含量為每日每kg體重大約0.001-100mg，優選約0.01-50mg，更優約0.05-30mg，最佳約0.1-10mg。每日分2-4次服用，10-30天為一療程，一般用藥3-6個療程，每個療程間隔10-30天。所製成的注射用藥物，可供肌肉注射或靜脈點滴，其中土貝母苷乙或含土貝母苷乙的土貝母皂苷的含量為每日每kg體重0.001-50mg，優選約0.01-25mg/kg，更優約0.05-15mg，最佳約0.1-3mg。每日分1-3次使用，10-30天為一療程，一般用藥3-6個療程，每個療程間隔10-30天。然而，精確的劑量應由醫生確定，主要取決於病人的年齡、體重、病情、反應等。
下面列舉的實驗研究結果，作為土貝母苷乙或含土貝母苷乙的土貝母皂苷可用於製備抗血管生成、抗腫瘤侵襲和轉移的藥物的證據。
1.土貝母甘乙對人臍靜脈內皮細胞ECV-304增殖及凋亡的影響1.1材料和方法1.1.1土貝母苷乙準確稱取土貝母苷乙，用滅菌去離子水溶解後過濾除菌，-20℃低溫保存備用。
1.1.2細胞株和細胞培養人臍靜脈內皮細胞株ECV-304，以含10％滅活新生小牛血清、100kU/ml青黴素、100ug/ml鏈黴素的RPMI-1640培養基，在37℃、5％CO2、飽和溼度條件下培養。以0.25％胰酶-0.02％EDTA消化細胞，2～3天傳代一次，取對數生長期細胞進行實驗。
1.1.3細胞毒實驗採用MTT法。細胞消化後製成細胞懸液接種於96孔細胞培養板，每孔90μl(含1.0×104細胞)，加入不同濃度的土貝母苷乙液10μl，對照組加入相同體積溶劑。每組設4個平行孔，充分混勻後，於CO2培養箱中培養24、48、72h。每孔加入MTT20μl(5mg/ml)，繼續培養5h後每孔加入三聯液100μl。37℃放置過夜後，用酶標儀在570nm波長處測量各孔OD值。調零孔則用RPMI-1640培養液。Bliss法計算半數抑制濃度IC50。細胞生長抑制率按下列公式計算
1.1.4形態學觀察1.1.4.1倒置顯微鏡加入土貝母苷乙液(20μmol/L)，細胞培養24h，倒置顯微鏡下觀察，照相併記錄實驗結果。
1.1.4.2螢光顯微鏡Hoechst-PI雙染色細胞接種於6孔板(4×105/ml)，加入土貝母苷乙液(15μmol/L)，作用72h後常規方法收集細胞。用預冷的磷酸鹽緩衝液(PBS)洗滌兩次，加入Hoechst-33342染色液，使其終濃度為50μmol/L。混勻後於37℃水浴染色15min，離心去上清，用PBS洗一次。加PBS懸浮細胞，取細胞懸液100μl，加入PI染液，使其終濃度為10μg/L。混勻，冰上染色15min。離心去上清。製片，螢光顯微鏡觀察，拍照。
1.1.4.3吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)染色細胞接種於6孔板(4×105/孔)，加入土貝母苷乙液(15μmol/L)，作用72h後常規方法收集細胞。用預冷的PBS洗滌兩次，離心，去上清。加PBS懸浮細胞，取細胞懸液100μl，加入AO/EB染料8μl，混勻。取一滴於載玻片，上覆蓋玻片，螢光顯微鏡下觀察結果並拍照。
1.2結果1.2.1土貝母苷乙對ECV-304細胞生長的影響土貝母苷乙明顯抑制ECV-304細胞的生長，其作用與劑量和時間相關；土貝母苷乙對ECV-304細胞作用24、48、72h的IC50分別為22.2、19.3、15.7μmol/L(表1)。
表1 土貝母苷乙對ECV-304細胞生長的抑制作用(x±s，n＝4)
