冰芯中微量硝酸鹽的NO3‑‑17O同位素檢測方法與流程

2023-12-01 15:42:46 5

本發明涉及一種對冰芯中微量硝酸鹽的NO3--17O同位素檢測方法。

背景技術：

國內外用於分析硝酸鹽中氮或氧穩定同位素方法主要有：熱解法，利用陰離子樹脂分離、陽離子交換膜轉化、高溫熱解產生O2以及同位素質譜分析。這種方法僅能測量NO3-中的氧同位素；中科院南京土壤所曹亞澄等用化學反應方法把硝酸鹽樣品轉化成 N2O氣體，並用帶有自動預濃縮裝置的同位素質譜儀測定N2O中的15N豐度，主要應用在土壤中NO3-中氮同位素研究，這種方法只能測NO3-中的氮同位素。 中國地質科學院水文地質環境地質研究所張翠雲等；中國農業科學院農業環境與可持續發展研究所，徐春英、李玉中等公開的反硝化細菌法測試技術，是將樣品中的硝酸鹽轉化成N2O氣體，經過富集提純後進行氮氧穩定同位素質譜分析，這種方法只能測試N2O中的δ18O/16O和δ15N/14N。雖然上述的測試手段已很成熟，但是NO3--17O研究尤其是對冰芯中微量NO3--17O研究目前在國際上尚屬於起步階段，在我國基本沒有開展。

近幾年的研究發現氮氧化合物在大氣中經過複雜的光化學反應形成NO3-，沉降到冰川表面並記錄在冰芯中，對積雪和冰芯中NO3-中δ18O、δ15N和17O記錄的耦合研究可以反演歷史時期N元素循環過程，反演歷史時期大氣氧化能力的演替過程。準確精確的測量冰芯中NO3-穩定同位素組成，是開展物源示蹤和大氣氧化能力的歷史演替過程，也是評估和治理大氣及水環境汙染的基礎。冰芯樣品硝酸鹽的含量極低，冰芯樣品極其珍貴，滿足分析需要的樣品量大。因此在借鑑前人研究的基礎上，需要一套針對性強的測試技術手段和相對應的分析方法。為了實現對硝酸鹽中δ15N/14N、δ18O/16O和δ17O/16O或excess17O/16O的分析測定，針對冰芯樣品硝酸鹽含量低樣品珍貴（N2O的含量很低，一般相當於50nmol）檢測要求高等特點，基於目前成熟的高效濃縮富集水溶液中微量NO3-的手段和反硝化細菌法，將NO3-轉化成N2O的提取技術，總結出一套針對冰芯樣品中微量硝酸鹽氮氧同位素檢測實用方法，並對其測試原理、操作方法、分析流程以及各段氣流壓力和參數設置進行必要研究很有意義。

技術實現要素：

鑑於上述，本方法基於高效濃縮富集水溶液中微量NO3-的手段以及反硝化細菌法將NO3-轉化成N2O技術，提供一種冰芯中微量硝酸鹽的NO3--17O同位素檢測方法。本方法利用氧化亞氮氣體氮氧同位素富集分析裝置，針對冰芯中微量硝酸鹽的NO3--17O同位素檢測方法提出關鍵技術，保證實施的可行性。其中高效濃縮富集水溶液中微量NO3-的技術，使用的是ISC3000離子色譜儀及其分析系統，採用陰離子的濃縮富集柱AG11-HC對冰芯樣品進行富集分析，根據所測試的冰芯樣品中所含NO3-的濃度範圍，確定最少取樣量（一般極地冰芯中NO3-的濃度大於100ppb，山地冰芯中NO3-的濃度大於200ppb）。反硝化細菌法將NO3-轉化成N2O技術是首先要挑選適合的反硝化細菌，然後在培養基中完成對細菌的培養，將細菌加入含有NO3-的冰芯樣品中使NO3-轉化為N2O氣體，最後收集生成的N2O氣體。本發明的目的是這樣實現的：

