肝臟特異的與肝癌分化和進展相關的基因和蛋白的製作方法

2023-12-09 09:38:16

專利名稱：肝臟特異的與肝癌分化和進展相關的基因和蛋白的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種肝臟特異的與肝癌分化、進展相關的新蛋白和編碼該種蛋白的基因，尤其涉及基因HCC-C11及其3個剪切變異體，並進一步涉及這種蛋白和基因在原發性肝細胞癌的組織分化及臨床分期的分子診斷中的應用。
背景技術：
原發性肝細胞癌是人類原發性肝癌中最常見的一種類型，也是全世界最常發生的惡性腫瘤之一，尤其在東南亞及非洲，它的發病率更高。除了極高的發病率外，肝細胞癌還以高惡性度和高死亡率著稱，如果不進行治療，從診斷到死亡的預期壽命約是6個月，5年存活率小於3％；若單純行手術治療，小肝癌的五年存活率為62.7％，大肝癌的僅為37.1％。就中國而言，每年約有110,000人死於肝癌，佔全世界每年肝癌死亡人數的四分之一。這種高死亡率，主要是由於早期肝癌缺乏特異臨床症狀，導致大部分患者就診遲，而又缺乏有效治療手段及術後易復發所致。發病率高、惡性度高、診斷遲、治療方法少、預後差，是肝癌的幾大特點。儘管國內外科研人員都對肝癌進行了多方面的研究，但目前肝癌發生發展的分子機理還不太清楚，對肝癌的治療也主要是採取手術治療及局部或全身化療，少數病人輔以腫瘤生物療法，但術後生存期仍不盡人意。為此，對肝癌發生發展機理的研究成為當前的迫切要求，希望籍此早日闡明肝癌發生發展的分子基礎，並找到特異的分子標誌，或與肝癌發生發展密切相關的分子，以便隨訪高危人群，有效預防、早日診斷、綜合治療、減少復發。
以前的研究表明，肝癌的發生是一個多階段、多步驟的過程，這一過程中伴隨著機體許多的細胞學、遺傳學的改變，出現多種基因表達異常，包括癌基因的激活和/或抑癌基因滅活，激發異常的信號轉導通路，導致細胞周期及細胞凋亡異常，從而使得細胞惡性轉化，並隨著各種分子異常的累積，腫瘤出現進展、轉移。此外，肝癌在分子水平的改變是異質性的，可能存在多個基因，多個途徑交疊作用。所以，明確這些差異表達的基因，對於肝癌發生發展機制的闡明和對肝癌的臨床診斷、治療都具有重要意義。

發明內容
本發明的目的在於提供一種肝臟特異的與肝癌分化、進展相關的蛋白質和編碼這種蛋白質的新基因，並進一步提供了這種蛋白質和基因在原發性肝細胞癌的組織分化及臨床分期的分子診斷中的應用。
在本發明的一個方面，提供了一種肝臟特異的與肝癌分化、進展相關的蛋白質HCC-C11，它具有圖4A中的胺基酸序列。進一步涉及包含上述蛋白質的融合蛋白。
本發明的另一個方面，提供了一種編碼上述蛋白質的基因序列。優選該基因序列為HCC-C11基因或HCC-C11基因的剪切變異體；HCC-C11的剪切變異體優選為基因HCC-C11_V1，基因HCC-C11_V2或基因HCC-C11_V3。
本發明還提供了所述的蛋白質在肝細胞癌的組織分化及臨床分期的分子診斷中的應用。
本發明又提供了一種所述的基因在肝細胞癌的組織分化及臨床分期的分子診斷中的應用。
本發明表明，我們克隆出的新基因HCC-C11及其剪切變異體是一個肝臟特異表達的與肝癌組織分化及進展相關的基因，對於它的功能的研究，將有助於肝癌發生發展機理的闡明。目前對於肝癌的術後診斷，主要依賴於腫瘤的大小、轉移的遠近及組織學檢查。但由於腫瘤細胞的侵襲、轉移在早期是一個微觀的過程，僅憑目前的檢查手段及臨床觀察，對於腫瘤的臨床分期，難於做出精確的診斷。並且由於腫瘤的異質性，即便是組織學上相同的肝癌，它們之間的遺傳學改變也可能明顯不同。HCC-C11及其剪切變異體mRNA表達與肝癌組織分化和進展的關係，可望作為肝癌的臨床分期及組織分化診斷的分子標誌，從而精確診斷肝癌的分期及組織分化，指導肝癌手術後的相應輔助治療。HCC-C11及其剪切變異體基因組織表達的特異性，以及在中低分化肝癌及中晚期肝癌中的低表達，可視為肝臟特異的抑癌基因，並且這四種基因編碼同樣的蛋白質HCC-C11，這些基因和蛋白都可能為將來發展肝癌的肝臟特異的治療提供一個較好的靶點。晚期肝癌中的HCC-C11及其剪切變異體mRNA的低表達及不表達，也可作為肝癌預後判斷的一個指標。


圖1A為HCC-C11的5』RACE其中泳道MK為DNA分子量標準；泳道1為用下遊外側引物C11RTA與上遊引物UPM擴增的RACE-PCR產物；泳道2為用下遊內側引物C11-4與上遊引物UPM擴增的RACE-PCR產物。箭頭所指為每個PCR反應中的擴增條帶。
圖1B為HCC-C11的5』RACE和3』RACE其中泳道MK為DNA分子量標準；泳道1為5』RACE用下遊引物C11-8與上遊引物AUAP進行巢式RACE-PCR的產物；泳道2為3』RACE用上遊外側引物C11S與下遊引物UPM擴增的第一輪RACE-PCR的產物；泳道3為3』RACE用上遊內側引物C11-1與下遊引物UPM擴增的巢式PCR的產物。箭頭所指為每個PCR反應中的擴增條帶。
圖2A為HCC-C11基因及其變異體全長的PCR擴增其中泳道MK為DNA分子量標準；泳道1為HCC-C11基因及其變異體全長的PCR擴增產物。
圖2B為HCC-C11基因及其變異體Northern blot驗證圖其中所用肝癌標本為最初用於消減雜交的早期高分化肝癌，每個泳道上樣40μg總RNA，Ca指示此泳道上樣的為肝癌組織的RNA，Adj指示此泳道上樣的為癌旁組織的RNA。用G3PDH雜交做為上樣對照。
圖3為HCC-C11基因及其變異體的基因結構圖其中方框代表外顯子，方框內的數字為外顯子的編號，每個外顯子的大小見方框上的指示。
圖4A為HCC-C11基因的核苷酸序列及其編碼的HCC-C11蛋白的胺基酸序列。
圖4B為HCC-C11_v1基因的核苷酸序列。
