質量標記物的製作方法
2023-12-02 03:59:51
專利名稱：質量標記物的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於標記分析物(具體是生物分子如核酸和蛋白質)的有用的化合物。具體而言，本發明涉及採用質譜法使用特殊的質量標記物進行分析的方法。
背景技術：
標記感興趣的分子的各種方法在本領域中是已知的，包括放射性原子、螢光染料、發光試劑、電子俘獲劑和光吸收染料。這些標記系統的每ー種都具有使其適合於某些應用而非其它應用的特徵。由於安全原因，對非放射性標記系統的興趣已導致螢光標記方案的 廣泛的商業發展，尤其是用於遺傳分析的螢光標記。螢光標記方案使得相對少量的分子能同時進行標記，通常可同時使用4種標記物，也可能達到8種。但是，檢測裝置的成本和分析所產生的信號的難度限制了可在螢光檢測方案中同時使用的標記物的數量。最近，在質譜法領域中已開發了一種檢測可斷裂地連接於它們相關的感興趣分子的標記物的方法。在許多分子生物學應用中，人們需要能在分析之前分離出感興趣的分子。通常進行液相分離。近年來，質譜法已發展了許多用於液相分離的界面，這使得質譜法可特別有效地用作這些應用的檢測系統。直到最近才採用液相色譜質譜法直接檢測分析物離子或它們的片段離子。但是，對於許多應用，如核酸分析，分析物的結構可從間接的標記而得以確定。這尤其對於採用質譜法是有利的，因為複雜的生物分子(如DNA)具有複雜的質譜，並且其檢測具有相對差的敏感性。間接檢測指可使用相關的標記物分子來鑑別原始的分析物，該標記物被設計用於敏感性檢測，並具有簡單的質譜。簡單的質譜使得可同時使用多種標記物分析大量的分析物。PCT/GB98/00127描述了共價連接於可斷裂的標記物的核酸探針的陣列，所述標記物可採用質譜法檢測到，該方法可鑑別共價連接的核酸探針的序列。此申請中的標記的探針具有Nu-L-M的結構，其中Nu是共價連接於L的核酸，L是可斷裂的連接物，它共價連接於M，M是質量標記物。在此應用中，較佳的可斷裂的連接物在質譜儀的離子源中斷裂。此申請公開了多種離子化方法和使用四極質量分析儀、飛行時間(Time of flight,T0F)分析儀和磁性扇形場儀器進行的分析，將它們作為採用質譜法分析質量標記物的特殊方法。PCT/GB94/01675公開了可斷裂地連接於質量標記分子的配體和特殊的核酸。較佳的可斷裂連接物是光可斷裂的。此申請公開了基質輔助的雷射解吸電離(MALDI)TOF質譜法作為採用質譜法分析質量標記物的特殊方法。PCT/US97/22639公開了可釋放的非揮發性質量標記物分子。在優選的實施方式中，這些標記物含有聚合物，通常是生物聚合物，這些聚合物可斷裂地連接於反應性基團或配體(即探針)。優選的可斷裂的連接物似乎在化學上和酶學上是可斷裂的。此申請公開了 MALDI TOF質譜法作為採用質譜法分析質量標記物的特殊方法。PCT/US97/01070、PCT/US97/01046 和 PCT/US97/01304 公開了可斷裂地連接於質量標記分子的配體和特殊的核酸。較佳的可斷裂的連接物似乎是化學可斷裂的或光可斷裂的。這些申請公開了許多離子 化方法和使用四極質量分析儀、TOF分析儀和扇形磁場儀器進行的分析，將它們作為採用質譜法分析質量標記物的特殊方法。分析物材料所產生的質譜對汙染物非常敏感。基本上，可電離的導入質譜儀中的任何材料都將出現在質譜中。這意味著對於許多分析，需要在將分析物導入質譜儀前進行小心地純化。