包含脯氨酸特異性蛋白酶的食物產品的製作方法

2023-12-01 18:53:36

專利名稱：：包含脯氨酸特異性蛋白酶的食物產品的製作方法
技術領域：
：本發明涉及包含脯氨酸特異性蛋白酶的食物產品、其製備方法及其降解毒性或變應性麩質肽的用途。
背景技術：
：麩質(gluten)是小麥、大麥、裸麥、斯佩爾特小麥(spelt)和黑小麥中存在的常見膳食蛋白。已知攝入麩質在一些個體中會導致疾病。麩質是富含穀氨醯胺和富含脯氨酸的麩朊(gliadin)和麥谷蛋白(glutenin)的複雜混合物，其被認為會導致多種疾病。由於其胺基酸組成，這些麩質的特定部分能在人胃腸道中抵抗蛋白降解。因此，特定的、富含脯氨酸的肽可能增多，其可能導致不想要的作用，例如，對於多種此類麩質來源的肽不耐受性。例如，文獻(Arentz-Hansenetal,J.Exp.Med.2000;6:337-342;Vaderetal,Gastroenterology2002;122:1729-1737)已描述了導致在乳糜汙症(celiacdisease)患者中觀察到的麩質毒性的肽的胺基酸序列。乳糜瀉症是廣泛流行的小腸自身免疫疾病。在乳糜瀉患者中，觀察到了多種自身免疫病症的高度流行，所述病症尤其是I型糖尿病、皰疹樣皮炎、自身免疫性甲狀腺炎、膠原病、自身免疫性脫髮症和自身免疫性肝炎。乳糜瀉症偶爾也伴隨精神和神經方面的症狀，這表明富含脯氨酸的肽的代謝擾亂可能具有非常深遠的影響。目前僅終身食用不含麩質的膳食可有效預防乳糜瀉症患者的臨床症狀。但是，對於這些患者來說不幸的是因為麩質是便宜的蛋白，其具有令人感興趣的應用可能性，因此其廣泛用於各類食品中，包括市售的湯、醬油(soysauces)、醬料(sauce)、冰淇淋、薯片和熱狗中。麩質不耐受患者因此需要詳細的食品列表，以防止攝取有問題的麩質分子。畢竟，攝入低至每天50mg的麩質就可能導致臨床症狀的重現。現在我們理解到，麩質中存在的有問題的、富含脯氨酸的肽對於胃肽酶和胰腺肽酶(例如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等)的切割具有高度抗性。僅那些能水解涉及到脯氨酸的肽鍵的特異性酶才能大量水解富含脯氨酸的序列，由此破壞與乳糜瀉症相關的表位。已有報導，多種酶對於富含脯氨酸的毒性肽的失活有有益作用，例如，脯氨醯寡肽酶(EC3.4.21.26;Shanetal.6W置e297,p2275-2279)和二肽基肽酶IV(EC3.4.14.5;US-A-2002/0041871)。還有多份已公開的專利申請，其中提到了脯氨酸特異性蛋白酶在降低含麩質食品抗原性中的可能應用(如WO-A-2002/45523)以及此類酶在預防乳糜瀉和相關疾病的臨床症狀中的用途(例如，WO03068170禾nWO2005/027953)。最近，還通過使用十二指腸提取物，展示了酶療法在治療乳糜瀉患者中的有效性(CornelletaLScandinavianJournalofGastroenterology,2005;40:1304-1312)。WO-A-2002/45523特別提到將脯氨酸特異性內蛋白酶(endoproteas)用於對多肽(包括富含脯氨酸的肽)的蛋白水解。其描述了將內蛋白酶加入蛋白質性的食物產品，以遏制苦味或者降低其變異原性。在WO-A-2005/027953中公開，這種特殊的內蛋白酶可理想地適合作為膳食補充劑，以支持對膳食麩質的消化過程，因為其展示出寬的pH最優值，這使得酶在口中、食道、胃中都具有活性，並且在十二指腸也能繼續其活性。WO-A-2005/027953目標在於在食物被消費掉之前就從其中除去富含脯氨酸的毒性肽，由此防止身體暴露於富含脯氨酸的毒性肽或者使得這種暴露最小化。其還教導了將經穩定的酶製劑用作為消化助劑。以這種手段，酶與食品一起被被消費，從而在經過胃腸道期間降解食品中富含脯氨酸和/或富含穀氨醯胺的蛋白序列。但是，根據WO-A-2005/027953，酶製劑僅可被加入具有低於0.85的水分活度的富含脯氨酸和/或富含穀氨醯胺的食品中，以使酶保持足夠的活性。當食物產品將被貯藏更長的時間時，應當避免與水分或潮溼空氣的接觸，這暗示要使用經乾燥的食物。這種前提限制了可與內蛋白酶組合的食品選擇數量。在含水食品(例如植物黃油或類似塗抹醬(spread))中使用酶製劑一般是本領域所廣泛已知的。但是，在大多數情況下，酶作為加工助劑加入，而並不想要長期的酶活性，即，在產品包裝之後繼續的酶活性。例如，DE-A-10104945教導了含有磷脂和酶(例如轉穀氨醯胺酶)的低脂塗抹醬，並且不使用乳化劑或穩定助劑。在產品生產階段期間短時間孵育後，通過在95°C加熱2-3分鐘使轉穀氨醯胺酶失活。WO-A-95/28092關注於穩定助劑(例如多元醇)的使用，以對適用於食物的油包水乳劑加以穩定，其中，所述乳劑包含熱不穩定化合物，例如酶。與上面提到的兩份申請不同，WO-A-95/28092的目標是對酶活性進行長期穩定。為達到該目的，其舉例而言，在水相中有40-50%的甘油。但是，在食物產品中加入如此高含量的多元醇是不被允許的或者是感官上無法接受的。