與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
1.2.2土貝母苷乙對ECV-304細胞凋亡的影響1.2.2.1倒置顯微鏡觀察對照組細胞多角形，貼壁良好，伸展充分，有較多的分裂期細胞，呈典型的單層卵石狀緊密排列；20μmol/L土貝母苷乙液作用後，細胞形態發生顯著變化，細胞間連接開始消失，細胞變圓變亮，並可見均勻分布的染色質，隨著作用時間的延長，染色質逐漸邊聚，細胞表面出現芽狀突起，細胞輪廓模糊，空泡化明顯(圖2)。
1.2.2.2螢光顯微鏡觀察Hoechst-PI雙染色對照組ECV-304細胞核大小較均一，呈圓形或橢圓形，染色質分布均勻，紫外光下呈藍色螢光(圖3A)。15μmol/L土貝母苷乙處理的細胞則皺縮，變形，染色質濃縮，部分核染色體碎裂，呈紅色螢光(圖3B)。
1.2.2.3吖啶橙-溴乙錠(AO/EB)染色在螢光顯微鏡下觀察AO/EB染色後各組培養細胞，可見對照組細胞形態大小正常，細胞核大小均勻，呈圓形或橢圓形，核染色質分布均勻，著綠色螢光(圖4A)；細胞經15μmol/L土貝母苷乙作用後，部分細胞膜破損，胞漿濃縮，細胞核呈固縮狀、圓珠狀或新月狀，染色質著綠色或橘紅色螢光(圖4B)。
2.土貝母苷乙對血管生成的影響2.1材料和方法2.1.1雞胚絨毛尿囊膜(CAM)的血管生成種蛋(受精率＞90％)，平均重44.56g。雞胚卵用0.1％的新潔爾液滅菌，拭乾後將雞蛋氣室向上，長軸與蛋託呈45°放入37.0±0.5℃、60％溼度的隔水式恆溫孵育箱內孵育，胚頭朝上。轉蛋角度以水平位置前俯後仰各45°為宜，每4小時翻動一次。雞胚孵化的第6天，在氣室處劃定開窗位置。無菌條件下鑽孔，暴露絨毛尿囊膜。放入滅菌的濾紙，於濾紙處給藥，用無菌透明膠帶封孔。每天每組雞胚給不同濃度土貝母苷乙液100μl(對照組給相同體積的PBS溶液)，一共給藥3天。第4天取出雞胚，局部採用丙酮-無水乙醇(V∶V＝1∶1)固定。剪下蓋有濾紙的CAM，小心棄去濾紙。將CAM小心轉移至乾淨的載玻片上，滴甘油，加蓋玻片，石蠟密封。在解剖顯微鏡下(4×10)於濾紙區域內隨機選取5個視野計數可見血管的分支點數目。按下式計算血管生成抑制率。
2.1.2腫瘤細胞誘導的血管生成雞胚孵化的第6天，在絨毛尿囊膜氣室體表處劃定開窗位置。無菌條件下開一個直徑1cm小孔，暴露絨毛尿囊膜，接種1×107/ml人鼻咽癌細胞(CNE-2Z)懸液100μl，用無菌透明膠帶封孔。雞胚在37.0±0.5℃、60％溼度的隔水式恆溫孵育箱內繼續培養3天後，在接種細胞處輕輕鋪上無菌濾紙環(正中打孔，外徑0.50cm，內徑0.15cm)使接種的細胞處於環內。於濾紙環區域內給藥。給藥組每天加入50μl藥液，對照組加入相同體積的PBS溶液。給藥4天後取出雞胚，處理同2.1.1。血管生成誘導率和血管生成抑制率按下式計算 2.2結果2.2.1土貝母苷乙對雞胚絨毛尿囊膜血管生成的影響與對照組相比，土貝母苷乙明顯抑制CAM血管生成，其效果與劑量相關(表2，圖5)。值得注意的是，40μmol/L土貝母苷乙劑量組出現溶血(圖5C)。
表2土貝母苷乙對CAM血管生成的影響
與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
