野菊多糖促進白朮中白朮內酯類成分合成的新用途的製作方法
2023-12-09 02:28:16
本發明涉及野菊多糖促進白朮生長期增加白朮內酯含量的積累，屬於農業生物技術領域。
背景技術：
白朮為菊科蒼朮屬Atractylodes多年生草本植物白朮A.macrocephala的乾燥根莖，主要產於浙江、安徽、湖南、江西等地，其中浙江白朮品質上佳，白朮內酯類成分為白朮主要的藥效學成分，對人類胃癌、腸道疾病有明顯防控功效。次生代謝物的低產現象是制約天然產物規模化應用的核心問題之一。雖然國內外研究者針對次生代謝物低產問題進行了研究，包括優良株系選育，培養技術改造、目標組分合成關鍵酶的合成等，其關鍵是尋找有效誘導子促進代謝物的生物合成。
野菊多糖是野菊(Chrysanthemum indicum L)主要的活性成分之一，其由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖6種單糖組成，具有提高免疫力、降血脂、抗氧化及誘導抗性(專利號：)等功效。但其與次生代謝物的關係還未見研究報導，研究發現野菊多糖可以促進白朮植物中白朮內酯類成分的代謝累積，提高白朮藥效成分，增加質量。本發明的野菊多糖用於誘導白朮內酯倍量增加之用途屬於首次發現。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種提高白朮內酯成分積累的新型誘導子，特別是一種野菊多糖促進劑及其製備方法。從而使白朮具有高含量的白朮內酯含量、且非浙江地區種植的白朮同樣具有高含量的道地成分，進而提高白朮的經濟效益和市場價值。
本發明的白朮內酯促進劑的製備方法包括以下幾個步驟：
(1)野菊多糖的製備：a、採集野菊並在60℃-70℃烘箱中烘乾，粉碎，過80-100目篩；
b、在上述野菊粉末中分別加入野菊粉末質量15-20倍的體積量的純水，煎煮2-3次，每次2-3小時，取汁去渣，合併濾液，過濾，得野菊水提物溶液；
c、減壓低溫濃縮野菊水提物溶液至比重為1.1-1.31；
d、濃縮液加1％活性炭脫色2-3次，抽濾，得到脫色後的濃縮液；
e、在濃縮脫色後的野菊水提物溶液中，慢慢加入上述溶液體積6-8倍的90％-95％的乙醇，4℃靜置過夜；
f、待沉澱析出後，以3000-4500rpm離心上述混合液10-15min，取沉澱，使用冷凍乾燥法乾燥沉澱，得到野菊粗多糖；
g、在野菊粗多糖中加入粗多糖質量75-80倍的體積量的蒸餾水，並加入與蒸餾水同體積的三氯乙酸：正丁醇(體積比為1∶8-10)，劇烈震蕩20-25min，靜置，待分層，取下清液，除去上層正丁醇層及中層雜蛋白，加2NNaOH至中性，蒸乾，再重複上述g步驟多次，除去糖蛋白，得純野菊多糖。
野菊多糖也可以通過市場途徑購買得到，純度可以是10％-99％，可據實際情況配製成適用濃度。
以上野菊多糖輔以常用的藥用賦形劑，製成水劑、粉劑等劑型，噴施與農作物植株上，用於提高白朮中白朮內酯II和白朮內酯III的含量，提高白朮的質量。
上述野菊多糖作為誘導子提高白朮藥效成分含量的用途，其特徵在於，輔以常用的藥用賦形劑，可製成水劑、粉劑、顆粒劑等劑型，該促進劑施用濃度為1-200g/L，優選濃度為1-20g/L。
上述野菊多糖作作為誘導子提高白朮藥效成分含量的用途，其特徵在於，通過浸種、灌根和噴施處理，野菊多糖對幼苗苗期的白朮促進其內酯類成分的累積形成。
上述野菊多糖作為抗病誘導子在農業上的應用，其特徵在於，該野菊多糖可以從菊科植物野菊(Chrysanthemum indicum)包括野菊(Chrysanthemum indicum L)、北野菊(C.boreale Mak.)或巖香菊(C.lavandulaefolium(Fisch.)Mak.)等的全草包括根莖和花中提取得到。
本發明的有益效果是：本發明選擇白朮樣品植物，分別考察野菊多糖對白朮中白朮內酯積累的促進作用。結果顯示：野菊多糖生物製劑能有效地誘導白朮生長期內白朮藥效學物質-白朮內酯類成分的累積，提高了白朮道地性質量，為白朮的優質優產提出了有效手段，顯示出良好的市場前景。本發明開闢了野菊多糖作為誘導子促進白朮種植中品質的提高的新用途，並且成本低廉、使用方便、效果明顯，在中藥農業上具有很好的開發利用價值，應用空間廣闊。