發明描述現已發現，脯氨酸特異性蛋白酶可用作為具有高水分活度並且缺少高含量酶穩定劑的食物產品中的成分。此類產品甚至可被巴氏滅菌，以確保足夠的耐貯藏性，而不會大量損失相關酶活性。在本發明中表明，在食物產品，例如三明治餡料(filling)、澆料(topping)、佐料(condiment)、醬料(sauce)、多種飲料和乳劑(例如低脂塗抹醬)中，脯氨酸特異性蛋白酶保持有足夠活性，足以實現對富含脯氨酸的麩質序列的充分胃水解。通常，食物產品的味道不會被酶的存在所影響或改變。酶在巴氏滅菌處理中的存活是令人吃驚的。因為本領域中認為，在高水分活度的條件下，絕大多數酶不能在巴氏滅菌條件下存活。類似地，人們預計在具有高水分活度的產品中貯藏時，絕大多數酶將在一周內失活。因此，根據本發明我們還出人意料地發現，如果將具有高水分活度的產品貯藏於冷藏條件下時，酶能在長至一年的時間內保持其活性。在冷藏條件下意味著溫度低於10°C，優選地，0-10。C之間，更優選地，2至8。C之間。本發明因此涉及經過巴氏滅菌的耐貯藏食物產品，其具有至少0.80，優選至少0.85的水分活度，並且含有脯氨酸特異性蛋白水解活性，所述活性高到足以對富含脯氨酸的蛋白序列進行去毒化。富含脯氨酸的蛋白序列的毒性量被認為是在超過1mg的麩質中所存在的量。根據本發明的另一方面，公開了耐貯藏的食物產品，其具有至少0.80的水分活度，優選至少0.85，且其含有脯氨酸特異性蛋白水解活性，所述活性高到足以對富含脯氨酸的蛋白序列進行去毒化，由此使得食物產品包含少於lw/wy。的蛋白或肽，優選地，食物產品是不含麩質的。本發明還涉及經滅菌的脯氨酸特異性蛋白酶。滅菌表示不含微生物，優選地，還不含微生物孢子。優選地，對脯氨酸特異性蛋白進行過濾，使其不含微生物，優選地，還不含微生物孢子。穀物蛋白可被進一步分為清蛋白、球蛋白、醇溶谷蛋白和谷蛋白。麩質是穀物(例如小麥、裸麥、斯佩爾特小麥、燕麥、大麥、玉米和水稻)經漂洗以除去澱粉和水可溶組分後剩餘的水不可溶蛋白。其還可被進一步分為麩朊和麥谷蛋白。麥谷蛋白可被進一步分為高分子量和低分子量亞基。關於麩質蛋白的進一步討論見WheatGluten(P.R.ShewryandA.S.Tathameds，.Cambridge:RoyalSocietyofChemistry,2000)或Wieser(1996)爿cto戶ae^Wr.Sw;p/.412:3-9的綜述。根據IUMB的國際公認的對所有酶的分類和命名體系，寡肽酶、二肽基肽酶和內蛋白酶是水解內部肽鍵的酶，進而可基於其催化機制將其分入亞類。適合本發明目的的優選脯氨酸特異性蛋白酶是來自Am'gw的酸穩定的且胃蛋白酶穩定的內蛋白酶，如WO-A-02/45524和WO-A-2005/027953所述，它們能在脯氨酸殘基的羧基側切割肽和完整蛋白，其還能在非常低的pH條件下和胃蛋白酶存在下切割肽和完整蛋白。該內蛋白酶在胃蛋白酶存在下的酸性條件下能夠存活，並且可能在整條十二指腸中都繼續保持其活性。最優選的內蛋白酶是源自食品級真菌A^e，7/w的脯氨酸特異性內蛋白酶或者屬於絲氨酸蛋白酶S28家族的脯氨酸特異性內蛋白酶。水分活度是物質中水的相對可獲得性。其在本領域中被定義為水的蒸汽壓除以同樣溫度下純水的蒸汽壓。因此，純蒸餾水具有恰好為1的水分活度。在食物產品中水分活度不同於水含量(％水)。水含量是樣品中存在的總的水，即，結合的水加上游離的水，而水分活度僅提供對游離水的量度，其通常被表示為aw或者平衡相對溼度百分比(％ERH)。食物產品的水分活度是當食物產品和周圍空氣之間建立起平衡時食物產品直接鄰接區域的空氣的恆定相對溼度。該恆定相對溼度進而被稱為"％ERH"(如果其表示為百分比的話(0-100%))或者"水分活度"(如果其表示為0至1.0之間的值的話)。用於測定水分活度的方法在AOACInternational(1995),Method978.18的官方分析方法中有詳細描述。在本申請文件中，"熱處理"表示至少65°C的熱處理，優選至少70°C，其持續至少2秒，優選至少20秒。此類熱處理的一個例子是巴氏滅菌，如針對奶應用的，S卩，在72。C加熱15秒。巴氏滅菌是技術人員已知的概念。得到的食物產品由此是微生物安全產品，其具有提高的保質期。"食物產品"表示下述產品或食物成分，其意欲被用於在不經預先熱處理(例如烘焙、煎炸或烹煮)的情況下被消費。具有延長的或提高的保質期的食物產品被理解為具有至少一周直至一年或更長的保質期，在該保質期內可以確保所述產品的感官性質和微生物安全性。明顯地，可允許的保質期很大程度上取決於食物產品的實際貯藏條件。很多珍貴的食物產品都必須冷藏，以使其保質期最大化。如果在本發明的食物產品中使用穩定助劑，特別是多元醇，例如甘油、山梨糖醇、蔗糖、聚丙二醇、海藻糖、麥芽糊精、乳糖和葡萄糖，那麼其含量通常少於食物產品的10wt%，優選少於5wt%。優選地，根據本發明的食物產品含有少於1。/。w/w的酪蛋白，更優選地，根據本發明的食物產品不含酪蛋白。攝取以丸劑或片劑形式存在的脯氨酸特異性蛋白酶可能允許麩質不耐受患者能夠安全消費此類含麩質食物產品。