對於高通量系統，為了通過使用質量標記物對分析物進行間接分析的目的，需要避免任何不需的樣品製備步驟。即，需要能檢測汙染材料背景中的標記物，並能確定所檢測到的峰事實上與標記物相符。現有的技術沒有公開在以檢測系統為基礎的質譜法中改進信噪比的方法或組合物，或者可提供證明譜中由質量標記物的存在引起的質量峰的方法或組合物。為了在液相層析或電泳分離後檢測分析物，需要使所使用的標記物對分離過程產生的幹擾最小。如果使用這類分析物的陣列，則需要陣列中的各個成員對與它們連相關的分析物的影響與其它標記物相同。這在某種程度上與質量標記的意圖有牴觸，這種意圖產生基於其質量在質譜儀中可分解的標記物陣列。質量標記物較佳應可被分解成4道爾頓，以防止一種標記物的同位素峰受到其它標記物的同位素峰的幹擾。這意味著為了產生250個不同的質量標記物，可能需要標記物的範圍擴展到約1000道爾頓，可能還更多，因為重要的是產生被4道爾頓精確分離的大陣列的標記物。這個質量範圍質量將幾乎肯定會產生對採用質譜法進行檢測的任何分離過程產生不同影響的質量標記物。這對儀器設計也有關係，因為隨著質量範圍的增加超過了質譜儀可檢測離子的範圍，儀器的成本也増加。
發明內容
因此，本發明的ー個目的是解決與上述現有技術相關的問題，並提供在汙染背景中可檢測到的質量標記物，以及作為質量標記物的身份可被證實的標記物。此外，本發明的ー個目的是提供在壓縮的質量範圍內可被分解的標記物的陣列，這樣這些標記物不會對分離過程有太多幹擾，以及提供在質荷比的有限範圍內檢測離子的質譜儀中可容易地被檢測到的標記物的陣列。本發明還有ー個目的是提供分析生物分子的方法，該方法利用本發明的標記物使通量、信噪比和這些檢測的敏感性最大化，具體是在遺傳分析中，更具體是用在分析蛋白質的雙向凝膠電泳中。此外，下面公開的質量標記物的設計使得為檢測質量標記物的目的而設計出ー種簡易的串聯質譜儀。第一質量分析儀僅僅需要選擇有限量的其質量相對低的離子。第二質量分析儀僅僅需要檢測少量的斷裂產物。因此，本發明提供一組兩個或多個質量標記物，組中的各個標記物含有通過可斷裂的連接物連接於質量歸一化部分的質量指示部分，此部分具有抗碎裂性，其中，組中各標記物的聚集質量(aggregate mass)可相同或不同，並且,組中各標記物的質量指示部分的質量可相同或不同，其中，在組中具有共同質量的質量指示部分的任何類的標記物中，各標記物具有不同於該類中所有其它標記物的聚集質量，並且，在組中具有共同聚集質量的任何類的標記物中，各標記物具有其質量不同於該類中所有其它質量指示部分的質量的質量指示部分，這樣，採用質譜法分析時組中所有的質量標記物都可互相區分。術語「質量指示部分」在本文中指採用質譜法檢測到的部分，而術語「質量歸ー化部分」在本文中指採用質譜法不一定能檢測到的部分，但是它的存在確保了質量標記物具有所需的聚集質量。組中標記物的數量並沒有特殊的限制，但條件是該組含有許多的標記物。但是，組中含有兩種以上、三種以上、四種以上或五種以上的標記物較佳。
本發明還提供質量標記物的陣列，該陣列含有兩組以上上述陣列標記物，其中，任ー組中各質量標記物的聚集質量與陣列中其它組中的每個質量標記物的聚集質量不同。本發明還提供ー種分析方法，該方法包括採用質譜法鑑別不同於分析物的質量標記物或其組合，從而檢測分析物，其中，質量標記物是上述的標記物組或其陣列中的質量標記物。
