促紅細胞生成素基因的克隆及其表達細胞系的製作方法
2023-12-09 09:40:41 1
專利名稱：促紅細胞生成素基因的克隆及其表達細胞系的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體地說涉及一種編碼中國人的EPO基因組DNA，以及將中國人的促紅細胞生成素基因轉移到BHK細胞中和能夠生產有生物活性的多肽促紅細胞生成素的哺乳動物細胞系。
促紅細胞生成素(Erythropoietin.EPO)是由腎臟產生的一種酸性糖蛋白類激素，作用於造血幹細胞，促進紅細胞的生成。1985年EPO基因已被克隆，國內外許多學者都進行了EPO表達的研究。所用的材料涉及EPO的cDNA、基因組基因以及EPO基因的PCR產物。表達載體所用的啟動子有SV40及Ad-MLP等。所選用的細胞系有淋巴母細胞、CHO dhfr缺陷型細胞和COS-7細胞等。表達量從數十個毫單位每毫升細胞增減液到幾千單位不等。腎臟疾病會引起促紅細胞生成素合成不足，從而引起貧血。用基因工程方法從培養的細胞系中生產的重組的促紅細胞生成素，可以用來治療多種貧血疾病。如慢性腎功能性貧血、癌症病人放化療後引起的貧血、以及手術後貧血的恢復等。經臨床證實其療效確實可靠，並基本上沒有副作用因此具有非常好的應用前景。關於促紅細胞生成素生產國內外已有多項專利申請，內容涉及EPO的基因、對EPO的基因的改造、以及在dhfr缺陷型CHO細胞表達EPO的方法等。
本發明的目的在於提供了一種用於定向篩選目的基因的基因文庫的構建方法，並從這一文庫中克隆了中國人EPO的基因組基因以及通過本發明構建了EPO表達細胞系；該細胞系可以用於生產，提取到有生物活性的促紅細胞生成素，應用於臨床，治療各種貧血疾病。建立了利用非dhfr缺陷型細胞表達EPO基因的方法，可解決生產上缺陷型細胞較難培養的困難。
本發明的內容1 構建了基因組不完全文庫，進行定向篩選，使EPO基因在文庫中得以富集，順利的獲得了包括5′-調控成分及3′-側翼序列12.5Kb長的中國人EPO基因組基因。見
圖1。在EPO基因的編碼區發現有兩個核苷酸的差異，在第90位的核苷酸處有一個G的缺失，在第一個內含子666位的核苷酸處有一個C的插入。其序列詳見表1。這兩個核苷酸的差異改變了5′-調控區的ORF。表2列舉了這4個ORF。
2 構建了在非dhfr缺陷型細胞中表達的EPO表達載體。
(1)將2.4Kb的EPO基因編碼區插入到質粒pRSV/CAT中，構建了G418抗性的表達載體pRSV/EPO。這一載體帶有RSV-LTR的啟動子及SV40的一個內含子，可進行誘導表達。
(2)為了能在BHK細胞中進行加壓培養，構建了帶有潮黴素-B抗性基因和二氫葉酸還原酶基因(dhfr)的表達載體pHY/dhfr。通過與pRSV/EPO共轉染，經潮黴素-B和G418雙抗性篩選，可獲得既表達EPO又表達dhfr的細胞株，在MTX的壓力下可提高EPO的表達量。
3 EPO高效穩定表達細胞株的克隆。
用表達載體pRSV/EPO經脂質體法轉染BHK細胞，經G418抗性篩選，獲得了表達量為180單位/106細胞的克隆B8細胞株。對該細胞株進行第二次轉染，將pHY/dhfr質粒導入細胞，經潮黴素-B篩選後，在MXT壓力下，獲得了表達量為1600單位/106細胞的克隆B812細胞株，該細胞株已經保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，登記註冊編號為CGMCC NO.0306。這一細胞株經高密度培養，可獲得超過20000單位/毫升的產量。即可以從每升細胞培養液中得到超過200毫克的名義產量。
本發明的優點1 克隆了中國人EPO基因，用基因組基因做表達比cDNA的表達量高。
2 構建的表達載體pRSV/EPO是在充分考慮了EPO基因的轉錄起始效率、內含子的拼接、5′-非翻譯區和3′-非翻譯區對表達效率的影響等因素，為高效表達提供了基礎。
3 設計了pHY/dhfr表達載體，為在非dhfr陰性細胞中用MTX加壓培養提供了基礎。
4 獲得了高效表達細胞株，表達量為1600單位/106細胞，在高密度培養時可獲得超過200mg/升的產量。
用下面的實施例對本發明做進一步說明。
1 不完全文庫的構建從一個中國人提供的血液中分離白細胞，提取基因組DNA，片斷長度控制在100Kb以上，用BamHI進行完全酶切，回收10.5Kb的片斷，純化後，與入-EMBL3的BamHI臂相連接，用包裝提取物進行體外包裝，構建了中國人基因組不完全基因文庫。文庫效價為3×105從這人基因文庫中可以定向篩選EPO基因。由於用BamHI對基因組DNA進行完全酶切，可以使EPO基因在文庫中得以富集。