一種冰芯中微量硝酸鹽的NO3--17O同位素檢測方法，其步驟為：

a.冰芯水溶液微量NO3-富集測試分析過程：將融化後的冰芯水樣品進入ISC3000離子色譜儀分析系統19，用帶有AG11-HC型陰離子的濃縮富集柱對冰芯樣品進行富集分析，根據所測試的冰芯樣品中所含NO3-的濃度值確定樣品量；

b. 反硝化細菌法將NO3-轉化成N2O過程：反硝化細菌法提取系統20主要包括細菌培養箱、恆溫水浴搖床、真空箱以及頂空樣品瓶5，先挑選無N2O還原酶的反硝化細菌如綠針假單孢菌、致金色單孢菌等進行復活復壯；然後使用胰蛋白大豆肉湯作為培養基對細菌培養；再將培養好並濃縮後的菌液注入裝有冰芯樣品的樣品瓶5中過夜反應，並注入NaOH反應瓶中吸收其中的CO2後停止細菌反應；最後將反應生成的含有N2O氣體的樣品瓶5收集後備；

c. 恆量N2O氣體氮氧穩定同位素分析測試過程：

1）吹掃準備過程：將收集好的樣品瓶5放置在自動取樣器的樣品架上，十通閥A置於load狀態，打開吹掃閥21，同時打開反吹閥22，這時由吹掃閥21引入的一路流量為40ml/min的He氣吹掃樣品瓶5的取樣口處，以維持取樣針14扎針前樣品瓶口環境的潔淨；同時一路流量為10ml/min的He載氣1由反吹閥22導入，由十通閥A的接點（a2、 a3）通過針載氦氣管17吹出，確保氦氣和頂空樣品一起由取樣通路流出，取樣針14扎穿樣品瓶5的密封墊時，取樣針14和針載氦氣管17要深入樣品瓶5液體底部吹掃。

Ⅱ）扎針取樣過程：取樣針14在樣品瓶5扎針到位的同時，關閉吹掃閥21，這時流量為10ml/min的氦氣由針載氦氣管17引入樣品瓶5，在氦氣的增壓下攜帶樣品瓶5中的混合氣體流經電冷阱2，冷凍去除大部分水蒸汽，通過裝有高氯酸鎂和鹼石灰的化學阱3乾燥和去除CO2，餘下組份通過VOC阱4，去除細菌轉化過程中形成的大部分易揮發性氣體，流經液氮冷阱LN1 6，N2O樣品在液氮冷阱LN1 6中冷凍富集，其餘不易冷凍氣體成份隨載氣由十通閥A接點（a7、a6）連通放空排出。

）N2O氣體的轉移富集過程：待取用足量的樣品（N2O）後，將十通閥A轉換到添加（inject）狀態，拔出取樣針14，將電冷阱2和VOC阱4升溫，排出水汽和VOC氣體；將冷阱LN27降溫，液氮冷阱LN16從液氮罐中提出，富集在液氮冷阱LN16中的氧化亞氮在He載氣1下由液氮冷阱LN16轉移至冷阱LN2 7中冷凍提純再富集。

）N2O氣體裂解分析過程：

將十通閥A轉換到負載（load）狀態，六通閥B置於負載（load）狀態，將冷阱LN27升溫，一路流量為1.5ml/min的He載氣1攜帶著冷阱LN27中的N2O氣體在0.32mmX30m的PoraPlot-Q的毛細管色譜柱8進行分離後由六通閥B的接點（b2、b3）連通進入900℃金催化劑裂解爐9，N2O被裂解成N2和O2，裂解後生成的氣體通過5A分子篩毛細管色譜柱10分離，樣品再經去水阱11進一步乾燥進入樣品開式分流接口12進行分流。最後進入氣體同位素比質譜儀13進行N2和O2的δ15N/14N和δ17O/16O或excess17O/16O和δ18O/16O同位素分析。

本發明的優點是：

本發明提供一種冰芯中微量硝酸鹽的δ15N/14N和δ17O/16O或excess17O/16O和δ18O/16O分析技術，其優點體現在：針對性強，主要針對密封瓶中NO3-溶液經細菌轉化後的微量氧化亞氮氣體，這部分氣體是位於密封瓶中液面以上部分的頂空樣品；增加吹掃功能：確保取樣時環境潔淨，測試結果準確和穩定；使用反吹閥：首先是在扎針前保持取樣管路的清潔，不要讓環境空氣汙染管道；其次是每次扎針取樣後及時將樣品留在取樣通路中的蒸汽或者其它有機物顆粒反向吹出，以免管路堵塞甚至取樣針堵塞; 使用VOC阱去除大部分樣品中的VOC氣體，剩餘的採用色譜分離的方法排除，避免VOC氣體在裂解爐中消耗樣品中的氧。同樣，冷凍的大部分VOC氣體可以通過升溫並反吹排出,保證了進入質譜的樣品純度，提高測試精度；使用特製金裂解爐，完成對硝酸鹽的δ15N/14N和δ17O/16O或excess17O/16O和δ18O/16O全分析。