現在，本發明將結合附圖僅採用舉例方式作更詳細的描述，其中圖I顯示三重四極質譜儀的示意性布局圖；圖2顯示形成本發明的標記物組的10個片段，包括5個質量歸ー化部分(Mtl-M4)和5個質量指示部分(XcrX4)，其中，將氟原子取代基用作質量調節部分；圖3顯示本發明ー組5個標記物，由圖2的質量歸一化部分和質量指示部分形成；圖4顯示本發明ー組5個質量標記物,其中,所有的標記物的質量不同,但該組中所有的質量指示物具有相同的質量；圖5顯示標記分析物(如寡核苷酸與質量標記物結合)的例子，這樣，質量標記物的結合具有唯一的可鑑別分析物的質譜；圖6顯示成組的質量標記物的陣列，各組具有相同質量系列的修飾基團(S)，並且，由於其基底苯基上的氟取代基的數量的緣故，各組互不相同；圖7顯示成組的質量標記物的陣列，各組具有相同質量系列的修飾基團(S)，並且，由於質量系列修飾基團中苯基醚的數量的緣故，各組互不相同；圖8闡述了本發明的「混合模式」實施方式，該圖顯示了當存在O或I的相對量吋，三種標記物P、Q和R的所有組合的8種可能的唯一質譜中的4種；圖9闡述本發明的「混合模式」實施方式，該圖顯示了當存在0、1或2的相對量吋，三種標記物P、Q、R、S和T的所有組合的243種可能的唯一質譜中的8種(如果T維持恆定，作為內部標準，則有81種可能的質譜)；圖10顯示通過擴大質量歸一化部分和質量指示部分，以允許進行更大範圍的取代而可形成的標記物組有多大——這組標記物有9個成員，以及用氟原子取代基作為質量調節部分而形成的標記物組有多大——這組標記物至少有8個成員，這便於採用本發明的混合模式對寡核苷酸陣列中的256個四聚體進行標記；圖11顯示質譜1，這是個含有從所有的離子A+、B+、C+和D+的峰的完整的質譜；圖12顯示質譜2，這個質譜僅僅是A+的質譜，通過在質譜儀的第一四極(Ql)中選擇A+離子而產生的質譜；圖13顯示質譜3，這是第一離子A1+(與A+具有相同的質荷比)和A1+. P+和Q+的斷裂產物的質譜；圖14顯示質譜4，這是第二離子A2+(與A+具有相同的質荷比)和A2+、X+和Y+的斷裂產物的質譜；圖15顯示質譜5，當兩類這樣的離子(A1+和A2+)存在時，選擇A+離子而形成的質譜；圖16顯示質譜6，這是個在質譜儀的三極矩中形成的譜，當兩類在Q2中通過碰撞誘導了所選擇離子的解離的這樣的離子(A1+和A2+)存在時，在Ql中選擇A+離子，在Q3中選擇已知的撞擊產物A1+ (P+)——這種方法可使A1+和A2+分解；圖17顯示質譜7，這是本發明ー組5種質量標記物的ニ維譜，其中，在Ql (第一維)中選擇質量MX，在Q3 (第二維)中選擇5種不同的質量X。、X1, X2、X3和X4 ；圖18顯示質譜8，這是本發明ー組4種質量標記物的ニ維譜，其中，在Ql (第一維) 中選擇4種不同的質量MqXq、M1X0, M2X0和M3Xtl,在Q3 (第二維)中選擇單ー質量M。；圖19顯示質譜9,這是含有由Mci-M3和Xci-X3的所有組合形成的標記物的一組質量標記物的ニ維譜，其中，在Ql(第一維)中選擇7種不同的質量，在Q3(第二維)中選擇4種不同的質量Xci-X3 ；圖20顯示使用本發明的質量標記物進行典型的斷裂過程的示意圖，本發明的質量標記物與它們的分析物發生熱斷裂，或者使用電噴射離子化使它們斷裂；圖21顯示使用本發明的ー組5個質量標記物在ニ維質譜中進行選擇的示意圖。圖22顯示本發明的氘化的質量標記物；圖23顯示本發明的進ー步氣化的質量標記物；圖24顯示具有H2N-gly-leu-ala-ser-glu_C00H序列的兩條肽樣品的理論譜,各樣品與圖23中的式子所述的ー種標記物連接。