但是，現己發現，蛋白酶還可方便地加入進下述食物產品，所述食物產品自身可不含麩質或含低含量的麩質，但是所述食物產品通常與含麩質食品組合。更優選地，根據本發明的含內蛋白酶的食物產品是本領域中被認為是"不含麩質"的食物成分。根據CodexAlimentarius的"CodexStandardforGluten-FreeFoods"(CodexStan118-198)，當用於不含麩質的食物中時，源自含麩質穀物的食物成分的氮含量不可超過每100g產品0.05g(50mg)(基於乾物質而言)。根據本發明，公開了下述食物產品，其包含高於每份0.5PPU的脯氨酸特異性蛋白水解活性，即，在一份中存在的酶活性能夠水解25mg麩質。"一份"是一頓餐食期間消費掉的食物的量，所以其通常是在一個小時之內，優選40分鐘之內消費掉的。優選作為脯氨酸特異性蛋白酶載體的食物產品是冷藏貯藏的食物產品。尤其優選的是含蛋白酶的食物產品是佐料，S卩，用於增強其它食物(尤其是含麩質食物)味道的食品。佐料具有下述優點在家庭和餐廳、餐館及超市中豐富存在，典型地，具有長期保質期。佐料的優選例子是番茄醬或番茄汁。此類產品典型地具有低於4.2的pH，更優選地，低於4.0，這表明它們僅需要有限的巴氏滅菌處理。需要有限巴氏滅菌處理，並且優選適合作為活性脯氨酸特異性蛋白酶載體的其它酸性產品的例子是果汁和水果濃縮物。事實上，甚至經過酸化或碳酸化的瓶裝水也將是酶的優秀載體。"Shots"例如蔬菜或水果濃縮物也在該類別中。類似地，含有食品級防腐劑(例如苯甲酸鹽或山梨酸鹽)的酸性產品也是酶的優秀載體。例如，三明治餡料或澆料通常與具有高於0.85的水分活度值的含麩質食物(例如麵包)一起被消費。根本不需要巴氏滅菌的非常酸性的產品，例如，可樂，也是優秀的載體，因為脯氨酸特異性蛋白酶在這些條件下是非常穩定的。此外，所述的酶與含有高濃度存活益生菌的製品相當相容。通常，此類益生菌產品具有高於0.95的水分活度，其被低於4.0的pH所穩定。此外，本發明涉及製備含有本發明酶製劑的食物產品的工藝，其中，在對所述食物產品進行巴氏滅菌處理之後向食物產品中加入脯氨酸特異性蛋白酶。在該手段中，可在無菌條件下將酶加入進已經過巴氏滅菌的產品中。能夠用於進行該手段的技術的例子是無菌添加技術，例如TetraPak所出售的(TetmAldoseTMS;參見，例如http:〃www.tetrapak扁processing.de/produkte/pdf/aldose.pdf)。本發明的又一實施方式是油包水或水包油乳劑、塗抹醬，優選地，植物黃油或低脂塗抹醬。廣泛使用的、意欲用於與含麩質食品一起消費的低脂塗抹醬特別適合作為酶促消化助劑的載體。這些產品的高水分含量允許向其中引入大量的酶，典型地，所述產品被貯藏於冷的條件下，傳統地，7。C或更低的溫度下。因為酶被限定進水相，此類乳劑也屬於具有至少0.85的水分活度的產品類別。本發明的該實施方式的其它重要優點在於，麵包和塗抹醬在口中被徹底混合，由此引發脯氨酸特異性蛋白酶對麩質分子的降解。此外，已知，脂肪化合物的存在能通過口感機制來抑制胃的排空。這兩種機制都導致酶和麩質之間更強烈和更長期的相互作用，由此使得酶和麩質可在食糜到達十二指腸之前最大化地相互作用。這很重要，因為已知十二指腸是能引起富含脯氨酸的麩質分子的病原性反應的胃腸道的最上遊部分。我們發現，脯氨酸特異性蛋白酶，特別是根據WO-A-2002/45523的來自Am'ger的酸穩定脯氨酸特異性內蛋白酶，具有寬pH最優值，這使得其可在口中、食道、胃和十二指腸中都具有活性。脯氨酸特異性內蛋白酶被加入乳劑之後仍展示出這樣的高度保留的活性這一事實是相當出人意料的。現有的文獻都一致認定，與乳化劑接觸以及隨後加入乳劑中會對酶造成顯著的脅迫，很容易導致酶的失活(見，例如，Gatoraeetalin"StabilityandStabilisationofEnzymes,ElsevierSci.Publish.1993,p329或DeRoosandWalstra,ColloidsandInterfacesB;Biointerfaces6(1996)201-208)。因此，特別適合本發明的是下述酶具有脯氨酸特異性內蛋白酶活性，以及具有與WO2002/45523的SEQIDNO:2相同的胺基酸序列，或者與WO2002/45523的SEQIDNO:2的第1至526位胺基酸具有至少80%、至少90%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。胺基酸序列間的同一性水平通過WO2002/45523第15頁提到的方法來測定。根據本發明的酶製劑必須以對應於待消化的蛋白總量的量加入食物產品中。例如，典型地，向麵包片上應用低脂塗抹醬。典型地，向每片18克的麵包應用5克的塗抹醬。典型地，面包含有8%的蛋白，其中7%是麩質，即，一片面包含有1.5克蛋白。為在胃腸消化期間使用WO2002/45523所述的酶實現對存在的所有蛋白(即包括麩質級分)的充分水解，需要相對每克蛋白而言大約20PPU(定義見"材料和方法"章節)。因此，消化1.5克蛋白需要20PPU的1.5倍，即30PPU。這30PPU必須由5克低脂塗抹醬來提供，這表明低脂塗抹醬具有6000PPU/kg的酶活性。