圖4C為HCC-C11_v2基因的核苷酸序列。
圖4D為HCC-C11_v3基因的核苷酸序列。
圖5A為HCC-C11 mRNA在16種正常組織中的表達其中Po(positive control)陽性對照；He(heart)心臟；Br(brain)腦；Pl(placenta)胎盤；Lu(lung)肺；Li(liver)肝臟；Sk(skeletal muscle)骨骼肌；Ki(kidney)腎臟；Pa(pancreas)胰腺；Sp(spleen)脾臟；Th(thymus)胸腺；Pr(prostate)前列腺；Te(testis)睪丸；Ov(ovary)卵巢；In(intestine)小腸；Co(colon)結腸；Le(leucocytes)白細胞；Ne(negative control)陰性對照。
圖5B為HCC-C11 mRNA在6種肝癌細胞系、胎肝、膽囊中的表達其中Po(positive control)陽性對照；7701QGY7701細胞系；7702QGY7702細胞系；7703QGY7703細胞系；7721SMMC7721細胞系；HLE；Hep2G；FL(fetal liver)胎肝；GB(gall bladder)膽囊。
圖6A為HCC-C11基因及其3個剪切變異體的mRNA在5對人原發性肝癌中的表達其中T代表模板為來自於癌組織標本(tumorous tissue)的cDNA，N代表模板為來自於癌旁組織標本(non-tumorous tissue)的cDNA；數字編號代表標本來自不同病例，編號相同的T和N代表標本來自於同一個病例。
圖6B為HCC-C11基因及其3個剪切變異體的mRNA在10份肝硬化組織中的表達其中C代表模板為來自肝硬化組織標本(cirrhotic liver tissue)的cDNA，數字編號代表標本來自不同病例。
圖6C為HCC-C11基因及其3個剪切變異體的mRNA在9份正常肝及1份睪丸組織中的表達。
其中L代表模板為來自正常肝組織(liver tissue)標本的cDNA，數字編號代表不同標本。Te代表模板為來自正常睪丸組織(testis tissue)的cDNA。
其中圖6A-6C中的G3PDH作為參照基因，檢測每份標本的質量以及實驗體系和結果的可信度。
圖7為HCC-C11基因的原位雜交圖(40×)其中A為早期中分化肝癌的癌組織用反義探針雜交的結果。
B為肝癌細胞系BEL7402細胞用反義探針雜交的結果。
C為早期中分化肝癌的癌旁組織用反義探針雜交的結果。
D為癌旁組織用正義探針雜交的對照。圖7中黑色的信號為陽性信號。圖8重組pET32(a)-C11融合蛋白的誘導表達結果其中泳道1為蛋白分子量標準。
泳道2為空pET32(a)載體誘導後4小時的菌體裂解物。箭頭所指示的條帶為pET32(a)載體表達的硫氧還原蛋白(Thioredoxin，trxA)。
泳道3-7為pET32(a)-C11融合蛋白的對照及不同時間的誘導產物。其中泳道3為重組質粒誘導前，即0小時的表達產物作為對照。泳道4為不誘導下重組質粒的表達產物作為對照。
泳道5為重組質粒誘導4小時的表達情況。泳道6為重組質粒誘導6小時的表達情況。泳道7為重組質粒誘導10小時的表達情況。箭頭所指示trxA-C11融合蛋白。
具體實施例方式
實施例1.HCC-C11基因及3個剪切變異體的克隆過程(1)肝癌中差異表達cDNA片斷C11的發現尋找癌與癌旁組織中差異表達的基因，目前已經成為了解細胞惡性表型的分子基礎的一個重要手段。近年來發展了多種篩選差異表達基因的方法，包括差異顯示PCR，消減雜交，代表性差異顯示(representational differenceanalysis)，Microarray等，各有其優缺點。抑制消減雜交技術(suppressionsubtractive hybridization，SSH)是一個敏感性高，能夠篩選低豐度基因的有效方法，它通過兩輪雜交，兩輪抑制PCR，有效平衡高豐度和低豐度的基因，從而使低豐度的差異表達基因得以克隆，並可能發現組織特異的一些基因。自SSH問世以來，國內外科研人員已利用此技術在生命科學的多個領域克隆了許多基因。
為了篩選原發性肝細胞癌中差異表達的基因，我們利用Clontech公司的SSH試劑盒(PCR-SelectTMcDNA Subtraction Kit)，選取了一例早期高分化肝癌標本作為材料，採用抑制消減雜交技術，以肝癌組織作為檢測者(tester)，相應的癌旁組織作為驅趕者(driver)，進行了抑制消減雜交。
首先按TRIzol試劑盒(Gibco公司)的操作說明提取肝癌及癌旁組織總RNA1)組織勻漿在液氮浴中把組織標本研磨為粉狀，加入適量TRIzol試劑(50-100mg組織加入1ml TRIzol)，繼續研磨至勻漿液清亮為止，分裝1ml每管(1.5ml eppendorf)室溫孵育5分鐘。2)抽提每管加入0.2ml氯仿，蓋緊蓋子，劇烈震蕩15秒，室溫孵育2-3分鐘，4ε，12,000g離心15分鐘。3)RNA沉澱吸取上清至新管(每1ml TRIzol約有600μl上清)，加入等體積異丙醇(約1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇)，上下顛倒混勻。室溫孵育10分鐘(為最大量沉澱RNA，-20ε沉澱2小時以上)。4ε，12,000g離心15分鐘。4)RNA洗滌棄上清，每管用1ml 75％乙醇洗滌沉澱，4ε，7500g離心5分鐘。5)RNA溶解空氣乾燥RNA沉澱5-10分鐘，以適量的DEPC處理過的超純水溶解沉澱。紫外分光光度計測定樣品的OD260和OD280值，甲醛變性凝膠電泳檢測RNA質量(28S和18SrRNA的比例)。