具體實施例方式在ー個較佳實施方式中，本發明提供上述ー組質量標記物，其中，組中各標記物具有有共同質量的質量指示部分，並且組中各標記物具有唯一的聚集質量。這種第一類型的標記物組的例子在圖4中給出。在另一可選擇的更佳的實施方式中，組中各標記物具有共同的聚集質量，並且組中各標記物具有有唯一質量的質量指示部分。這種第二類型的標記物組的例子在圖3中給出。該組標記物並不受到上述兩個較佳實施方式的限制，可包括如兩種類型的標記物，但條件是，如上所述，所有的標記物通過質譜法分析都是可區分的。較佳的是，在第二類型的標記物組中，組中各質量指示部分具有共同的基本結構，組中各質量歸一化部分具有共同的基本結構，並且組中各質量標記物含有一個或多個質量調節部分，該質量調節部分被連接於質量指示部分和/或質量歸一化部分的基本結構上或者位於這些結構之中。在這個實施方式中，組中姆一個質量指示部分含有不同數量的質量調節部分，組中每ー質量標記物具有相同數量的質量調節部分。在整篇說明書中，所述的「共同的基本結構」是指兩個或多個部分共享有ー個結構，該結構具有基本上相同的結構構架、骨架或核心。這種構架或骨架可以是如苯基醚部分。該構架或骨架可含有與其側接的取代基，或者用其中沒有改變共同的基本結構的原子或同位素取代。通常，上述第二類型的標記物組含有具有下式的質量標記物M(A)y-L-X(A)z式中,M是質量歸ー化部分,X是質量指示部分,A是質量調節部分，L是可斷裂的連接物，y和z是O或O以上的整數，y+z是I或I以上的整數。較佳的是，M是抗碎裂性基團，L是在與其它分子或原子碰撞時易斷裂的連接物，X較佳是預先電離的具有抗碎裂性的基團。M和X的質量總和與該組的所有成員相同。較佳的是，M和X具有相同的基本結構或核心結構，這種結構被質量調節部分修飾。該質量調節部分確保M和X的質量總和與組中所有的質量標記物相同，但保證了每個X具有不同的(唯一的)質量。具有上述結構的優選質量標記物組是其組中每種標記物具有下述結構的組
權利要求
1.一組兩種或多種質量標記物，組中各標記物包含通過連接物連接於質量歸一化部分的質量指示部分，所述連接物含有在質譜儀中可斷裂的基團，其中，各質量歸一化部分確保質量標記物具有所需的聚集質量，且組中各質量指示部分的質量相同，其中，組中各標記物具有與該組中的所有其它標記物不同的質量，並且，組中所有的質量標記物可通過質譜法得以相互區分。
2.如權利要求I所述的ー組質量標記物，其特徵在於，所述組中的各質量標記物具有下述結構 M (A) y-L_X (A) z 式中，M是質量歸ー化部分，X是質量指示部分，A是質量調節部分，L是可斷裂的連接物，y和z是O或O以上的整數，y+z是I或I以上的整數。
3.如權利要求2所述的ー組質量標記物，其特徵在於，所述質量調節部分選自 (a)位於所述質量指示部分和/或質量歸一化部分的基本結構內的同位素取代基； (b)連接於所述質量指示部分和/或質量歸一化部分的基本結構的取代基原子或基團。
4.如權利要求3所述的ー組質量標記物，其特徵在幹，所述質量調節部分選自滷原子取代基、甲基和2H或13C同位素取代基。
5.如權利要求4所述的ー組質量標記物，其特徵在幹，所述質量調節部分是氟原子取代基。
6.如前述權利要求中任一項所述的ー組質量標記物,其特徵在於,將所述質量指示部分連接於所述質量歸ー化部分的可斷裂連接物是可通過碰撞而斷裂的連接物。
7.如權利要求6所述的ー組質量標記物，其特徵在幹，所述可斷裂的連接物包含醯胺鍵。