加入根據本發明的酶製劑幾乎不會影響到低脂塗抹醬的製備和性質。但是，為避免苦味的影響(這是用具有蛋白水解活性的酶處理之後的奶產品中通常報導的)，根據本發朋的塗抹醬優選缺乏疏水蛋白，例如酪蛋白。可通過加入經發酵的乳清蛋白來改善塗抹醬的味道，以提供典型的黃油味。我們發現，在經發酵的乳清中存在的殘餘蛋白會被脯氨酸特異性酶水解，但是這沒有負面的感官影響。優選在形成乳劑之前向水相加入脯氨酸特異性蛋白酶，最優選地，在對水相巴氏滅菌之後，但在形成乳劑之前，在無菌條件下加入脯氨酸特異性蛋白酶。存在有若干種方法來高效生產低脂塗抹醬。根據一種方法，含有乳化劑、香料、維生素和色素的油相被保持適當加熱，溫和攪動，以對油的質量不造成不利影響。然後將水相和油相混合起來，加入螺旋式換熱器(votatOT)。製備乳劑的更詳細描述可見文獻，例如，Moustafain:PracticalhandbookofSoybeanProcessingandUtilization;DavidR.Ericksoneditor,其是AOCSPress禾口UnitedSoybeanBoard的聯合出版物。現在，加入健康促進化合物，例如植物甾醇/甾垸醇(phytosterols/stanols)或花生四烯酸的塗抹醬正越來越受歡迎。因為它們是油可溶的化合物，因此，酶在水相中的穩定性不會被這些化合物影響。因此，本發明涉及製備含有本發明的酶製劑的食物產品的工藝，其中，在對所述食物產品進行巴氏滅菌之前或之後向食物產品中加入脯氨酸特異性蛋白酶。原則上，能水解涉及脯氨酸殘基的肽鍵的其它酶，例如，脯氨醯寡肽酶(EC3.4.21.26)或二肽基肽酶IV(DPPIV，EC3.4.14.5)或二肽基肽酶II(DPPII，EC3.4.14.2)也可使用。這些蛋白酶已由例如Augustyns等人(CurrentMedicinalChemistry,2005，12，971-998)列出。然而，為使脯氨酸特異性蛋白酶適於作為食物產品(含麩質食物或意欲與含麩質食物組合使用的食物產品)中的消化助劑，脯氨酸特異性蛋白應當0展示出允許在胃中主要的酸性pH值下有充足活性的pH最優值，優選低於pH5;ii)在上述酸性條件下，存在胃腸蛋白水解酶胃液素的時候能夠存活；iii)在含水環境中，至少在食物產品的保質期內保持活性。此外，還可能包括進輔酶，以獲得針對麩質蛋白水解的協同性。明顯地，輔酶必須滿足與食物產品中脯氨酸特異性酶相同的穩定性要求。本發明還涉及將脯氨酸特異性蛋白酶作用作為消化助劑，用於對上文所述的具有至少0.85的水分活度的經巴氏滅菌食物產品的生產中，以預防乳糜瀉症或與之相關的病症的臨床症狀。優選地，食物產品被意欲用於與含麩質食物產品組合消費。乳糜瀉症是對某些富含脯氨酸和穀氨醯胺的肽的不耐受導致的。對這些肽的不完全降解導致乳糜瀉症的發展和嚴重性。乳糜瀉症偶爾伴隨精神和神經方面的症狀。在1979年，Panksepp(TrendsinNeuroscience1979;2:174-177)就己提出了阿片肽過量理論，其中，他提出，被擾亂的阿片肽代謝是孤獨症發病機理的一部分。因此，含有本發明的內蛋白酶的食物產品還可被遭受精神性病症的患者使用，所述病症包括孤獨症、精神分裂症、ADHD、雙相性障礙和抑鬱症，這些全部都與對富含脯氨酸的膳食蛋白的消費相關。與乳糜瀉症相關的其它病症包含自身免疫性疾病，尤其是I型糖尿病、皰疹樣皮炎、腸癌、腸非霍奇金淋巴瘤、自身免疫性甲狀腺炎、膠原病、自身免疫性脫髮症和自身免疫性肝炎。此外，腸易激症候群(IBS)已經與難於消化的富含脯氨酸的蛋白序列聯繫起來。可從本發明受益的患者可能遭受上述任何病症。這些患者可以是任何年齡的，包括成年和兒童。兒童會從預防益處中特別受益，因為預防對毒性麩質肽的早期暴露可預防疾病的最初發展。弓1入脯氨酸特異性內蛋白酶製劑對於這類患者尤其有好處，因為佐料，特別是蛋黃醬和茄汁是該群體所歡迎的。可通過針對先天易感的遺傳測試，例如，通過HLA分型、通過家族病史、通過T細胞檢驗或者通過其它醫藥手段，來鑑定適合進行預防的兒童。圖例圖1:從"胃"中回收的T-細胞刺激表位的水平(沒有脯氨酸特異性內蛋白酶)。條件在實施例3中解釋。指具有反應活性的a-麩朊分子的水平，"y'指具有反應活性的7-麩朊分子的水平，"HMW"指具有反應活性的高分子量-麥谷蛋白的水平，"LMW"指具有反應活性的低分子量-麥谷蛋白的水平。圖2:從"胃"中回收的T-細胞剌激表位的水平(含有脯氨酸特異性內蛋白酶)。條件在實施例3中解釋。關於"a"、"7"、"HMW"和"LMW"的解釋見圖1。圖3:從"胃"中回收的T-細胞刺激表位的水平(有和沒有加入的脯氨酸特異性內蛋白酶，在用抗a-麩朊的Western印跡雜交中測試)。條件在實施例3中解釋。圖4:在53。C使低脂塗抹醬熔融，向水相中加入脯氨酸特異性內蛋白酶，以及在53。C對水/脂肪混合物進行10、70和IOO分鐘的振蕩之後，水相中殘餘的酶活性百分比。條件在實施例4中解釋。圖5:在多種溫度下保持的低脂塗抹醬水相中脯氨酸特異性內蛋白酶的保質期。條件在實施例5中解釋。