本方法提供完整的測試流程和各段氣流的壓力和流量參數，結合整套分析儀的使用給出了關鍵的技術路線，方便推廣並具有很好指導意義。

附圖說明

圖1 是本發明N2O取樣富集狀態原理圖

圖2 是本發明N2O轉移富集狀態原理圖。

圖 3 是本發明N2O裂解分析狀態原理圖。

圖 4 是本發明參考氣體開式分流接口示意圖。

具體實施方式

本發明採用電冷阱(2)溫控範圍在-10℃~100℃，溫度在-10℃時凍結N2O氣體中水分，升溫狀態下將凍結的水分排出系統；化學阱（3）內裝高氯酸鎂和鹼石灰主要用來乾燥和去除CO2氣體； VOC 阱（4）放在酒精液氮中，溫度控制在-60℃~ -80℃，主要用來去除反消化細菌法製備N2O氣體時產生的有機氣體成分，避免VOC氣體在裂解爐中消耗樣品中的氧。同時，冷凍的大部分VOC氣體還可以通過升溫方式反吹排出,保證了進入質譜的樣品純度，提高測試精度；裂解爐（9）為特製金裂解爐，溫度在800℃~900℃，金作為催化劑裂解N2O氣體成N2和O2；色譜柱（10）為5A分子篩分離柱，主要用來分離N2和O2；樣品氣的開分流器（12）維持一路流量為8.0ml/min的He載氣（1）；同位素質譜儀（13）為MAT253氣體穩定同位素質譜儀，樣品氣體通過針閥由石英毛細管進入同位素質譜儀（13）完成氮氧同位素分析測試；參考氣開式分流接口（18）分別通有參考氣O2(15)、參考氣N2（16）和流量為4.0ml/min的He載氣（1）；離子色譜分析系統（19）為ISC3000離子色譜儀，主要完成對冰芯樣品硝酸鹽富集提取，這是獲取足夠分析量硝酸鹽樣品基礎；反硝化細菌法提取系統（20）主要完成細菌挑選、細菌培養、樣品NO3-轉化為N2O以及恆量的N2O氣體的獲取，這是提取N2O氣體的重要環節；取樣針（14）和針載氦氣管（17）為整體同步動作。

下面，結合附圖，對本發明的技術方案和實施過程作進一步的說明：

如圖1-4所示，十通閥(A)的十個接點：（a1、a2、a3、a4、a5、a6、a7、a8、a9、a10）、間切換有負載（load）和添加（inject）兩種狀態：在十通閥(A)處於負載（load）狀態時，可以完成樣品瓶的吹掃和瓶中N2O氣體的取樣。在此狀態下：一路流量為10ml/min的He載氣（1）由反吹閥（22）通過毛細管進入十通閥(A)的接點（a2）、（a3）和針載氦氣管（17）到樣品瓶(5)中，樣品瓶(5)內頂空的混合氣流在He載氣壓力下由插入樣品瓶(5)中的取樣針（14）流出，依次通過電冷阱(2)、化學阱（3）、VOC 阱（4）和十通閥(A)接點(a1、a10）進入液氮冷阱LN1（6）中，N2O樣品在液氮冷阱LN1冷凍（6）富集，未凍結氣體由十通閥(A)接點（a7、a6)連通放空排出；一路流量為1.5ml/min的He載氣（1）通過毛細管和十通閥（A）接點（a9、a8）、冷阱LN2（7）、色譜柱（8）和六通閥（B）的接點(b2)連接，維持此段管路的潔淨；一路流量為10ml/min的He載氣（1）維持十通閥(A)的接點（a4、a5）管路潔淨；十通閥（A）處於添加（inject）狀態時，可以完成N2O氣體的轉移和再富集，在此狀態下：一路流量為1.5ml/min的He載氣（1）通過毛細管由十通閥(A)接點（a9）、（a10）進入，攜帶液氮冷阱LN1（6）升溫後的氧化亞氮氣體通過十通閥(A)接點（a7、a8）轉移到冷阱LN2（7）（降溫狀態）中冷凍富集；一路流量為10ml/min的He載氣（1）由反吹閥（22）進入，由十通閥(A)接點（a2、a1）、VOC 阱（4）、化學阱（3）、電冷阱(2)、取樣針（14）的連通排出，及時將樣品留在取樣通路中的蒸汽或者其它有機物顆粒反向吹出，以免管路堵塞甚至取樣針堵塞；一路流量為10ml/min的He載氣（1）十通閥(A)接點（a4）進入，通過（a3）後由針載氦氣管（17）放空排出，維持此段管路的氦氣環境；