8.如前述權利要求中任一項所述的ー組質量標記物，其特徵在幹，所述質量歸ー化部分包含抗斷裂基團。
9.如權利要求8所述的ー組質量標記物，其特徵在於，所述質量歸ー化部分包含苯基。
10.如前述權利要求中任一項所述的ー組質量標記物,其特徵在於,所述質量指示部分包含預電離的基團。
11.如權利要求10所述的ー組質量標記物，其特徵在於，所述質量指示部分包含N-甲基批澱基，或包含選自以下的基團_NH2、-NR2> -NR3+、-SR3+、-SO3、_P04、_P03、-CO2、
12.如權利要求2-11中任一項所述的ー組質量標記物，其特徵在於，所述組中各標記物具有下述結構
13.如權利要求12所述的ー組質量標記物，其特徵在於，所述R是H，L是醯胺鍵，p=0，A是氟原子。
14.一組兩種或多種探針，其特徵在幹，組中各探針不同，它們連接於獨特的質量標記物或質量標記物的獨特組合，所述質量標記物來自權利要求1-13中任一項所述的質量標記物組。
15.如權利要求14所述的探針組，其特徵在於，所述各探針連接於質量標記物的獨特組合，每種組合由該質量標記物組中每種質量標記物的存在與否得以區別，和/或由連接於該探針的各質量標記物的數量加以區別。
16.如權利要求14-15中任一項所述的探針組，其特徵在於，所述各探針包含生物分子。
17.如權利要求16所述的探針組，其特徵在於，所述生物分子選自DNA、RNA、寡核苷酸、核酸鹼基、蛋白質和/或胺基酸。
18.ー種分析方法，該方法包括，採用質譜法鑑別質量標記物或質量標記物的組合，從而同時檢測兩種或多種分析物，其中，所述質量標記物是權利要求1-13中任ー項所定義的質量標記物組的質量標記物。
19.如權利要求18所述的方法，其特徵在幹，由來自質量標記物組的質量標記物的獨特組合鑑別每種分析物，各種組合由所述組中的每種標記物的存在與否而得以區別，和/或由各質量標記物的數量而加以區別。
20.如權利要求18-19中任ー項所述的鑑別兩種或多種分析物的方法，其特徵在於，在採用質譜法檢測質量標記物之前，先根據所述分析物的質量將它們分離。
21.如權利要求20所述的方法，其特徵在於，採用色譜法或電泳進行分離。
22.如權利要求18-21中任一項所述的方法，其特徵在於，用於檢測質量標記物的質譜儀包括一個或多個質量分析儀，這些質量分析儀能使具有特定質量或質量範圍的離子通過，以進行檢測，和/或能使離子分解。
23.如權利要求22所述的方法，其特徵在幹，使用質量分析儀選擇對ー種或多種已知的質量標記物特異的具有特定質量或質量範圍的離子，使所選擇的離子分解，然後檢測分解產物，以鑑別指示所選擇的質量標記物的離子模型。
24.如權利要求22或23所述的方法，其特徵在於，所述質譜儀包括三個四極質量分析儀。
25.如權利要求23或24所述的方法，其特徵在於，所述第一質量分析儀用於選擇具有特定質量或質量範圍的離子，第二質量分析儀用於分解所選擇的離子，第三個質量分析儀用於檢測所產生的離子。
26.如權利要求18-25中任一項所述的方法,其特徵在於,所述方法包括 (a)使ー種或多種分析物與一組探針接觸，其中，所述探針是權利要求14-17中任ー項所定義的探針； (b)通過檢測與分析物相關的探針鑑別分析物。
27.如權利要求26所述的方法，其特徵在於，在採用質譜法檢測所述質量標記物前，先將質量標記物從所述探針上解離下來。
28.如權利要求26或27所述的方法，其特徵在於，所述方法包括使ー種或多種核酸與ー組雜交探針接觸。