採用Promega公司PolyATract mRNA分離試劑盒(Promega，Madison，WI)分離mRNA，其基本原理是用帶有親和素的磁珠在磁場的作用下貼壁於管壁的同時，可與生物素化的oligo(dT)結合，通過oligo(dT)與mRNA3』端的PolyA尾互補雜交使mRNA得到分離純化。操作流程如下1)探針退火在一個1.5ml的無RNA酶的eppendorf管中，用無RNA酶的水把1mg總RNA稀釋至500μl。將此eppendorf管置於65℃水浴中10分鐘。在管中加入3μl生物素化的Oligo(dT)探針和13μl 20×SSC，輕輕混勻，室溫孵育直至冷卻。此過程約需10分鐘，在此期間準備下列液體。2)準備液體0.5×SSC 1.2ml在一個1.5ml的無RNA酶的eppendorf管中加入1.170ml無RNA酶的水和30μl的20×SSC，混勻；0.1×SSC 1.4ml在一個1.5ml的無RNA酶的eppendorf管中加入1.393ml無RNA酶的水和7μl的20×SSC，混勻。3)洗滌鏈親和素結合的磁珠(Streptavidin-Paramagnetic Particles(SA-PMPs))衝懸SA-PMPs，用手指輕彈eppendorf管直至磁珠完全懸浮，用磁架收穫磁珠(約30秒)；吸出上清，注意勿攪動磁珠；用0.5×SSC洗滌磁珠3次，每次300μl，用磁架收穫及棄上清；用100μl的0.1×SSC懸浮磁珠。4)Oligo(dT)-mRNA雜交體的捕獲及洗滌將退火的Oligo(dT)-mRNA加入到有洗滌過的磁珠的管中；室溫孵育10分鐘，每1-2分鐘輕輕混勻一下；用磁架收穫磁珠，棄上清；用0.1×SSC洗滌磁珠3次，每次300μl，最後一次洗滌後，儘量棄除上清，勿攪動磁珠。5)mRNA的洗脫用100μl無RNA酶的水懸浮磁珠，用手指輕彈混勻；用磁架收穫磁珠，將上清(mRNA)吸到一個無RNA酶的管中；用150μl無RNA酶的水重複洗脫一次。紫外分光光度檢測mRNA的濃度和純度。
SSH操作流程按試劑盒說明，以2μlmRNA合成cDNA第一鏈及第二鏈，繼而用RsaI酶消化雙鏈cDNA，酚/氯仿抽提純化cDNA片斷，tester cDNA分為兩份，分別與兩種接頭(adaptor)於16℃連接過夜，取1μl連接產物稀釋於200μl水中，檢測連接效率。將連接有不同接頭的tester雙鏈DNA各1.5μl分別與1.5μl driver雙鏈DNA及1μl 4×雜交液98℃變性1.5分鐘，68℃雜交8小時。然後混合兩份雜交樣品及過量的新鮮變性的driver，68℃雜交16小時。雜交結束後加入200μl稀釋液稀釋後作為模板，進行兩輪PCR擴增(引物PCR Primer 15』CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C 3』；Nested PCR Primer15』TCG AGC GGC CGC CCG GGC AGG T 3』；NestedPCR Primer 2R5』AGC GTG GTC GCG GCC GAG GT 3』)，第一次PCR循環參數為75℃5分鐘，30循環94℃30秒，66℃30秒，72℃1.5分鐘。將第一輪PCR產物1∶10稀釋後，取1μl作模板進行巢式PCR(nested PCR)15循環94℃10秒，68℃30秒，72℃1.5分鐘。各取第一、二次PCR產物8μl用2％瓊脂糖凝膠電泳進行分析。用試劑盒提供的G3PDH(glyceraldehyde3-phosphate dehydrogenase，甘油醛3-磷酸脫氫酶)5』及3』引物按試劑盒說明檢測消減雜交效率。
將第二輪PCR產物按常規方法克隆入pGEM-T Easy vector，轉化入感受態E.coli TOP10F』菌，構成消減文庫，隨機挑選47個克隆，提取質粒後用EcoRI酶切，或用SP6，T7引物擴增鑑定插入片斷大小，結果顯示大部分克隆的大小不同。
為了篩選真正的差異表達基因，採用Reverse northern blot篩選克隆。稀釋由消減文庫提取的質粒，取2ng質粒作模板，用SP6，T7引物進行PCR擴增30循環，電泳檢測擴增產物後，取5μl產物稀釋至100μl體積，加入100μl 0.6M NaOH變性PCR產物，通過BIO-RAD點雜交加樣器點樣於尼龍膜上，每孔加樣相當於2μl PCR產物(80μl變性產物)，平行點兩張膜。採用3份肝癌及癌旁組織總RNA分別混合後提取mRNA，取2μg用AdvantageRT-for-PCR試劑盒(Clontech)逆轉錄合成地高辛標記的cDNA探針，檢測探針質量後進行雜交。雜交條件為含50％去離子甲醯胺的標準雜交液，42℃水浴雜交18小時，雜交後用2×SSC，0.1％SDS室溫洗膜2次，每次1 5分鐘，再用0.1×SSC，0.1％SDS 68℃洗膜兩次，每次30分鐘，隨後用CSPD(Rhoche公司)進行檢測。雜交信號用Bio-Rad Quantity one軟體掃描分析。結合反向Northern blot篩選，得到多個差異表達的基因，選取有明顯差異的片斷，送上海基康公司測序，所得結果用Blast軟體與GenBank中的核酸序列進行同源比對，多數為已知基因。C11為肝癌組織中高表達的cDNA片斷，長為289bp，僅有同源的EST(expressed sequence tag，表達序列標籤)片斷，無已知基因。