材料和方法酶活性測試用CBZ-Gly-Pro-pNA(Bachem,Bubendorf，Switserland)作為底物，於37。，在檸檬酸鹽/磷酸二鈉緩衝液pH4.6中，對Am'ger脯氨酸特異性內蛋白酶活性加以測試。在405nm對反應產物進行分光光度監測。405nm處吸光度隨時間的增加是酶活性的量度。脯氨酸蛋白酶單位(PPU)被定義為在規定的條件下，0.37mMZ-Gly-Pro-pNA的底物濃度下，每分鐘釋放出1^imol對硝基苯胺的酶的量。對T細胞刺激性表位的定量檢測使用基於單克隆抗體(mAB)的競爭檢驗，對動態胃腸體外模型的可溶級分中麩朊和麥谷蛋白的T細胞剌激性表位的濃度加以測定。為達到該目的，在含有50mMNa2HP04/NaH2P04pH7.0、150mMNaCl、0.1%Tween-20和蛋白酶抑制劑混合物(Complete,RocheDiagnosticsGmbH,Penzberg,Germany)的緩衝液中稀釋樣品。檢驗都按照前文所述雙份重複進行(Spaenij-Dekkingetal，(2004)53，1267-1273)。通過IDSDS-PAGE和Western印跡雜交進行蛋白分析為測定動態胃腸體外模型的不同樣品固體(沉澱)級分中T細胞剌激性表位的水平，進行IDSDS-PAGE實驗。將固體級分溶解於6x蛋白樣品緩衝液(60%甘油、300mMTris(pH6.8)、12mMEDTApH8.0、12%SDS、864mM2-巰基乙醇、0.05%溴酚藍)中，在12.5%SDS-PAGE凝膠上跑。直接用ImperialProteinStain(Pierce,RockfordIL，USA)對蛋白進行觀察，或者在用對來自ot-麩朊和Y-麩朊(Spaenij-Dekkingetal,(2004)Gm53，1267-1273)禾QHMW-麥谷蛋白和LMW-麥谷蛋白(Spaenij-Dekkingetal.,Gastroenterology2005;797-806)的刺激性T細胞表位特異的mAb在PVDF膜上進行Western印跡雜交之後，對蛋白進行觀察。基於抗體的競爭檢驗為進行基於抗體的檢驗，在BalbC小鼠中，針對已知的T細胞剌激性a-麩朊、y-麩朊和LMW麥谷蛋白肽，產生單克隆抗體。將小鼠的脾與小鼠骨髓瘤細胞系融合後，獲得產生抗體的雜交瘤。通過有限稀釋來對它們加以克隆，對這些細胞分泌的mAb加以測試，所述測試針對它們在mAb競爭檢驗中的用途來進行。針對每種特異性，選擇兩種合適的mAb，對不同mAb識別的表位加以測定(表l)。表ltableseeoriginaldocumentpage14用mAb來發展競爭檢驗，由此可以低水平定量檢測出在完整蛋白和大小為大約ll個胺基酸的小肽(T細胞表位的大小)中都存在的T細胞刺激性表位。在競爭檢驗中，將樣品的不同稀釋液與固定濃度的生物素化的指示肽(其編碼T細胞表位)混合。為對麩朊檢驗加以定量，使用濃度範圍為10pg/ml-10ng/ml的歐洲麩朊標準物IRMM-480來製作標準曲線。用範圍為1嗎/ml-1ng/ml的編碼T細胞刺激性表位的合成肽，來對針對LMW麥谷蛋白的檢驗加以定量。而用範圍為1(ig/ml-1ng/ml的重組HMW麥谷蛋白胃蛋白酶/胰蛋白酶消化物，來對針對HMW麥谷蛋白的檢驗加以定量。通過經標記的鏈親和素觀察被生物素化的肽結合的抗體的存在。實施例1對脯氨酸特異性內蛋白酶的過濾滅菌過濾是對酶加以滅菌的優選選擇。可在色譜純化之後獲得將被滅菌的酶溶液，酶溶液可包含一種或多種溶劑或者其它添加劑，以調節酶活性，以及以進一步對酶加以穩定。合適的穩定劑例如山梨糖醇和甘油。甘油溶劑可以以酶溶液的IO至70w/w。/。的濃度加入，或者更優選地，30至60%w/w。可通過將酶溶液泵經滅菌過濾器來實現過濾滅菌。優選地，通過預過濾接著進行濾經0.22nm過濾筒的第二次過濾來進行過濾滅菌。通過滅菌計量設備，將由此滅菌的酶溶液加入容納容器中，所述容器含有之前已經巴氏消毒或滅菌的水性食物產品或食物成分。含酶的產品或食物成分可被直接包裝。如果酶溶液必須被併入脂肪塗抹醬或低脂塗抹醬，那麼經滅菌的酶溶液可以與經巴氏滅菌的水相混合，然後再在合適的、升高的溫度下用脂肪或油對其進行乳化。為獲得用於實驗室規模的滅菌酶溶液，通過下述流程對從Am'ger獲得的脯氨酸特異性內蛋白酶溶液加以過濾滅菌。將lml酶濃縮物裝入注射器，將滅菌過濾器(來自Millipore的表面積為4.91cm2的MillexGV0.22/mi)放到注射器頂部。用手壓後，酶溶液被壓流經0.22ym的Millipore過濾器，由此提供酶活性與過濾滅菌前的酶溶液活性相應的經滅菌溶液。實施例2在存在和不存在脯氨酸特異性內蛋白酶時，在動態胃腸體外模型中消化麵包食物經過胃腸道是非常動態的過程，其不能在體外模型中被靜態模擬。TNO(Zeist，TheNetherlands)開發的動態胃腸體外模型是有效的消化模型，其能高度模擬胃和小腸中連續的動態過程(Minekusetal,ATLA1995,23，197-209;Larssonetal,JSciFoodAgic1997，74，99-106)。這些模型中獲得的結果顯示了與在人和動物中進行的研究獲得的結果非常好的相似性。