29.如權利要求28所述的方法，其特徵在於，所述一組雜交探針是具有256個以內的四聚體的組，組中各探針具有不同的核酸鹼基的組合。
30.如權利要求18所述的ニ維質譜分析法，其特徵在於，該方法包括 (a)提供兩種或多種分析物，各分析物用質量標記物或質量標記物的組合標記，其中，這些質量標記物來自權利要求1-13中任ー項所定義的質量標記物組； (b)使所述質量標記物與所述分析物解離； (c)檢測質量標記物； (d)在質譜儀中分解質量標記物，以從質量歸ー化部分釋放出質量指示部分； (e)檢測質量指示部分； (f)在所述質量標記物的質譜和所述質量指示部分的質譜的基礎上鑑別分析物。
31.如權利要求30所述的方法，其特徵在於，在所述(c)步驟中，選擇具有選定的質量或質量範圍的質量標記物用於檢測，和/或在(e)步驟中，選擇具有特定質量的質量指示部分用於檢測。
32.如權利要求18所述的分析方法，其特徵在於，該方法包括 (a)在分析物的第一特性的基礎上，對標記的分析物的混合物進行第一分離處理； (b)在分析物的第二特性的基礎上，對所得的分離分析物進行第二分離處理； (C)通過檢測分析物的標記物，從而檢測該分析物； 其中，這些分析物用來自權利要求1-13中任ー項所定義的質量標記物組或陣列的質量標記物標記。
33.如權利要求32所述的方法，其特徵在於，在(a)步驟和/或(b)步驟中，根據所述分析物的長度或質量將它們分離。
34.如權利要求32或33所述的方法，其特徵在於，在(a)步驟和/或(b)步驟中，根據所述分析物的等電點將它們分離。
35.如權利要求32-34中任一項所述的方法，其特徵在於，所述分析物包括蛋白質、多肽、肽、胺基酸或核酸，或者它們的片段。
36.如權利要求32-35中任一項所述的雙向凝膠電泳法。
37.根據權利要求18所述的表徵核酸的方法，其特徵在於，該方法包括 (a)提供ー組核酸片段，各片段具有可斷裂地連接於其上、用於鑑別該片段的特徵的質量標記物，所述質量標記物來自權利要求1-13中任ー項所定義的質量標記物組的質量標記物；(b)在它們的長度的基礎上分離這些片段； (C)解離各片段，使其釋放出其質量標記物； (d)採用質譜法測定各質量標記物，以描述各片段的特徵與片段長度的關係。
38.如權利要求37所述的方法，將該方法用於表徵cDNA，其特徵在於，它包括 (a)使含有ー組含ー種或多種cDNA或其片段的樣品暴露於斷裂劑中，該斷裂劑識別預定的序列，並在距離預定序列已知偏移位置的基準位點上進行切割，從而產生ー組末端片段，所述預定序列接近各cDNA或其片段的一端； (b)將銜接子寡核苷酸連接於各基準位點上，該寡核苷酸含有樣品斷裂劑的識別位點； (C)將這組末端片段暴露於樣品斷裂劑中，該斷裂劑與上述識別位點結合，並在距離該識別位點已知偏移位置的樣品位點上進行切割，從而在各個末端片段中產生來自未知序列和預定長度達6個鹼基的粘性末端序列； (d)根據序列的長度將該組末端片段分成亞組； (e)如下測定各粘性末端序列 (i)用標記的雜交探針陣列探測，該陣列含有所有可能的預定長度的鹼基序列； ( )連接這些雜交到粘性末端序列上的探針； (iii)通過鑑別標記物，較佳是通過定量標記物，測定哪些探針被連接， 其中，這些標記物是來自權利要求1-13中任一項所述的組的質量標記物。
39.如權利要求38所述的方法，其特徵在於，採用毛細管電泳、HPLC或凝膠電泳分離末端片段組。