六通閥B的六個接點：（b1、b2、b3、b4、b5、b6）間切換有負載（load）和添加（inject）兩種狀態。六通閥(B)的負載（load）狀態是N2O氣體的裂解和分析狀態，在此狀態下：一路流量為1.5ml/min的He載氣（1）通過毛細管攜帶冷阱LN2（7）中升溫後的N2O氣體由六通閥(B)的接點(b2、b3）連通進入900℃裂解爐（9）中高溫裂解，裂解後生成的N2和O2經色譜柱（10）分離後流經去水阱（11），除水後的氣體進入樣品氣的開始分流接口（12）中和氣體同位素質譜儀（13）在線完成對N2和O2氮氧穩定同位素分析；一路流量為1.5ml/min的He載氣（1）和六通閥(B)的接點(b4)、（b5）連接；.六通閥(B)的添加（inject）狀態和十通閥(A)的負載（load）狀態組合來完成N2O氣體的富集和提純：一路流量為1.5ml/min的He載氣（1）從去水阱（11）通過，維持去水阱（11）中氣體的乾燥；一路流量為4.0ml/min的He載氣（1）由六通閥(B)接點（b4）進入，依次通過接點（b3）、裂解爐（9）、色譜柱（10）、六通閥(B)的接點（b6）、(b5)連通排出，維持管路潔淨。

冰芯中微量硝酸鹽的NO3--17O同位素檢測方法實施過程如下：

1、冰芯水溶液微量NO3-富集測試分析過程：將融化後的冰芯水樣品進入ISC3000離子色譜儀分析系統19，用帶有AG11-HC型陰離子的濃縮富集柱對冰芯樣品進行富集分析，根據所測試的冰芯樣品中所含NO3-的濃度值確定樣品量，這是獲取足夠分析量硝酸鹽樣品基礎。

2、反硝化細菌法將NO3-轉化成N2O過程：反硝化細菌法提取系統20主要包括細菌培養箱、恆溫水浴搖床、真空箱以及頂空樣品瓶5，其方法為：首先挑選無N2O還原酶的反硝化細菌如綠針假單孢菌、致金色單孢菌等進行復活復壯；然後使用胰蛋白大豆肉湯作為培養基對細菌培養；再將培養好並濃縮後的菌液注入裝有冰芯樣品的樣品瓶5中過夜反應，並注入NaOH反應瓶中吸收其中的CO2後停止細菌反應；最後將反應生成的含有N2O氣體的樣品瓶5收集後備用，這是提取N2O氣體的重要環節。

3、恆量N2O氣體氮氧穩定同位素分析測試過程：

1）吹掃準備過程：將收集好的樣品瓶5放置在自動取樣器的樣品架上，十通閥A置於load狀態，打開吹掃閥21，同時打開反吹閥22，這時由吹掃閥21引入的一路流量為40ml/min的He氣吹掃樣品瓶5的取樣口處，以維持取樣針14扎針前樣品瓶口環境的潔淨；同時一路流量為10ml/min的He載氣1由反吹閥22導入，由十通閥A的接點（a2、 a3）通過針載氦氣管17吹出，以保持管路的暢通，避免有死體積存在。為了確保氦氣和頂空樣品一起由取樣通路流出，取樣針14扎穿樣品瓶5的密封墊時，取樣針14和針載氦氣管17要深入樣品瓶5液體底部吹掃。