2 表達載體的構建質粒pRSV/CAT(購於Stratagene公司)，經Not I酶切去掉CAT基因，將EPO基因的2.4Kb片斷與載體進行平端連接。連接反應條件載體與外源片斷的摩爾比為1∶10，16℃連接過夜，取5μl轉化大腸桿菌DH5α受體菌，用原位雜交的方法篩選陽性菌落，獲重組質粒，經酶切鑑定方向及系列酶切分析，獲得了重組的表達載體pRSV/CAT。選取帶有dhfr基因的質粒pMT010/A+與帶有潮黴素-B抗性基因的質粒p3′SS(購於Srtatagene公司)組建了表達載體pHY/dhfr。p3′SS用Bg1II和EcoR V雙酶切，去掉1694的片斷，pMT010/A+經Sal I酶切後用TDNA聚合酶於12℃20分鐘補平，再用BgII切下900bp的dhfr基因，將dhfr基因與p3′SS的大片斷以平-粘端的方式相連接，獲重組質粒pHY/dhfr。
3 EPO高效穩定表達細胞株的克隆對培養的BHK細胞用脂質體(Lipofectin)方法轉染表達載體pRSV/EPO，DNA的量為5μg，脂質體為20μl，加無血清MEM2ml，37℃6小時，換正常培養液，轉染時細胞密度為30％，48小時後按1∶5的比例分細胞，用400mg/ml的G418篩選陽性細胞克隆，獲得了表達量為180單位/106細胞的克隆B8細胞株。用pHY/dhfr質粒轉染B8細胞，轉染方法同前，經200mg/ml潮黴素-B篩選後，在MXT壓力下，獲得了表達量為1600單位/106細胞的克隆--B812細胞株。在高密度培養條件下，可獲得超過200mg/升的產量。細胞系的培養條件37℃，5％的CO2濃度，細胞培養液為MEM培養液，10％的新生牛血清。高密度培養時使用無血清培養液。
圖表說明表1中國人EPO基因全序列。
表2EPO基因的前4個ORF(小的開放閱讀框)。
圖1含有全長中國人EPO基因的克隆--λ-811的酶切圖譜。
(1)左臂(2)右臂(3)EPO基因及其5′和3′側翼(4)EPO基因圖2EPO表達載體pRSV/EPO的圖譜G418新黴素抗性基因RSV-LTRRSV的啟動子intronSV40的內含子EPOEPO基因Amp氨苄青黴素抗性基因pASV40的多聚A區圖3潮黴素-B抗性質粒pHY/dhfr的圖譜dhfr二氫葉酸還原酶基因pSV40SV40的啟動子pTKTK基因的啟動子Hygromyc in潮黴素-B抗性基因TKpATK基因的多聚A區Amp氨苄青黴素抗性基因。
表1中國人EPO基因全序列。
示EPO基因的5個ORF
示EPO的編碼序列gg ccc 示本基因與Lin FK的序列差異表2EPO基因的前4個ORF(小的開放閱讀框)ORP1 80 ATG CCC CCC AGG GAA GTG TCC GGG AGC CCA GCC TTT CCC AGATAG(14aa)ORF2 201 ATG ACC CAC ACG CAC GTC TGC ACC CCC GCT CAC GCC GCG AGCCTC AAC CCA GGC GTC CTG CCC CYG CYC TGA(25aa)ORF3 293 ATG CAG ATA……AAA CCT GAC CTG TGA(163aa)ORF4 557 ATG AGG GCC CCC GGT GTG GTC ACC CGG CGC GCC CCA GGT CGCTGA (14aa)
權利要求
1.編碼中國人的EPO基因組DNA，包括完整的編碼區及5′和3′側翼，在第90位的核苷酸處有一個G的缺失，在第一個內含子666位的核苷酸處有一個C的插入，這兩個核苷酸的改變在5′調控區形成了4個以ATG起始的小開放閱讀框架，該DNA的全序列如表1。
2.一種表達載體，它是由EPO基因的2.4Kb的編碼區構建的如附圖2所示的載體pRSV/EPO，它含有一個內含子，可以進行誘導表達。
3.根據權利要求2所述的表達載體，其特徵是如附圖3所示的載體pHY/dhfr，是利用了B生基因進行篩選，與EPO表達載體pRSV/EPO共同使用，在非dhfr缺陷型細胞中表達EPO，並能通過MTX進行加壓培養。
4.一種利用人的基因組DNA序列、構建表達載體、轉染哺乳動物細胞系而能生產促紅細胞生成素的細胞株，其特徵在於該細胞是B812，保藏號為CGMCCNO.0306。
全文摘要
本發明涉及一種能夠生產有生物活性的多肽促紅細胞生成素的哺乳動物細胞系。利用基因工程技術從中國人白細胞中提取DNA，構建了基因文庫，克隆了促紅細胞生成素基因，通過特異的表達載體轉染BHK細胞，獲得了穩定高效生產促紅細胞生成素的細胞克隆。本發明具有利用非dhfr缺陷型細胞生產促紅細胞生成素的特點。
文檔編號C12N15/85GK1168414SQ9711206
公開日1997年12月24日 申請日期1997年5月16日 優先權日1997年5月16日
發明者崔振中, 劉朋朋, 齊順章, 沈恆, 陸廷夷, 張希 申請人:中國農業科大學