40.根據權利要求18所述的表徵核酸的方法,其特徵在於,該方法包括在至少ー種標記的末端鹼基的存在下，從ー個或多個核酸模板中產生Sanger梯核酸片段，然後鑑別該片段的長度及其末端鹼基，其中該標記物與該末端鹼基是相關的，並且是來自權利要求1-13中任ー項所述的組中的質量標記物。
41.如權利要求40所述的方法，其特徵在於，所述所有四種末端鹼基出現在相同的反應區中。
42.如權利要求40或41所述的方法，其特徵在幹，該方法包括從出現在相同反應區中的大量核酸模板中產生Sanger梯核酸片段，然後鑑別所產生的各核酸片段的長度、產生該片段的模板的種類以及該片段的末端鹼基，其中，在產生這些片段之前，先使標記的引物核苷酸或寡核苷酸雜交到各模板上，各引物上的標記物對該引物所雜交的模板特異，從而允許鑑別該模板。
43.如權利要求42所述的方法，其特徵在幹，鑑別模板的標記物是來自權利要求1-13中任一項所述的組的質量標記物。
44.根據權利要求18所述的核酸測序的方法，其特徵在於，該方法包括 (a)獲得靶核酸組，該組包含一條或多條將要測序的單鏈DNA，每條DNA以唯一的量存在，並具有一個引物，為核酸提供雙鏈部分用於連接； (b)使核酸組與雜交探針陣列接觸，各探針包含可斷裂地連接於預定長度的已知鹼基序列上的標記物，該陣列包含該預定長度的所有可能的鹼基序列，這些鹼基序列不能相互連接，其中，在連接酶的存在下，在使具有與位於各核酸的雙鏈部分附近的單鏈核酸互補的鹼基序列的探針與該雙鏈部分連接的條件下，進行接觸，從而形成延伸的雙鏈部分，該部分不能與更多的探針連接； (C)除去所有未連接的探針；接著進行如下步驟 (d)解離連接的探針，釋放出各標記物； (e)記錄各標記物的數量； (f)激活延伸的雙鏈部分，使能夠在其上進行連接； 其中 (g)步驟(b)到(f)作為ー輪循環，重複進行足夠多次，以通過測定釋放的各標記物的序列來測定單鏈核酸或各單鏈核酸的序列； 其中，雜交探針的標記物是來自權利要求1-13中任一項所述的組或陣列中的各標記物。
45.如權利要求44所述的方法，其特徵在於，所述雜交探針是ー組256個四聚體，組中各探針具有不同組合的核酸鹼基。
46.根據權利要求18所述的表徵含有肽、多肽和/或蛋白質的樣品的方法，其特徵在於，該方法包括 (a)提供含有肽、多肽和/或蛋白質的樣品，每種肽、多肽和/或蛋白質具有可斷裂地連接於其上的質量標記物或質量標記物的組合，所述質量標記物來自權利要求1-13中任一項所述的組的質量標記物，其中，各肽、多肽和/或蛋白質與其標記物或標記物組合相關； (b)分析這些標記的肽、多肽和/或蛋白質，以檢測所述標記物。
47.如權利要求46所述的方法，其特徵在於，通過斷裂劑對含有多肽和/或蛋白質的樣品的作用形成肽，由此提供所述樣品。
48.如權利要求46或47所述的方法，其特徵在於，在進行分析前，先採用色譜法或電泳分離所述標記的肽、多肽和/或蛋白質。
49.如權利要求46-48中任一項所述的方法，其特徵在於，提供多份樣品。
50.如權利要求49所述的方法，其特徵在於，在進行分析前，先將所述多份樣品集中。
51.如權利要求46-50中任一項所述的方法,其特徵在於,所述樣品中的ー種或多種肽 多肽和/或蛋白質經過了翻譯後修飾，含有碳水化合物，並且，該方法包括，通過碳水化合物的羰基連接生物素，使修飾的肽、多肽或蛋白質進行生物素化。
52.如權利要求46-50中任一項所述的方法,其特徵在於,所述樣品中的ー種或多種肽、多肽和/或蛋白質經由酪氨酸磷酸化作用而被翻譯後修飾，且該方法包括，採用親和層析法，使用抗磷酸酪氨酸抗體分離這些修飾的肽、多肽和/或蛋白質。