附圖說明
圖1：白朮中自術內酯I(atractylenolide-I)和白朮內酯III(atractylenolide-III)，白朮內酯II(atractylenolide-II)的HPLC圖譜；其中a和b為對照組CK；c和d為施用野菊多糖組
以下實驗例用於進一步說明本發明
實驗例1野菊多糖促進白朮中白朮內酯類成分累積的效應
本實驗以白朮為對象，研究野菊多糖對白朮內酯的影響。
1.1野菊多糖的提取
(1)採集野菊花蕾野菊(Chrysanthemum indicum L.)並在烘箱中烘乾，粉碎，過80-100目篩，稱取500g備用；
(2)在上述野菊粉末中分別加入野菊粉末質量6-8倍的體積量的石油醚，回流1-2次，每次1-2小時，取出，過濾，濾渣水浴加熱揮幹剩餘石油醚，得到脫色後的野菊粉末；
(3)在脫色後的野菊粉末中分別加入野菊粉末質量18-20倍的體積量的純水，煎煮2-3次，每次2-3小時，取汁去渣，合併濾液，過濾，得野菊水提物溶液；
(4)減壓低溫濃縮野菊水提物溶液至比重為1.15-1.25：
(5)在濃縮後的野菊水提物溶液中，慢慢加入上述溶液體積6-8倍的90％-95％的乙醇，4℃靜置過夜；
(6)待沉澱析出後，以3000-4500rpm離心上述混合液12-15min，取沉澱，使用冷凍乾燥法乾燥沉澱，得到野菊粗多糖；
(7)在野菊粗多糖中加入粗多糖質量75-80倍的體積量的蒸餾水，並加入與蒸餾水同體積的三氯乙酸：正丁醇(體積比為1∶8-10)，劇烈震蕩20-25min，靜置，待分層，取下清液，除去上層正丁醇層及中層雜蛋白，加2NNaOH至中性，蒸乾，再重複上述(7)步驟8-9次，除去糖蛋白，得純野菊多糖13.56g，硫酸-苯酚法測定純度為99％。
(8)野菊多糖水溶液的配製：取上述野菊多糖適量，分別配製成10mg/ml、2mg/ml和0.4mg/ml的水溶液，密封貯藏，備用。
1.2野菊多糖對白朮內酯含量的影響
(1)田間試驗設計
試驗共設7個處理：分別配製成10mg/ml的多糖藥劑(ETH)、2mg/ml的多糖藥劑(ETM)和0.4mg/ml的多糖藥劑(ETL)的水溶液，分別採用葉面噴施(ETH葉、ETM葉、ETL葉)和灌根(ETH根、ETM根、ETL根)兩種方法；清水空白對照組(CK)。每處理重複3次。
(2)實驗樣品採集
試驗田位於浙江農林大學德清試驗基地和浙江農林大學平山試驗基地，試驗時間2013年12月至2014年11月。2012年12月將浸種處理的白朮種子播種在試驗田，試驗期間人工除草、人工摘蕾，不使用其他任何除草劑、滅菌劑。2014年5月開始，每隔10天噴藥一次，共噴3次，同時有無菌水為對照。在白朮採集期2014年10月分別採集實驗基地的樣品，每處理隨機採集5株，洗掙後50℃下烘乾，保存於冰箱備用。
(3)樣品中自術內酯類成分的測定
i色譜條件
色譜柱：Sun Fire C18(250mm×4.6mm，5μm)；流動相甲醇(A)和水(B)，梯度洗脫程序為0-14min，73％-89％A；14-15min，89％-95％A；15-22min，95％-100％A；22-26min，100％A。體積流量1mL/min，進樣量20μL，柱溫30℃，白朮內酯I、III的檢測波長為220nm，白朮內酯II檢測波長為276nm。
白朮樣品和標準品的測定即按此程序進行。
ii白朮供試品溶液的製備
將上述備用白朮樣品切片粉碎過200目篩製成白朮粉末，精密稱取0.5g置於10ml容量瓶中，加8ml甲醇超聲提取30分鐘，靜止後用甲醇定容至10ml，搖勻，過有機微孔濾膜(0.45μm)得供試品溶液。
(4)數據處理與分析
利用SPSS13.0軟體對數據進行分析。
(5)結果與分析
如圖1顯示野菊多糖水溶液施用後與對照組比較白朮中白朮內酯I、II、III含量顯著提高。表1.顯示平山、德清試驗田噴施野菊多糖的處理組的白朮內酯含量均高於對照組。其中ETH葉、ETH根和ETL根組達到顯著差異水平。採用灌根處理和葉面噴施的高劑量組藥效最好。