由於頂空樣品瓶5中收集的樣品氣體量少壓力小，扎針取樣時外界空氣容易進入,進入的空氣主要氣體成分如N2和O2會直接影響到最終測試的N2和O2的準確性，因此必須保證本過程取樣的氦氣環境。

Ⅱ）扎針取樣過程：取樣針14在樣品瓶5扎針到位的同時，關閉吹掃閥21，這時流量為10ml/min的氦氣由針載氦氣管17引入樣品瓶5，在氦氣的增壓下攜帶樣品瓶5中的混合氣體流經電冷阱2，冷凍去除大部分水蒸汽，通過裝有高氯酸鎂和鹼石灰的化學阱3乾燥和去除CO2，餘下組份通過VOC阱4，去除細菌轉化過程中形成的大部分易揮發性氣體，流經液氮冷阱LN16，N2O樣品在液氮冷阱LN16中冷凍富集，其餘不易冷凍氣體成份隨載氣由十通閥A接點（a7、a6）連通放空排出。

由於N2O的總量很少，為了保證取樣的完整性，應該加大取樣的氦氣流量，以儘快將頂空部分的樣品衝刷乾淨。但若氣流量過大，不利於雜質氣體的冷凍排除，也不利於N2O的冷凍富集，本發明冰芯樣品取樣氣流在5~20ml/min

）N2O氣體的轉移富集過程：待取用足量的樣品（N2O）後，將十通閥A轉換到添加（inject）狀態，拔出取樣針14，將電冷阱2和VOC阱4升溫，排出水汽和VOC氣體；將冷阱LN27降溫，液氮冷阱LN16從液氮罐中提出，富集在液氮冷阱LN16中的氧化亞氮在He載氣1下由液氮冷阱LN16轉移至冷阱LN27中冷凍提純再富集。

由於毛細管色譜柱8所能承載的流量一般在0.7~2ml/min，基於峰形考慮，希望冷凍N2O的體積愈小愈好，本發明選擇1.5ml/min載氣流速載入色譜柱中進行分離。

）N2O氣體裂解分析過程：

將十通閥A轉換到負載（load）狀態，六通閥B置於負載（load）狀態，將冷阱LN27升溫，一路流量為1.5ml/min的He載氣1攜帶著冷阱LN27中的N2O氣體在0.32mmX30m的PoraPlot-Q的毛細管色譜柱8進行分離後由六通閥B的接點（b2、b3）連通進入900℃金催化劑裂解爐9，N2O被裂解成N2和O2，裂解後生成的氣體通過5A分子篩毛細管色譜柱10分離，樣品再經去水阱11進一步乾燥進入樣品開式分流接口12進行分流。由於質譜儀能接受的樣品氣流量很小，要將載氣送來的樣品在樣品開式分流接口12進行分流，最後進入氣體同位素比質譜儀13進行N2和O2的δ15N/14N和δ17O/16O或excess17O/16O和δ18O/16O同位素分析。

在氣體同位素比質譜儀13分析色譜峰時，其間插入相應參考氣O2 15、或參考氣N216，以便獲得相對於國際標準的比值。N2 測定時質譜儀的接收杯分別接收到 m/z 28：[14N14N]+、m/z 29：[14N15N]+ 30：[15N15N]+的離子峰；O2測定時質譜儀的三個接收杯分別接收到 m/z 32：[16O16O]+、m/z 33：[ 16O17O]+、m/z 34[16O18O]+的離子峰，然後根據m/z 28與m/z29由同位素比值計算公式計算出N2的δ15N/14N；根據m/z 32、m/z 33和m/z 、 34 m/z 由同位素比值的計算公式計算出比值O2中的δ18O/16O和δ17O/16O或excess17O/16O。同位素比值的計算公式計算公式為：

其中R樣品為樣品的同位素比值, R標準為標準物質的同位素比值

）取樣結束後（十通閥A添加（inject）狀態）：打開吹掃閥21和反吹閥17，隨即拔出取樣針14。然後關閉吹掃閥21（節省氦氣），保持反吹閥17開啟，這時由反吹閥17導入的一路流量為10ml/min的He氣通過十通閥A的接點a2、a1進入，依次通過VOC 阱4、化學阱3、電冷阱2、取樣針14反向吹出, 及時將留在取樣通路中的蒸汽或有機物顆粒反向吹出，以免管路堵塞甚至取樣針堵塞。