53.如權利要求46-50中任一項所述的方法，其特徵在於，所述方法包括，從各肽、多肽和/或蛋白質中分離出單一的肽片段。
54.如權利要求53所述的方法，其特徵在於，所述各分離的片段是末端片段。
55.如權利要求54所述的方法，其特徵在於，所述方法包括 (a)用斷裂劑處理含有一組含許多多肽的樣品，已知該斷裂劑識別多肽鏈中的特殊胺基酸殘基或序列，以在切割位點進行解離，從而將該組多肽解離，產生肽片段； (b)從其所片段化的樣品中分離出ー組肽片段，這些片段具有作為參考末端的多肽的N末端或C末端，每條肽在另一端在接近該參考末端處具有切割位點；(c)在分離這些肽片段之前或之後，用來自權利要求1-13中任一項所述的質量標記物組的質量標記物或質量標記物的組合標記多肽的姆ー個參考末端，其中，各參考末端與它的標記物或標記物的組合相關； (d)採用質譜法測定一條或多條分離的片段的特徵序列，所述特徵序列是從切割位點開始有預定數量的胺基酸殘基的序列；其中，特徵序列表徵了各多肽。
56.如權利要求54所述的方法，其特徵在於，所述方法包括 (a)使含有一條或多條多肽的樣品與第一斷裂劑接觸，產生多肽片段； (b)分離出一條或多條多肽片段，各片段含有片段化樣品的多肽的N末端或C末端； (c)在分離多肽片段之前或之後，用來自權利要求1-13中任一項所述的質量標記物組的質量標記物或質量標記物的組合標記多肽的姆ー個末端，其中，各末端與它的標記物或標記物的組合相關； (d)採用質譜法鑑別分離的片段； (e)使用第二種斷裂劑，對該樣品重複上述步驟(a)-(d)，所述第二種斷裂劑在與第一斷裂劑作用位點不同的位點上解離； (f)由步驟(d)和(e)中鑑別得到的片段表徵上述樣品中的一條或多條多肽。
57.權利要求1-13中任一項所述的標記物組中的兩種或多種質量標記物在分析方法中的應用。
58.如權利要求57所述的應用，其特徵在於，所述應用是在雙向電泳分析中。
59.如權利要求57所述的應用，其特徵在於，所述應用是在ニ維質譜分析中。
60.如權利要求57-59中任ー項所述的應用，其特徵在於，所述應用是在對ー個或多個核酸的測序方法中。
61.如權利要求57-59中任ー項所述的應用，其特徵在於，所述應用是在基因表達描述法中。
62.如權利要求57-59中任ー項所述的應用，其特徵在於，所述應用是在蛋白質表達描述法中。
63.如權利要求57-59中任ー項所述的應用，其特徵在於，所述應用是在核酸分類的方法中。
全文摘要
提供了一組兩種或多種質量標記物，組中各質量標記物包含通過可斷裂的連接物連接於質量歸一化部分的質量指示部分，該質量指示部分具有抗碎裂性，其中，組中各標記物的聚集質量可以相同或不同，組中各標記物的質量指示部分的質量可相同或不同，其中，在組中具有共同質量的質量指示部分的標記物的任何組合中，各標記物具有與該組合中的所有其它標記物不同的聚集質量，並且，在組中具有共同的聚集質量的標記物的任何組合中，各標記物具有其質量不同於該組合中所有其它質量指示部分的質量的質量指示部分，這樣組中所有的質量標記物可由質譜法得以相互區分。
文檔編號G01N33/58GK102839213SQ20121028532
公開日2012年12月26日 申請日期2001年3月14日 優先權日2000年3月14日
發明者G·施密斯, A·H·託馬斯, R·A·W·約翰斯通 申請人:電泳有限公司