為測試在存在和不存在源自A^ger的脯氨酸特異性內蛋白酶的情況下白麵包的消化情況，在該動態胃腸模型中進行實驗。這些實驗在攝取了半固體食物後的年輕成人的胃腸道平均生理條件下進行。麵包首先被"咀嚼"，即在存在或不存在(參照)來自Am'gw的脯氨酸特異性內蛋白酶的情況下與唾液酶仔細混合5分鐘。在實際的實驗中，在存在或不存在100PPU脯氨酸特異性內蛋白酶的情況下，將70克白麵包(含有5克麩質)與11ml胃液一起均質。均質後，將混合物的25%加入體外消化系統。"吞咽"的唾液酶(澱粉酶)立即出現，而胃的酶(胃蛋白酶和胃脂肪酶)則逐漸分泌。胃蛋白酶在低於5.0的pH下開始變得有活性。在2.5小時中，胃的內容物逐漸通過"幽門瓣"釋放迸小腸。在十二指腸區室中，通過分泌碳酸氫鹽將pH控制為pH6.5。胰液(含有澱粉酶、脂肪酶和蛋白水解酶(例如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶))和膽汁逐漸分泌進十二指腸區室。分泌產物通過蠕動混合，混合經過來自胃的食物，並逐漸轉進空腸和迴腸區室。4-5小時後，小腸內容物的大約80%逐漸通過"回盲瓣"被遞送進"大腸"(採樣瓶)。經消化的化合物經由半透中空纖維膜系統從空腸和迴腸區室被持續滲析出來。滲析瓶每2小時更換一次。在麩質蛋白(和食物)經過動態系統的區室過程中，在下述時間點，從胃、十二指腸和空腸區室取大約2ml的小樣t=0、15、30、45、60、90、120、150、180和240分鐘。採集後立即在乾冰上對樣品進行冷凍，以終止酶活性。在每項實驗的末尾，在乾冰上採集多種區室中的殘餘物，在零下20°C貯藏於兩支10ml試管中。實施例3針對毒性麩質表位的存在對體外消化的麵包加以測試有兩種類型的試劑可用於測量食物樣品中麩質肽的存在從乳糜瀉症患者的小腸分離出來的T細胞克隆和特異於多種麩質肽的單克隆抗體。當麩質肽與易導致疾病的HLA-DQ2或HPA-DQ8分子結合後，T細胞克隆就對麩質肽產生應答。這些炎性T細胞應答被認為是乳糜瀉症的主要病因。特異於ot-麩朊、Y-麩朊、LMW麥谷蛋白和HMW麥谷蛋白中的肽的T細胞克隆是可獲得的(c.f.Walvande,Y.etal.，Eur.J.Immunol.29,3133-3139(1999)和Vaderetal.，Gastroenterology,122:1729-1737(2002))。特異於T細胞刺激性a-麩朊、Y-麩朊和低分子量(LMW)麥谷蛋白肽和高分子量(HMW)麥谷蛋白肽的單克隆抗體也是可獲得的，其已被包括進競爭檢驗，用於檢測食物樣品中的這些肽(Spaenij-Dekkingetal.,Gut，53:1267-1273(2004))。在時間點t=0、15、30、45、60、90和120分鐘收集、並且在加入和不加入脯氨酸特異性內蛋白酶的情況下製備胃和十二指腸級分，按照下述方案對其進行預處理，以使脯氨酸特異性內蛋白酶失活。首先使用1MNaOH將樣品pH升高至11-12，然後立刻使用1MHC1進行中和。在14000rpm離心10分鐘之後，收集多種樣品的沉澱團和上清液，在85。C加熱10分鐘，以終止任何殘留的酶活性。在20mM磷酸鹽緩衝液pH7，150mMNaCl、0.1%Tween-20、2x蛋白酶抑制劑混合物(沒有EDTA)中，製備上清液的1:40、1:200、1:IOOO和l:5000稀釋液。這些稀釋液和沉澱團級分都被貯藏於-20。C，直到第二天的測量。對樣品解凍之後，在競爭檢驗中，使用特異於a-麩朊、Y-麩朊和特異於LMW-麥谷蛋白和HMW-麥谷蛋白的單克隆抗體，對樣品的水溶性級分加以測試。為實現此目的，按照"材料和方法"一節所述，對樣品進行處理，對若干稀釋液加以測量。採用這些水溶性胃樣品獲得的結果示於圖1(在沒有脯氨酸特異性內蛋白酶的情況下產生的)和圖2(在有脯氨酸特異性內蛋白酶的情況下產生的)中。除了HMW-麥谷蛋白的例外之外，其它所有麩質組分都可被檢測到。獲得的數據清楚表明，加入來自A的脯氨酸特異性內蛋白酶對於可溶級分中這些麩質蛋白的存在具有顯著的影響甚至在t=0(即，向口服製劑中加入酶後不到1分鐘)時都可觀察到麩質蛋白/肽存在的強烈減少。在另一項實驗中，對胃樣品的水不溶性級分(即，沉澱團)進行SDS-PAGE，之後將分離的蛋白轉到PVDF-膜上。然後用ot-麩朊特異性抗體對這些膜染色(圖3)。雖然抗體在沒有脯氨酸特異性內蛋白酶的所有級分中都檢測到了麩朊，但是加入脯氨酸特異性內蛋白酶使得在45分鐘後的時間點時，信號強烈降低。在90和120分鐘的時間點，在從存在脯氨酸特異性內蛋白酶的情況下消化的材料獲得的胃樣品中，幾乎不能檢測到任何麩朊。從這些數據可以推斷出一旦麩質分子存在於水溶性級分中，那麼脯氨酸特異性內蛋白酶對於破壞麩質分子是非常高效的。因為用於本檢驗的抗體是特異於比T細胞刺激所需要的胺基酸序列要短的胺基酸序列的，這表明用脯氨酸特異性內蛋白酶進行的處理導致水溶性級分中可能有害的麩質樣分子的強烈降低。因為這些水溶性肽被認為會與那些與乳糜瀉症相關的受體位點高效相互作用，因此用水溶性麩質級分獲得的這些數據與體內狀況高度相關。