(2)HCC-C11及其3個剪切變異體全長基因的克隆為了得到C11的全長基因，根據其同源EST設計引物，採用SMARTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech.Palo Alto，CA)進行5』RACE和3』RACE(rapid amplification of cDNA ends，cDNA末端的快速擴增)擴增基因的5』和3』末端。對於5』RACE，先利用下遊外測引物C11RTA(5』GGC AAC TGATCC AGG GTC ACC 3』)和上遊引物UPM(Universal Primer Mix，試劑盒提供，5′-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C-3′)進行擴增，PCR條件為94℃2分鐘，35循環94℃30秒，68℃30秒，72℃2分鐘。擴增結果得到明顯的3條帶(480bp，800bp，980bp)。利用下遊內側引物C11-4(5』GCT TGT TAGCCT GAT GTG CAG 3』)和上遊引物UPM進行擴增，PCR條件同上，得到相應減小的片斷(見圖1A)，將此片斷凝膠回收後連接入pGEM-T Easy vector，測序，C11向5』端延伸了66bp，命名為HCC-C11，同時得到兩個剪切變異體HCC-C11_v1和HCC-C11_v2。
對於3』RACE，先利用上遊外測引物C11S(5』AGC AGG AAT GAG CTCTCC GAC 3』)和下遊引物UPM進行PCR擴增，得到明顯的4條帶500bp，700bp，750bp，和1.0kb，再用上遊內側引物C11-1(5』AGA TAG AGG CCCTGG AGC TGG 3』)和下遊引物UPM進行PCR擴增(兩輪PCR的參數同5』RACE)，得到單一一條片斷，大小約350bp(見圖1b)，測序後見有明顯的加尾信號和多聚腺苷酸尾巴，證實HCC-C11基因的3』末端已經獲得。
因無明顯的編碼蛋白質的開放讀碼框架存在，推測基因HCC-C11的5』端未到頭，但利用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit做了多次5』RACE均未使得5』端向前延伸，故採用了另外一種5』RACE系統(Invitrogen，SanDiego，CA)，先用1μg mRNA，以C11-2(5』CAC TTG CTG TTC ATG CCC TCCG3』)為引物，用ThermoScriptTMReverse Transcriptase(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD，USA)，60℃60分鐘合成cDNA第一鏈，用QIAqicknucleotide removel kit(Qiagen)純化後，按Invitrogen 5』RACE系統說明加尾，先用上遊引物Abridged anchor primer(5′-GGC CAC GCG TCG ACT AGTACG GGI IGG GII GGG IIG-3)′和下遊引物C11-6 (5』CAG AGA CCT CTGATC ACC ACC 3』)進行PCR擴增，未見明顯條帶。然後再用下遊巢式引物C11-8(5』GAG CCC TCT TAT CCT CTA TGG 3』)和上遊引物AUAP(Abridged Universal Amplification Primer，5』GGC CAC GCG TCG ACT AGTAC 3』)進行PCR擴增，反應體系加入10％DMSO(二甲基亞碸)。兩輪PCR的參數相同，94℃2分鐘，35循環94℃30秒，55℃30秒，72℃1.5分鐘。巢式PCR後得到一條150bp大小的片斷，連接入pGEM-T Easy vector，測序，HCC-C11基因再向5』端延伸了98bp(見圖1b)。至此，已經得到628bp大小的片斷，定位於基因組序列AC018992。
根據Northern blot的結果，HCC-C11基因的轉錄本大小約為840bp，考慮缺失的5』端可能就在AC018992上已克隆出來的序列的5』端，故在上遊相應位置設計了上遊引物C11gsp1(5』CGC TAATGG ATG GTG AGG CAC 3』)，並在基因的3』端設計了下遊引物C11gsp2(5』GAC TTT AAT AAG GAT TTA ATC TTTATG 3』)。以1μg mRNA為模板，以oligo(dT)為引物，用ThermoScriptTMReverse Transcriptase在60℃，反應60分鐘，逆轉錄合成cDNA第一鏈。以1μl此cDNA為模板，以C11gsp1為上遊引物，C11gsp2為下遊引物，反應體系中加入10％二甲基亞碸(V/V)，反應條件如下94℃變性2分鐘；35循環94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1.5分鐘。PCR結果得到4條明顯的擴增帶，大小與預計相符合(見圖2A)。四條擴增帶的大小為HCC-C11為790bp，HCC-C11_v1為1129bp，HCC-C11_v2為1318bp，HCC-C11_v3為1543bp。將得到的片斷克隆、測序，cDNA序列長度與Northern blot的結果一致，並含有預測的蛋白編碼序列。
至此，克隆到了C11及其3個剪切變異體的全長，將全長基因命名為HCC-C11基因(GenBank NumberAY211906)，同時克隆到了它的3個剪切變異體HCC-C11_v1基因(GenBank NumberAY211907)，HCC-C11_v2基因(GenBank NumberAY211908)，HCC-C11_v3基因(GenBank NumberAY225521)。
(3)Northern blot檢測和驗證轉錄本的大小為檢測和驗證HCC-C11基因及其變異體的轉錄本的大小，採用了Northernblot方法。本方法是一個比較經典的方法，其原理是將細胞或組織的總RNA或mRNA電泳，轉到尼龍膜上，用待檢測基因特異的探針與膜進行雜交，再經過嚴格的洗膜條件，通過酶聯抗體及酶底物顯色，使特異的雜交信號顯於膜上。根據雜交條帶的位置，參照RNA marker或28S，18S RNA，計算出待測基因的大小。雜交信號的強弱顯示基因表達的豐度的高低。