2.2.2土貝母苷乙對腫瘤細胞誘導的CAM血管生成的影響CAM結果顯示，人鼻咽癌細胞明顯誘導血管生成。CAM血管的自然生長狀態成葉脈樣。接種癌細胞的CAM，以接種區為中心形成呈放射狀生長的血管網，新生毛細血管直接向腫瘤接種區爬行生長，出現「血管輻輳現象」。接種區周圍血管分支數目明顯增多(P＜0.05)。土貝母苷乙顯著抑制人鼻咽癌細胞誘導的CAM血管的生成，其抑制效果與劑量相關(表3)。與對照組相比，給藥組血管密度、分支數目明顯減少，管徑較細。
表3土貝母苷乙對腫瘤誘導的CAM血管生成的抑制作用
與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
3.土貝母苷乙對瘤組織微血管密度(microvessel density，MVD)的影響3.1材料和方法3.1.1石蠟切片的製作新鮮瘤組織剝離後，在10％中性福馬林液中固定24h；75％、85％、95％、95％、95％、100％、100％、100％的乙醇脫水30～40min，二甲苯透明3次，各30min；62的石蠟浸蠟3次，各6h，石蠟包埋。
3.1.2D31標記(1)抗原修復將石蠟包埋組織塊4μm連續切片，用免疫組化法檢測微血管密度。先將切片放於盛有pH6.0的檸檬酸鹽緩衝液的容器中，置電爐上加熱至沸騰，並持續10min，然後將該容器置入裝有冷水的盆中使切片快速冷卻；取出切片，以蒸餾水浸洗後平放於溫盒內；每張切片上滴加50μl 0.05％胰蛋白酶液，37℃，8min，取出切片，蒸餾水衝洗。(2)3％H2O2阻斷組織內源性過氧化物酶，室溫下10min；以5％正常血清作切片背景保護，37℃，30min。(3)加第一抗體，兔抗鼠CD31抗體。工作濃度1∶50，37℃，30min；第二抗體，山羊抗兔IgG和第三抗體；SP試劑，工作濃度分別為1∶200和1∶500，37℃下各孵育20min。(4)DAB顯色，鏡下控制呈色反應，自來水衝洗，蘇木素復染，常規脫水至封片，光鏡下觀察。
3.1.3微血管密度的計數按照Weidner的方法，即在低倍視野(40倍)下掃視整個腫瘤組織切片，尋找新生血管最密集區即「熱點」(hotspot)，然後在高倍鏡(200倍)視野下計數熱點區被CD31染色的微血管數目。對所標記的微血管選取的原則是血管內皮細胞被染成棕色，與鄰近的微血管、腫瘤細胞及其他結締組織成分不相連的，標記清晰的內皮細胞或細胞串均作為一個可計數的微血管，而血管腔的有無不作為判斷血管的標準。有較厚肌壁的大血管應排除在計數範圍之外。此外，腫瘤的壞死區、硬化區、腫瘤細胞稀少區微血管不進行計數。每個象限任選CD31單抗標記陽性的血管數最多的5個視野計數，取平均值作為瘤灶內MVD。
3.2結果經CD31免疫組化染色，Lewis肺癌瘤組織中的血管內皮細胞被染成棕色。不同處理組瘤組織中的微血管密度值分別為對照組19.6±3.2；土貝母苷乙組7.3±1.3。土貝母苷乙組明顯低於對照組(P＜0.05)。對照組毛細血管大量增生，腫瘤組織內微血管分布不均，形態不規則，數量相差懸殊，呈異質性，毛細血管增生富集在腫瘤邊緣處(圖6A)。土貝母苷乙組僅癌巢間質有極少量新生毛細血管(圖6B)。
4.土貝母苷乙對促血管生成因子表達的影響4.1材料和方法石蠟包埋組織塊，4μm連續切片，免疫組化法檢測土貝母苷乙對促血管生成因子表達的影響(免疫超敏S-P實驗按試劑盒說明操作)。血管內皮生長因子(VEGF)和鹼性成纖維細胞因子(bFGF)定位於細胞膜和細胞漿，以細胞膜或細胞漿內出現明確的棕黃色顆粒為陽性細胞。著淡黃色為弱陽性(+)，棕黃色為陽性(++)，棕褐色為強陽性(+++)，無著色為陰性(-)。