相當令人吃驚地，脯氨酸特異性內蛋白酶還能水解存在於水不溶相中的麩質分子。90分鐘後，在用酶處理過的級分中不再能檢測到麩朊分子，而對照樣品中仍存在此類分子。本實施例中描述的結果合在一起表明根據本發明的脯氨酸特異性內蛋白酶能在模擬人胃中存在的條件的條件下降解麩質。此外，所述的酶可以非常高效地進行這一工作，使得幾乎不留下任何毒性麩質表位。實施例4脯氨酸特異性內蛋白酶與低脂塗抹醬生產的相容性為測試脯氨酸特異性內蛋白酶是否能在升高的溫度下暴露給乳化劑並且併入水/油乳劑的情況下保持活性，進行下述測試。在當地超市購買WinnerFoodBV,L叩ik,TheNetherlands生產的低脂塗抹醬"Halvarinevooropbrood"(40%脂肪)。列出的成分是作為乳化劑的脂肪酸單甘油酸酯和二甘油酸酯(E471)，作為防腐劑的山梨酸(E200)，檸檬酸，植物油和脂肪，水、香料、維生素A和D和鹽。在振蕩恆溫箱中測試低脂塗抹醬的熔融性質。在53°C低脂塗抹醬完全液化，導致水性層和脂肪層的緩慢分離。為將足夠量的脯氨酸特異性內蛋白酶包括進低脂塗抹醬，在50mlGreiner管中對含有大約10PPU/ml(關於酶的定義，參見"材料和方法")的15ml液體酶濃縮物進行冷凍乾燥。將乾燥的粉末(大約2.25克)與25克低脂塗抹醬混合，之後在振蕩恆溫箱中於53°C使混合物熔融，由此溶解經冷凍乾燥的酶粉末。在熔融和水/脂肪自發分離後立刻從水層取樣(300^U)進試管，冷卻至室溫。第一次取樣後，對含有液化乳劑和酶的試管進行10秒鐘的劇烈振蕩，放置於53°C。10、70和100分鐘後，再次從水性層取300pl樣品，取樣後接著進行劇烈振蕩。最後用pH4.2的100mM乙酸鹽緩衝液對從水性層獲得的所有樣品進行1000倍的稀釋，在微滴定板(MTP)檢驗中測量殘留的酶活性。為達到此目的，於40。C在TECANGeniosMTP讀數計(Salzburg,Vienna)中，於405nm採用10分鐘動力學測量，進行對合成肽底物Ala-Ala-Pro-pNA(Pepscan，Lelystad,TheNetherlands)的水解，產生三肽Ala-Ala-Pro和有顏色的pNA分子。使用底物Ala-Ala-Pro-pNA(而非Z-Gly-Pro-pNA)，因為Ala-Ala-Pro-pNA允許對小得多的酶的量加以測量。每個孔含有250底物溶液、3mMAAP-pNA(處於pH4.2的100mM乙酸鹽緩衝液)中，在TECANGeniosMTP讀數計中於40°C對其進行10分鐘的預加熱。通過加入50pl合適的酶稀釋液(在該情況下，1000倍)來開始反應。pNA分子的釋放進行15分鐘。用Magellan軟體(Tecan)來進行數據採集。記錄405nm處光密度的增加，在Excel中對其進行進一步處理，產生圖4所示的圖。塗抹醬熔融後脯氨酸特異性內蛋白酶的即刻活性被定義為100%。如這些結果所示，在53°C時，酶活性基本不被低脂塗抹醬環境所影響。甚至對熔融的塗抹醬加以振蕩以模擬乳化過程，也沒有影響或僅有極少影響，雖然會產生過多的泡沫。實施例5脯氨酸特異性內蛋白酶在低脂塗抹醬水相中的耐貯藏性為測試脯氨酸特異性內蛋白酶在低脂塗抹醬水相中的耐貯藏性，製備含乳酸的水相，其具有4.5的pH和0.98的水分活度。為防止水相的微生物汙染，在無菌條件下加入苯甲酸鈉的濃縮溶液，達到600ppm的濃度。然後在無菌條件下加入經滅菌過濾的脯氨酸特異性內蛋白酶，達到15PPU/克的酶活性。然後將該溶液分裝進大量的小滅菌管。其中一些小管放置於零下20。C用作為參照，其它小管放置於8。C和30°C。每隔數周測量若干小管中殘留的脯氨酸特異性酶活性。按照"材料和方法"章節詳細描述的流程來測量酶活性。如圖5所示的結果表明，如果被放置於8。C的環境溫度下，酶在這樣的高aw條件下能在至少50周的時間內保持完美的活性。實施例6用含酶的樹莓澆料對吐司麵包進行體外消化為闡釋使用含酶的澆料來促進對食物中毒性麩質分子破壞的概念，進行下述實驗。首先，製備250ml耐貯藏樹莓澆料。向204g液體酶濃縮物(12PPU/ml)中加入20.7克蔗糖、1.0克擰檬酸、0.02%樹莓香料(Givaudan,76525-36)和20.7g0.5%的糖精水溶液。各種成分溶解後，加入3.11克黃原膠(KeltrolRD,CPKelco,，Il)，通過仔細攪拌使其溶解。粘性物質的最終pH為3.7，最終的酶濃度為大約9.8PPU/g澆料，最終的水分活度為大約0.99。將苯甲酸鹽濃度調節至大約600ppm。以同樣的方式，製備空白產物，其含有提到的所有成分但是不含活性的脯氨酸特異性酶。作為先前實驗的對照(見實施例2和實施例3)，還在測試中包括進了純的、未增稠的酶溶液。為測試這些不同製備物在降解毒性麩質表位中的效力，進行體外消化測試，其中，多種表位的消失及時發生。為達到此目的，向每片(大約10克，含有1.4g蛋白質)可商業獲得的、烘烤的白小麥麵包(Bolletje,"Engelsetoast")應用各種存在形式的酶。由此一片被含酶的樹莓澆料覆蓋，一片被空白澆料(不存在酶活性)覆蓋，並且向一片上加入純的液體酶。