用於Northern blot的DNA探針位於HCC-C11基因的494-790核苷酸的位置，用上遊引物C11-1及下遊引物C11gsp2從3』RACE質粒中擴增、純化cDNA片斷，用DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II(BoehringerMannhein，Germany)標記。採用建消減文庫的肝癌標本的總RNA為樣品，40μg來自癌組織及癌旁組織的總RNA分別上樣於含1％瓊脂糖的甲醛凝膠，Ca指示此泳道上樣的為肝癌組織的RNA，Adj指示此泳道上樣的為癌旁組織的RNA，用G3PDH雜交做為上樣對照。電泳後轉印到尼龍膜上，80℃幹烤2小時，先在含50％甲醯胺的標準雜交液(50％甲醯胺，5×SSC，0.1％N-lauroylsarcosine(w/v)(十二烷基肌氨酸鈉)0.02％SDS，2％封閉試劑，100μg/ml剪切的鮭魚精DNA)中42℃雜交3小時，然後在含地高辛標記的cDNA探針的標準雜交液中，42℃雜交18小時。洗膜條件為(1)在2×SSC，0.5％SDS的液體中，室溫洗膜2次，每次30分鐘。(2)在1×SSC，0.1％SDS的液體中，65℃洗膜2次，每次30分鐘。在高嚴謹的條件下洗膜後，用CSPD試劑，化學發光法檢測膜上的信號(x光片曝光時間為6-12小時)。雜交結果顯示，癌組織中檢測到兩個轉錄本，大小為840bp(相當於HCC-C11)和1350bp(相當於HCC-C11_v2)，以前者為主。癌旁組織中檢測到一個轉錄本，為840bp(相當於HCC-C11)。癌和癌旁中其它剪切變異體未檢測到為表達豐度低所致。同樣製備G3PDH深針和雜交作為參照，在癌組織和癌旁組織中都檢測到預計的信號。以上實驗，證實了HCC-C11及HCC-C11_v2轉錄本的大小(見圖2B)。
實施例2.基因分析根據生物信息學分析，HCC-C11基因定位於人基因的8號染色體上，具體位置為8q24.2。HCC-C11由2個外顯子組成，HCC-C11_v1由3個外顯子組成，HCC-C11_v2由2個外顯子組成，HCC-C11_v3僅由1個外顯子組成，它們的第一個及最後一個外顯子相同(見圖3，所示的基因大小為實驗中PCR擴增出來的大小，不包含Poly(A)尾巴)。圖3顯示HCC-C11基因及其變異體利用了不同的外顯子。HCC-C11利用的是1、5外顯子；HCC-C11_v1利用的1、3、5外顯子；HCC-C11_v2利用的是1、3、4、5外顯子；HCC-C11_v3利用的是1、2、3、4、5外顯子。四個轉錄本共用第1個和第5個外顯子。預測的開放讀碼框架位於第1個外顯子，mRNA加尾信號位於第5外顯子，因此HCC-C11基因及其3個變異體編碼的蛋白序列相同，加尾信號也完全相同。HCC-C11及其3個變異體的轉錄本大小分別為807bp，1146bp，1335bp，1560bp(包含Poly(A)尾巴)，它們的最長開放閱讀框架相同，均為234bp，編碼77個胺基酸。圖4A為HCC-C11基因的核苷酸序列及其演繹的胺基酸序列，在胺基酸序列中，潛在的糖基化位點用加方框表示，磷酸化位點加圓圈表示；圖4B為HCC-C11_v1的核苷酸序列，cDNA全長為1146bp，開放讀碼框架與HCC-C11完全相同；圖4C為HCC-C11_v2的核苷酸序列，cDNA全長為1335bp，開放讀碼框架與HCC-C11完全相同；圖4D為HCC-C11_v3的核苷酸序列，cDNA全長為1560bp，開放讀碼框架與HCC-C11完全相同；其中圖4A-4D的核苷酸序列中帶下劃線的核苷酸序列為加尾信號，加邊框表示的ATG為預測的蛋白翻譯起始密碼，TAA為預測的翻譯終止密碼。
實施例3.HCC-C11及其3個剪切變異體的mRNA的組織分布用RT-PCR方法檢測了HCC-C11 mRNA在人的17種正常組織(心臟、腦、胎盤、肺、肝、骨胳肌、腎臟、胰腺、脾臟、胸腺、前列腺、睪丸、卵巢、小腸、結腸、白細胞、膽囊)，6種肝癌細胞系(QGY7701、QGY7702、QGY7703、SMMC7721、HLE、HepG2)及胎肝中的分布，結果顯示HCC-C11mRNA在正常肝中強表達，在睪丸中弱表達，在所檢測的肝癌細胞系中均不表達，是一個肝臟特異表達的基因。(見圖5A和圖5B)。所用引物為上遊引物C11-1B(5』TAC TGA GAT AGA GGC CCT GGA G 3』)，下遊引物C11RTA(5』GGC AAC TGATCC AGG GTC ACC 3』)，用PE9700 PCR儀進行擴增，PCR反應條件如下94℃變性2分鐘；30循環94℃變性15秒；68℃退火20秒；72℃延伸20秒；最後72℃延伸6分鐘。用2.0％的瓊脂糖/溴乙錠凝膠電泳檢測PCR產物的片斷大小及特異性。以G3PDH作為參照基因，上遊引物為5』ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC 3』，下遊引物為5』TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA 3』。