4.2結果Lewis肺癌瘤組織中VEGF表達產物定位於腫瘤細胞及部分間質細胞的胞漿和胞膜，對照組瘤細胞胞漿和胞膜VEGF表達強陽性，呈深棕黃色顆粒狀或瀰漫性分布，土貝母苷乙組瘤組織中VEGF陽性表達細胞數明顯減少，大多數癌細胞染色呈藍色(陰性)。bFGF陽性表達產物定位於腫瘤細胞及部分間質細胞的胞漿和胞膜，呈瀰漫或局灶性分布。對照組bFGF瘤細胞胞漿染色呈明顯深棕黃色(強陽性)，實驗組瘤細胞染色呈藍色(陰性)(表4)。
表4土貝母苷乙對腫瘤組織VEGF、bFGF表達的影響(x±s)
與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.015.土貝母苷乙對小鼠移植性腫瘤轉移的影響5.1材料和方法5.1.1實驗動物BALB/c裸小鼠，6-8周齡，雌雄兼有，飼養於SPF級動物實驗室。飼料、飲水、籠具和操作器材及其他用品均滅菌處理後使用，實驗時按無菌原則操作。
5.1.2細胞株B16黑色素瘤細胞培養於含10％小牛血清，100kU/L青黴素和100mg/L鏈黴素的RPMI-1640培養液中。Lewis肺癌細胞株(LLC)為自發性肺未分化上皮樣癌，LLC細胞培養於含5％小牛血清，10％胎牛血清，100kU/L青黴素和100mg/L鏈黴素的DMEM培養液中。37℃、5％CO2飽和溼度細胞培養箱培養，取對數生長期細胞用於實驗。
5.1.3B16實驗轉移模型取對數生長期B16黑色素瘤細胞，調整濃度至1×106細胞/ml，按每隻0.2ml(2×105細胞)接種於裸鼠尾靜脈。隨機分為陰性對照組、陽性對照組和實驗組，每組8隻小鼠，雌雄各半。接種當日即開始給藥。實驗組每日每隻裸鼠腹腔注射不同劑量土貝母苷乙(1.5，3mg/kg·/d)，連續14天；陰性對照組同時腹腔注射同量溶劑；陽性對照組每周每隻裸鼠腹腔注射環磷醯胺50mg/kg/·w，共注射2次。接種後第15天，稱體重，摘除眼球放血、頸椎脫位法犧牲動物。取出肺，稱重並計轉移結節數。按下列公式分別計算腫瘤轉移抑制率，相對肺重。
相對肺重＝肺重/體重5.1.4LLC自發轉移模型取對數生長期Lewis肺癌細胞，調整濃度至2×107細胞/ml，按每隻0.2ml(4×106細胞)接種於裸鼠右側背部皮下(移植瘤增殖後開始侵襲周圍正常組織和血管，繼之癌細胞進入血液循環形成血行播散，粘附於靶器官並穿出血管，癌細胞增殖成為克隆，最終形成轉移瘤。上述過程基本類似於人類腫瘤從生長到轉移瘤形成所經歷的一系列步驟)。接種後第7天開始給藥。分組方式和給藥方式同B16實驗轉移模型。用藥14次後，稱體重，摘除眼球放血、頸椎脫位法犧牲動物，剝離腫瘤衡重。將瘤標本中生長良好的瘤組織用10％中性福馬林固定，用於檢測土貝母苷乙對微血管密度、促血管生成因子、腫瘤轉移因子表達的影響。取出肝，稱重並計轉移結節數。按下列公式計算土貝母苷乙腫瘤生長抑制率，腫瘤轉移抑制率及相對肝重。
相對肝重＝肝重/體重5.1.5免疫組化法檢測腫瘤轉移因子的表達石蠟包埋組織塊，4μm連續切片，免疫組化法檢測土貝母苷乙腫瘤轉移因子表達的影響(免疫超敏S-P實驗按試劑盒說明操作)。以細胞膜或細胞漿內出現明確的棕黃色顆粒為陽性細胞。促腫瘤轉移因子(CD44v6)以胞膜著色為主，少量胞漿著色，陽性顯色為棕黃色；促腫瘤轉移因子(ErBb-2)以胞膜或胞漿著色為主，陽性顯色為棕黃色，；抑腫瘤轉移因子(nm23-H1)主要位於胞漿，以胞膜或胞漿淡黃至褐黃色細顆粒狀著色為陽性細胞。著淡黃色為弱陽性(+)，棕黃色為陽性(++)，棕褐色為強陽性(+++)，無著色為陰性(-)。