在用含酶澆料和純的液體酶時，添加的酶活性都等於20PPU/g存在的蛋白。在麵包上應用各種產品5分鐘之後，切碎麵包，將其與60ml(對於對照和酶的液體種類而言)禾Q62.3ml(對於凝膠製劑而言)pH5.0的胃液模擬溶液(NaCl(4.8g/L、KC1(2.2g/L)、CaCl2(0.22g/L)和NaHC03(1.5g/L))混合，將含有來自豬胃的胃蛋白酶(Sigma，P-7012)的2.3ml同樣的溶液以500KU/L的濃度加到每種麵包上。在O分鐘獲得第一份樣品(即，加入胃蛋白酶溶液後5分鐘)。然後將每種混合物的pH逐漸降低，以模擬胃內容物的緩慢酸化。pH從pH5降低至pH4.5，第一次取樣之後15分鐘，取第二份樣品。在下一個15分鐘內，pH降低至pH4，在從實驗開始起算30分鐘時，取第三份樣品。按照下文所述取後續樣品:t=45分鐘(pH降低至3.5後)；t=60分鐘(pH降低至3.0後)；1=90分鐘(pH降低至2.5後)；然後pH降低至2.0，在120分鐘再取樣，最後在150分鐘取樣。所有樣品都立刻冷凍於液氮中，之後貯藏於-80。C。為測量多種製備物中殘留的麩質表位水平的水平，首先對冷凍的樣品進行完全的酶失活程序。將冷凍的樣品加熱至95攝氏度，30分鐘，然後將樣品的pH升高至11-12，然後降低至2，最後中和至pH6。然後再在95攝氏度對樣品加熱15分鐘，之後取1ml小樣，在Eppendorf離心管中離心30分鐘。得到的上清液含有水溶性級分，沉澱團含有非水溶性級分。按照Spaenij-Dekkingetal，(2004)Gut53,1267-1273(還見"材料和方法"章節)，使用基於單克隆抗體的競爭檢驗，來定量水溶性級分中殘留的T細胞刺激性表位的水平。這些競爭檢驗的結果(兩次獨立測量測得的平均值)示於表2中。Western印跡雜交後，觀察沉澱團級分中T細胞刺激性表位的殘留水平(見實施例3)。與針對水溶性級分獲得的數據類似，後一實驗中的結果(照片未示出)證實了兩種含酶製備物對多種T細胞刺激性表位的有效破壞。總而言之，獲得的數據清楚表明，在類似胃的條件下孵育大約30分鐘的情況下，兩種含酶製備物(純的游離形式的酶或者具有高水分活度的凝膠化果醬狀產品)都能有效破壞大多數T細胞刺激性麩質表位。在目前的(體外)實驗設置中，僅LMW(低分子量)級分看起來對酶促降解有一定抗性。表2:水溶性級分中殘留的T細胞刺激性表位(以微克/毫升表示)的水平tableseeoriginaldocumentpage22tableseeoriginaldocumentpage23權利要求1.一種經巴氏滅菌的食物產品，其具有至少0.80的水分活度，優選至少0.85，並且包含脯氨酸特異性蛋白酶。2.—種食物產品，其具有至少0.80的水分活度，優選至少0.85，並且包含脯氨酸特異性蛋白酶，其中，所述食物產品包含少於1w/wC/。的蛋白或肽。3.根據權利要求1或2所述的食物產品，其是不含麩質的食物產品。4.根據前述任意一項權利要求所述的食物產品，其是佐料、澆料、三明治餡料、醬料、飲料或乳劑，例如塗抹醬。5.根據前述任意一項權利要求所述的食物產品，其是低脂塗抹醬。6.根據前述任意一項權利要求所述的食物產品，其中，所述脯氨酸特異性蛋白酶在1至7之間的pH值下具有最優活性，優選在2至6之間的pH值下具有最優活性。7.根據前述任意一項權利要求所述的食物產品，其中，所述脯氨酸特異性蛋白酶源自^^er^7/w或者屬於絲氨酸蛋白酶的S28家族。8.—種工藝，用於製備根據前述任意一項權利要求所述的食物產品，其中，向所述食物產品中加入脯氨酸特異性蛋白酶，接著對所述食物產品進行巴氏滅菌。9.一種工藝，用於製備根據權利要求1或2-6所述的食物產品，其中，向經過巴氏滅菌的食物產品中加入脯氨酸特異性蛋白酶。10.根據權利要求8或9所述的工藝，其中，向經過巴氏滅菌的食物產品中加入滅菌的脯氨酸特異性蛋白酶。11.脯氨酸特異性蛋白酶在生產經巴氏滅菌的根據權利要求1-7中任意一項所述的食物產品中的用途。12.根據權利要求11所述的脯氨酸特異性蛋白酶的用途，用於防止富含脯氨酸的食物導致的任何有害影響。13.根據權利要求11所述的脯氨酸特異性蛋白酶的用途，用於防止乳糜灣症或與其相關的病症的臨床症狀。14.根據權利要求11至13所述的用途，其中，所述食物產品是意欲與含麩質食物一起消費的。15.根據權利要求12或13所述的用途，其中，所述有害影響或與乳糜瀉症相關的病症包括自身免疫性疾病，尤其是I型糖尿病、皰疹樣皮炎、腸癌、腸非霍奇金淋巴瘤、腸易激症候群、自身免疫性甲狀腺炎、膠原病、自身免疫性脫髮症和自身免疫性肝炎，以及精神病症，包括孤獨症、精神分裂症、ADHD、雙相性障礙和抑鬱症。16.滅菌的脯氨酸特異性蛋白酶。全文摘要本發明涉及經巴氏滅菌的食物產品，其具有至少0.80的水分活度，優選至少0.85，並且包含脯氨酸特異性蛋白酶。文檔編號A23J3/00GK101511211SQ200780004484公開日2009年8月19日申請日期2007年1月30日優先權日2006年2月2日發明者埃米爾·德德克,路泊·埃登斯申請人:帝斯曼智慧財產權資產管理有限公司