檢測HCC-C11的3個剪切變異體所用的引物為上遊引物C11S(5』AGCAGG AAT GAG CTC TCC GAC 3』)，下遊引物同上，為C11RTA。PCR條件也同上。見圖6A-6C圖6A為HCC-C11及其3個剪切變異體的mRNA在5對人原發性肝癌中的表達，其中T代表模板為癌組織的cDNA，N代表模板為癌旁組織的cDNA。圖6B為HCC-C11及其3個剪切變異體的mRNA在10份肝硬化組織中的表達，其中C(cirrhotic liver tissues)代表肝硬化組織。圖6C為HCC-C11及其3個剪切變異體的mRNA在9分正常肝及1分睪丸組織中的表達。HCC-C11的RT-PCR循環數為32，G3PDH的RT-PCR循環數在(A)和(B)中為28，在(C)為29。以上結果表明，HCC-C11的3個剪切變異體的mRNA與HCC-C11表達一致，但是在肝來源的組織中以HCC-C11及HCC-C11_v2為主，在睪丸中以HCC-C11 HCC-C11_v3為主。
實施例4.HCC-C11 mRNA的表達豐度與肝癌的臨床病理的聯繫用Real-time RT-PCR檢測了HCC-C11在51份肝癌，10份肝硬化，10份正常肝組織中的表達，結果表明，HCC-C11 mRNA在肝癌中的表達與肝癌的組織分化程度及臨床分期有關。肝癌的組織分化程度越低，臨床分期越晚，癌組織中HCC-C11 mRNA表達越低(見表1，表2，表3)。在早期高分化肝癌(I-II期)中，HCC-C11 mRNA在癌組織中的表達比癌旁高。在中晚期高分化肝癌(III-IV期)，HCC-C11 mRNA在癌組織中的表達比癌旁低。在早期中分化肝癌中，HCC-C11 mRNA在癌組織中與癌旁組織中的表達基本相同。在中晚期中分化肝癌及所有的低分化肝癌中，HCC-C11 mRNA在癌組織中的表達均明顯比癌旁組織的低，且有相當一部分病例(28.2％)的肝癌組織中不表達HCC-C11 mRNA。此外，HCC-C11 mRNA在肝硬化組織中的表達也比正常肝組織中的表達低(表4)。
表1肝癌中不同HCC-C11 mRNA表達指數(EI)的頻率病例數n(％)癌組織 癌旁組織 肝硬化正常肝EId(AU)0-10 38(75) 16(31)0(0) 0(0)10-100 6(12) 23(45)8(80)0(0)＞100 7(13) 12(24)2(20)10(100)總病例數(100％)51 5110 10P值c癌旁組織 0.000a肝硬化 0.000b1.0b
正常肝0.000b0.000b0.001ba為Pearson Chi-Square檢驗的結果。
b為Fisher’s精確檢驗的結果。
c表中的P值為相應的行和列兩組統計檢驗的結果。
dEI值由real-time RT-PCR的結果計算得到。
EI值＝(HCC-C11 mRNA的分子拷貝數/G3PDH mRNA的分子拷貝數)×1000AU(AU，arbitrary unit)表2HCC-C11 mRNA表達與肝癌臨床分期的關係Edmondson TNM 分病例數(n) N/T比值aP值分級期(分析的例數e/總例 (均數±標準差)數)G1I-II 4/4 0.078±0.036III 2/2 33.700±19.799 0.017bG2I-II 6/6 0.709±0.257III 8/8 29.850±10.743 0.001bIV 6/8 255.567±81.8670.000c0.000dG3I-II 3/5 7.753±2.608III 5/8 59.350±16.288 0.003bIV 6/10 421.650±130.874 0.001c0.001daN/T比值，由real-time RT-PCR計算出的HCC-C11 mRNA在癌旁組織中的EI值比癌組織的EI值。
bP為I-II期與III期之間比較的統計檢驗結果。
cP為III期與IV期之間比較的統計檢驗結果。
dP為I-II期與IV期之間比較的統計檢驗結果。
e為HCC-C11 mRNA在癌組織及癌旁組織均表達的病例數。在餘下的病例中，HCC-C11 mRNA只在癌旁組織中表達，而在癌組織中不表達，這些病例無法做N/T分析。
表3HCC-C11 mRNA表達與肝癌組織分化程度的關係TNM分期Edmondson 病例數(n)N/T比值aP值分級 (分析的例數e/總 (均數±標準差)例數)I-IIG14/4 0.078±0.036G26/6 0.709±0.2570.003bG33/5 7.753±2.6080.003c0.002dIII G12/2 33.700±19.799G28/8 29.850±10.743G35/8 59.350±16.288 0.008cIV G26/8 255.567±81.867G36/10421.650±130.8740.025caN/T比值，由real-time RT-PCR計算出的HCC-C11 mRNA在癌旁組織中的EI值比癌組織的EI值。
bP為G1與G2之間比較的統計檢驗結果。
cP為G2與G3之間比較的統計檢驗結果。
dP為G1與G3之間比較的統計檢驗結果。
e為HCC-C11 mRNA在癌組織及癌旁組織均表達的病例數。在餘下的病例中，HCC-C11mRNA只在癌旁組織中表達，而在癌組織中不表達，這些病例無法做N/T分析。