5.2結果5.2.1土貝母苷乙對接種B16、LLC細胞裸小鼠生長的影響實驗前後與對照組相比，裸鼠的體重無明顯改變(表5)。
表5土貝母苷乙對接種B16、LLC細胞裸小鼠生長的影響
與對照組比較，*p＜0.05；**p＜0.01。
5.2.2土貝母苷乙對接種B16裸小鼠肺重、相對肺重的影響與對照組相比，土貝母苷乙組裸小鼠的肺重，相對肺重低(表6)。
表6土貝母苷乙對肺重及相對肺重的影響
與對照組比較，*p＜0.05；**p＜0.01。
5.2.3土貝母苷乙對B16細胞實驗性肺轉移的影響BALB/c裸小鼠尾靜脈接種B16細胞發生肺轉移。土貝母苷乙(1.5，3mg/kg·d×14)對B16細胞肺轉移的抑制率分別為68.8％和82.8％(表7)。
表7土貝母苷乙對B16細胞實驗性肺轉移的影響
5.2.4土貝母苷乙對接種LLC裸小鼠原發瘤生長，肝重、相對肝重的影響BALB/c裸小鼠接種LLC細胞7天後，可見皮下長出原發瘤。土貝母苷乙可明顯抑制原發瘤的生長(圖7)，並呈一定的劑量依賴關係(表8)。HE染色病理檢查顯示，對照組瘤組織邊界不清，細胞密集排列，異型性明顯，而苷乙組瘤組織中心及邊緣見大片狀或灶性壞死(圖8)。裸鼠連續14天分別腹腔注射土貝母苷乙(1.5，3mg/kg·d)，對原發瘤的生長抑制率分別為49.9％和58.4％。同時，土貝母苷乙(1.5，3mg/kg.d)可明顯降低裸鼠的肝重與相對肝重(表8)。
表8土貝母苷乙對接種LLC裸小鼠原發瘤生長、肝重，相對肝重的影響
與對照組比較，*p＜0.05；**p＜0.01。
5.2.5土貝母苷乙對LLC自發性肝轉移的影響BALB/c裸鼠背部皮下接種LLC細胞，自發性發生肝轉移。在肝表面可見清晰的轉移灶。土貝母苷乙可明顯抑制LLC細胞的肝轉移(表9，圖9)。
表9土貝母苷乙對LLC細胞自發性轉移的抑制作用
5.2.6土貝母苷乙對腫瘤轉移因子表達的影響免疫組化檢測的結果顯示，在Lewis肺癌細胞中，CD44v6和ErBb-2表達於細胞膜與細胞漿，nm23主要表達於細胞漿；給小鼠注射土貝母苷乙後，Lewis肺癌細胞中促轉移基因CD44v6和ErBb-2的表達下調，抑轉移基因nm23-H1的表達上調(表10)。
表10土貝母苷乙對腫瘤轉移因子表達的影響
實施例下面的配方舉例說明了本發明的劑型。
實施例1片劑，NO 組分 用量mg/片 mg/片1土貝母苷乙(或含土貝母苷乙的土貝母皂苷)1001002乳糖USP 1221233玉米澱粉，食品級，呈30 4010％的純水漿狀物4玉米澱粉，食品級95 1305硬脂酸鎂3 7合計 350400製造方法在適當的混合機中混合第1項和第2項組分15分鐘，第3組分與混合物粒化。如果需要，通過一個初篩研磨潮溼的顆粒，並使之乾燥。如果需要，將乾燥的顆粒過篩，並與第4項混合10-15分鐘。加入第5項混合1-3分鐘。在適當的壓片機中將混合物壓成適當的尺寸和重量。
實施例2膠囊劑NO組分 用量mg/粒mg/粒1 土貝母苷乙 50 100(或含土貝母苷乙的土貝母皂苷)2 乳糖USP106 1203 玉米澱粉，食品級 40 734 硬脂酸鎂NF 47合計 200 300製造方法將第1、2和第3項在適當的混合機中混合10-15分鐘，加入第4項混合1-3分鐘。在適當的包囊機上將該混合物裝入適當的膠囊中。