表4HCC-C11 mRNA在肝硬化組織及正常肝組織中的表達的比較組別病例數 EI(AU)(均數±標準差)P值正常肝10190.680±85.169肝硬化1056.420±37.542 0.000實驗方法用Bio-Rad iQ/iCycler Real-Time PCR系統(BioRad，Hercules，CA，USA)進行HCC-C11在mRNA水平表達的定量檢測。其原理是將螢光染料SYBR green加入PCR反應體系，隨著PCR反應中雙鏈DNA的產生，SYBRgreen嵌入到雙鏈中，由相應的檢測系統實時檢測出螢光強度，與標準樣品(由PCR產物做成的質粒)產生的標準曲線比較而得到未知cDNA樣品的模板數。用HCC-C11特異的引物C11-1B和C11RTA進行PCR擴增。先做熔點曲線確定收集螢光信號的溫度。定量反應中的PCR循環參數為50℃2分鐘，95℃10分鐘；45循環95℃變性15秒，66℃退火15秒，72℃延伸20秒，88℃10秒收集螢光信號。1∶10梯度稀釋的標準質粒同時進行反應以產生標準曲線(每反應管的模板數為108到102)。標準曲線的相關係數至少在0.98以上，以保證數據的精確性。同樣製備G3PDH的標準質粒及做每份樣品的定量檢測(引物同前)，作為HCC-C11的參照。計算每份病例中HCC-C11 mRNA在癌旁組織中的表達量(N)比上在癌組織中的表達量(T)的比值(N/T)，分析HCC-C11 mRNA的表達水平與肝癌的組織分化程度及臨床分期的關係。計算每個樣品的HCC-C11 mRNA的表達指數(mRNA EI)，分析HCC-C11mRNA的表達在肝癌、肝硬化、正常肝中的差異。mRNA EI＝(HCC-C11 mRNA的拷貝數/G3PDH mRNA的拷貝數)×1000AU(AU為arbitrary unit)。PCR產物行2.0％的瓊脂糖凝膠電泳，以證實PCR的特異性。
實驗結果以SPSS10.0軟體進行統計檢驗。EI值的差異的顯著性用Pearson卡方檢驗及Fisher’s精確檢驗。N/T比值的差異的顯著性用非配對t檢驗。P＜0.05認為差異有顯著性。
實施例5.原位雜交為了確定HCC-C11 mRNA表達的細胞定位，從而進一步證明該基因與肝癌關係的相關性。以肝癌組織切片及肝癌腫瘤細胞系BEL7402(RT-PCR證實有HCC-C11 mRNA表達)的培養細胞爬片為材料，進行了原位雜交。
以上遊引物C11-1B(5』TAC TGA GAT AGA GGC CCT GGA G 3』)及下遊引物C11RTA(5』GGC AAC TGA TCC AGG GTC ACC 3』)擴增的PCR產物構建成質粒(Real time PCR中的標準品質粒)，測序證實。用DIG RNA labelingKit(T7/SP6)(Roche)按試劑盒說明分別標記正義及反義RNA探針。
簡要操作步驟如下製備8μm厚的冰凍切片，及BEL7402的培養細胞爬片，50℃幹烤2小時。用DEPC處理過的PBS水化，0.2M的鹽酸室溫處理10min，PBS洗滌2×5秒，用20μg/ml的蛋白酶K在37℃消化30分鐘。PBS洗滌2×5秒，用4％多聚甲醛固定10分鐘。PBS洗滌3×5秒，70％，95％，100％梯度乙醇脫水。每個切片滴加30μl預雜交液(50％甲醯胺，10％dextran sulfate，1×Denhard’s溶液，20mM Tris-HCl(pH 8.0)，300mM NaCl，1mM EDTA，250μg/ml酵母tRNA)，37℃預雜交60分鐘。然後用含0.5μg/ml的探針的雜交液，42℃雜交16小時。雜交後用2×SSC，50％甲醯胺37℃洗滌30分鐘，然後用2×SSC37℃洗滌2×15分鐘，0.1×SSC 37℃洗滌2×15分鐘。以鹼性磷酸酶耦連的地高辛標記的抗體(1∶500稀釋)檢測雜交信號。藍紫色的信號為陽性信號。
結果在所檢測的早期中分化肝細胞癌的癌組織中，幾乎所有癌細胞中均見有HCC-C11 mRNA表達。癌旁組織中，幾乎所有肝細胞中均有表達。BEL7402的培養細胞爬片中，所有癌細胞均見HCC-C11 mRNA表達。而用正義對照探針雜交未見到陽性雜交信號(見圖7)。
以上結果說明，HCC-C11是一個肝臟特異的表達於正常肝細胞及分化相對比較好或早期肝癌細胞、肝癌細胞系的基因。
實施例6.重組蛋白的表達(1)重組pET32(a)-C11質粒的構建根據HCC-C11的基因序列設計引物如下上遊引物5』GCG GAT GGT GAG GCA CAG TTT G 3』，下遊引物5』GCG TTT ATTTGT GAA CTT GAT TAG 3』。PCR擴增後，純化PCR產物，分別用引物上加載的酶切位點(引物中加邊框的核苷酸)的內切酶(BamH I和PstI)進行酶切，同時用同樣的酶切載體pQE30，分別凝膠回收目的基因片斷及載體片斷(QIAquick Gel Extraction Kit，Qiagen)，用T4 DNA連接酶4℃連接過夜，轉化入TOP10F』菌，挑取克隆酶切鑑定後送測序，測序證實無突變後，用BamHI和Hind III亞克隆到表達載體pET32(a)，然後轉化TOP10F』菌，挑取轉化菌落經限制性內切酶圖譜分析篩選插入正確的重組菌落，然後將鑑定正確的重組質粒pET32(a)-C11轉化入表達菌BL21 rare coden。
(2)重組蛋白的誘導表達挑取分隔良好的單個菌落，用3ml LB細菌培養基(每升含10克胰蛋白腖，5克酵母提取物，10克氯化鈉，pH7.0)，加入氯黴素(終濃度34μg/ml)和氨苄青黴素(終濃度50μg/ml)，37℃空氣浴搖床震搖過夜。第二天取3個新搖菌管，加入含氯黴素和氨苄青黴素的新鮮2YT細菌培養基(每升含16克胰蛋白腖，10克酵母提取物，5克氯化鈉，pH 7.0)，將過夜培養的菌液1∶20稀釋，37℃空氣浴搖床震搖培養，到菌液OD600＝0.7時開始用IPTG誘導，誘導劑的終濃度為1mM。分別於誘導前(0hr)，誘導後4、6、10小時取菌液1ml，同時設1管不誘導對照，於相應時間取菌液1ml。將留取的菌液離心，加入100μl SDS-PAGE上樣緩衝液，衝懸菌體，沸水浴煮10分鐘，4℃離心5分鐘。取20μl上清電泳。同樣誘導含有空pET32(a)載體的表達菌，取10μl電泳作為誘導對照。
結果見空載體對照在預計位置20kDa處見表達條帶，重組pET32(a)-C11融合蛋白在預計位置30kDa處見表達條帶，4小時誘導已經達高峰，6小時、10小時表達逐漸下降。而誘導前(0小時)及不誘導對照(4小時)未見有目的蛋白表達(見圖8)。