實施例3注射液土貝母苷乙(或含土貝母苷乙的土貝母皂苷)10g或50g葡萄糖490g或450g注射用水 加至10000ml實施例4栓劑以生產發明產品10000粒為例所用的原料及其配比為土貝母苷乙(或含土貝母苷乙的土貝母皂苷)300g或600g吐溫80800g或800g可可豆酯(或半合成脂肪酸甘油) 加至10000g製造方法混合按本實施例的配比稱取土貝母苷乙(或含土貝母苷乙的土貝母皂苷)、吐溫80和可可豆酯(或半合成脂肪酸甘油)，將可可豆酯(或半合成脂肪酸甘油)放入不鏽鋼鍋水浴加熱至大部分溶化，停止加熱，然後分別加入吐溫80和土貝母苷乙(或含土貝母苷乙的土貝母皂苷)，用不鏽鋼攪拌機攪拌至混合均勻，便得到本發明的混合藥物。潤滑劑的配製用軟肥皂和甘油各一份與5倍的80％醫用酒精充分混合攪拌均勻，製成潤滑劑。
成型在栓模上塗上已配製的潤滑劑。將本發明的混合藥物倒入栓模中至溢出模口，讓其自然冷卻。待完全凝固後，用刀切去溢出部分。然後開啟模具，將栓劑從模具中取出。
無菌包裝將所製備的拴劑進行質量檢查，每粒重量應為1g，含土貝母苷乙(或含土貝母苷乙的土貝母皂苷)30mg或60mg。檢查合格後包裝，鈷60滅菌。


圖1.土貝母苷乙的化學結構式圖2.倒置顯微鏡觀察土貝母苷乙作用下ECV-304細胞形態學變化A對照，×200；B30μmol/L 土貝母苷乙，24h，×200。
圖3.螢光顯微鏡下觀察土貝母苷乙誘導的ECV-304細胞凋亡形態學變化(Hoechst-PI染色，×400)A對照；B20μmol/L土貝母苷乙，72h。
圖4.螢光顯微鏡下觀察土貝母苷乙誘導的ECV-304細胞形態學變化(AO/EB染色，×400)A對照；B20μmol/L土貝母苷乙，72h，圖5.土貝母苷乙對CAM血管生成的抑制作用A對照組；B20μmol/L土貝母苷乙；E40μmol/L土貝母苷乙。
圖6.土貝母苷乙對微血管密度的影響A對照；B土貝母苷乙組。
圖7.土貝母苷乙對Lewis肺癌原發瘤生長的影響A對照；B土貝母苷乙。
圖8土貝母苷乙誘導的Lewis肺癌瘤組織的病理變化(HE染色，×200)A對照；B土貝母苷乙。
圖9.土貝母苷乙對LLC自發性肝轉移的抑制作用A對照；B土貝母苷乙(圖中灰白點為轉移灶)。
權利要求
1.土貝母苷乙或含土貝母苷乙的土貝母皂苷用於製備抗血管生成、抗腫瘤侵襲和轉移的藥物的用途。
全文摘要
本發明涉及土貝母苷乙或含土貝母苷乙的土貝母皂苷用於製備抗血管生成、抗腫瘤侵襲和轉移的藥物。土貝母苷乙是從土貝母中提取出來的一種化學成分，是土貝母苷甲的天然衍生物；這裡所謂含土貝母苷乙的土貝母皂苷是指含土貝母苷乙和土貝母苷甲、但不含土貝母苷丙的土貝母中的皂苷組分。土貝母甘乙明顯抑制人臍靜脈內皮細胞ECV－304的增殖，促進其凋亡；土貝母苷乙明顯抑制雞胚絨毛尿囊膜的和腫瘤細胞在雞胚絨毛尿囊膜誘導的血管生成；土貝母苷乙明顯抑制腫瘤組織微血管的生成；土貝母苷乙明顯抑制腫瘤組織血管內皮生長因子(VEGF)和鹼性成纖維細胞因子(bFGF)的表達；土貝母苷乙明顯抑制小鼠B16黑色素瘤細胞的實驗轉移和Lewis肺癌細胞的自發轉移；土貝母苷乙誘導Lewis肺癌組織中促轉移基因CD44v6和ErBb－2的表達下調，抑轉移基因nm23－H1的表達上調。土貝母苷乙或含土貝母苷乙的土貝母皂苷可用於製備抗血管生成、抗腫瘤侵襲和轉移的藥物。
文檔編號A61P35/00GK101073578SQ20061008218
公開日2007年11月21日 申請日期2006年5月20日 優先權日2006年5月20日
發明者於廷曦, 於立堅, 馬潤娣 申請人:於廷曦