雖然現有的生物學資料庫中未見有HCC-C11蛋白的同源蛋白，但是分析HCC-C11基因的啟動子時，我們發現，HCC-C11基因和甲胎蛋白(AFP)及白蛋白(Albumin)基因在啟動子區域有許多共同的轉錄因子結合位點，主要是一類稱為homeoprotein的轉錄因子，包括肝細胞核因子1(HNF1)和6(HNF6)、OCT1，NKX 3.1，EN1，CSX，PDX1，POU factor Brn-2，CDX2。Homeoprotein是一類在腫瘤中常發生異常表達的轉錄調節因子，它的主要功能主要分為兩類促進細胞增殖，抑制細胞分化；或促進細胞分化，抑制細胞增殖。有研究已表明HNF1能夠轉錄激活許多肝臟特異的基因表達，HNF-1alpha的表達水平與肝癌的組織分化程度有關，在高分化肝癌中，HNF-1 alpha在癌組織中的表達高於癌旁組織，而在中分化及低分化肝癌中，HNF-1 alpha在癌組織中的表達低於癌旁組織。HNF6也與肝細胞的特化(Specification)有關。我們知道，甲胎蛋白是目前的一個最通用的肝癌的標誌物，它一般只在胚胎時期及出生後的短時間內表達，正常成人不表達，而在肝癌發生時，許多病人又出現高表達。白蛋白是一個肝臟特異的標誌，主要表達於分化的肝癌細胞，在肝癌病人中，白蛋白在癌組織中的表達低於癌旁組織。
由此可知，HCC-C11蛋白是一個肝臟特異的蛋白，它象甲胎蛋白和白蛋白一樣，受homeoprotein轉錄因子的調節，作為homeoprotein轉錄因子的下遊基因，執行肝臟特異的功能；或者作為轉錄調節者，調節其它肝臟特異的基因。而最終的表現為，HCC-C11促進肝細胞的分化，抑制肝細胞的增殖。在肝癌中則表現為促進肝癌細胞分化，抑制肝癌細胞的增殖，從而抑制肝癌的侵襲和轉移。HCC-C11蛋白可望作為肝癌的特異治療的靶點而對肝癌進行相應治療，該蛋白同樣可用於臨床分期中的分子診斷。
實施例7.HCC-C11 mRNA在人原發性肝細胞癌的組織分化及臨床分期的分子診斷中的應用人原發性肝細胞癌的組織分化及臨床分期的分子診斷的應用1)取肝癌手術後的癌組織及癌旁組織標本(約0.5-1克)提取總RNA(可用Gibco公司的TRIzol試劑盒)；2)分別以1μg總RNA為模板，20μl反應體系逆轉錄合成cDNA第一鏈，加水稀釋至100μl(Clontech公司的Advantage RT for PCR Kit)；3)以2.5μl的cDNA第一鏈為模板，以C11-1B(5』TAC TGA GAT AGA GGCCCT GGA G 3』)為上遊引物，以C11RTA(5』GGC AAC TGATCC AGG GTCACC 3』)為下遊引物，25μl反應體系進行PCR反應，循環參數如下94℃變性2分鐘；30循環94℃變性15秒；68℃退火20秒；72℃延伸20秒；最後72℃延伸6分鐘。用2.0％的瓊脂糖/溴乙錠凝膠電泳檢測PCR產物的片斷大小及特異性。以G3PDH作為參照基因，上遊引物為5』ACC ACA GTCCAT GCC ATC AC 3』，下遊引物為5』TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA 3』。
4)結果判定凝膠掃描後半定量分析或定量PCR檢測，結合病理組織學檢查，準確診斷，判斷病情及預後。
高分化肝癌若HCC-C11 mRNA在癌組織中的表達比癌旁高，為早期肝癌，術後預後相對好。若癌組織中的表達比癌旁組織低，為晚期肝癌，手術後應該輔助予化療、免疫治療等預防復發。
中分化肝癌若HCC-C11 mRNA在癌組織中的表達與癌旁基本一致，為早期肝癌；若癌組織中比癌旁低，或癌組織中不表達，為中晚期肝癌。結合臨床指針行手術後的治療。
低分化肝癌無論早期或中晚期肝癌中均為癌組織中的表達比癌旁低，甚至在癌組織中檢測不到HCC-C11 mRNA的表達。大部分晚期肝癌中癌組織中的表達非常低，此類病人預後很差。
PI034449-sequence list.txtSEQUENCE LISTING110北京大學120肝臟特異的與肝癌分化和進展相關的基因和蛋白130PI0344491605170PatentIn version 3.12101211807212DNA213Homo sapiens220
221CDS222(6)..(236)223
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權利要求
1.一種肝臟特異的與肝癌分化、進展相關的蛋白質，具有圖4A中的胺基酸序列。
2.一種融合蛋白，其特徵在於該融合蛋白包含權利要求1所述的蛋白質序列。
3.一種編碼權利要求1所述蛋白質的基因序列。
4.根據權利要求3所述的基因，其特徵在於該基因為HCC-C11或HCC-C11的剪切變異體。
5.根據權利要求4所述的基因，其特徵在於剪切變異體為HCC-C11-V1，HCC-C11-V2或HCC-C11-V3。
6.一種權利要求1所述的蛋白質在肝細胞癌的組織分化及臨床分期的分子診斷中的應用。
7.一種權利要求4所述的基因在肝細胞癌的組織分化及臨床分期的分子診斷中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種肝臟特異的與肝癌分化、進展相關的新蛋白和編碼該種蛋白質的基因，尤其是基因HCC－C11及其3個剪切變異體，並進一步公開了這種新蛋白和新基因在原發性肝細胞癌的組織分化及臨床分期的分子診斷中的應用。
文檔編號C07K19/00GK1548456SQ03136070
公開日2004年11月24日 申請日期2003年5月15日 優先權日2003年5月15日
發明者陳慰峰, 蘇豔蓉, 董學員, 王宏程 申請人:北京大學