表1.野菊多糖對白朮中內酯類成分的影響
註：所有數據為3次重複的平均數±標準誤，同列數據後不同小寫字母表示P＝0.05水平上差異顯著，不同大寫字母表示P＝0.01水平上差異極顯著
下述實施例均能實現以上實驗例的效果
具體實施方式
實施例1：野菊多糖的提取方法
(1)採集北野菊(C.boreale Mak.)花並在烘箱中烘乾，粉碎，過100目篩，稱取1kg備用；
(2)在上述野菊粉末中分別加入野菊粉末質量6-8倍的體積量的石油醚，回流1-2次，每次1-2小時，取出，過濾，濾渣水浴加熱揮幹剩餘石油醚，得到脫色後的野菊粉末；
(3)在脫色後的野菊粉末中分別加入野菊粉末質量18-20倍的體積量的純水，煎煮2-3次，每次2-3小時，取汁去渣，合併濾液，過濾，得野菊水提物溶液；
(4)減壓低溫濃縮野菊水提物溶液至比重為1.15-1.25；
(5)在濃縮後的野菊水提物溶液中，慢慢加入上述溶液體積6-8倍的90％-95％的乙醇，4℃靜置過夜；
(6)待沉澱析出後，以3000-4500rpm離心上述混合液12-15min，取沉澱，使用冷凍乾燥法乾燥沉澱，得到野菊粗多糖；
(7)在野菊粗多糖中加入粗多糖質量75倍的體積量的蒸餾水，並加入與蒸餾水同體積的三氯乙酸：正丁醇(體積比為1∶8-10)，劇烈震蕩20min，靜置，待分層，取下清液，除去上層正丁醇層及中層雜蛋白，加2NNaOH至中性，蒸乾，再重複上述(7)步驟8次，除糖蛋白，得純野菊多糖26.76g，經採用硫酸-苯酚法測定野菊多糖的純度為98％，備用。
實施例2：水劑的製備
取實施例1中提取得到的野菊多糖，加入適量水配製成含野菊多糖100g/L的水溶液，搖勻，密封儲藏。在白朮生長的苗期噴施與葉面上，結果與對照組比較，能顯著提高白朮內酯含量。
實施例3：粉劑的應用
按實施例1法製備得到野菊多糖(純度為98％)，乾燥，加工成細粉，密封儲藏。臨用時，配製成含野菊多糖50g/L的水溶液，噴施於白朮葉面上，結果與對照組比較，能顯著提高白朮內酯類成分的含量。
實施例4：水劑的應用
重複實施例1的步驟(1)-(6)得到野菊粗多糖，在野菊粗多糖中加入粗多糖質量80倍的體積量的蒸餾水，並加入與蒸餾水同體積的三氯乙酸：正丁醇(體積比為1∶8-10)，劇烈震蕩25min，靜置，待分層，取下清液，除去上層正丁醇層及中層雜蛋白，加2NNaOH至中性，蒸乾，再重複操作4遍，除糖蛋白，得野菊多糖38g，經採用硫酸-苯酚法測定野菊多糖的純度為50％。加蒸餾水配置成含野菊多糖為1g/L的溶液，搖勻，貯藏備用。在白朮生長的苗期，灌根，結果與對照組比較，能顯著提高白朮中白朮內酯類成分的含量。
實施例5野菊多糖的製備
(1)採集巖香菊(C.lavandulaefolium(Fisch.)Mak.)全草，並在烘箱中烘乾，粉碎，過80目篩，稱取2kg備用；
(2)在上述巖香菊粉末中分別加入粉末質量6-8倍的體積量的石油醚，回流1-2次，每次1-2小時，取出，過濾，濾渣水浴加熱揮幹剩餘石油醚，得到脫色後的野菊粉末；
(3)在脫色後的巖香菊粉末中分別加入粉末質量20倍的體積量的純水，煎煮2-3次，每次2-3小時，取汁去渣，合併濾液，過濾，得野菊水提物溶液；
(4)減壓低溫濃縮野菊水提物溶液至比重為1.10-1.30：
(5)在濃縮後的巖香菊水提物溶液中，慢慢加入上述溶液體積9倍的90％-95％的乙醇，4℃靜置過夜；
(6)待沉澱析出後，以3000-4500rpm離心上述混合液12-15min，取沉澱，使用冷凍乾燥法乾燥沉澱，得到野菊粗多糖；
(7)在野菊粗多糖中加入粗多糖質量50倍的體積量的蒸餾水，並加入與蒸餾水同體積的三氯乙酸：正丁醇(體積比為1∶8-10)，劇烈震蕩20min，靜置，待分層，取下清液，除去上層正丁醇層及中層雜蛋白，加2NNaOH至中性，蒸乾，再重複上述(7)步驟6次，除糖蛋白，得純巖香菊多糖26.76g，經採用硫酸-苯酚法測定野菊多糖的純度為59％，備用。
實施例6
取實施例6中提取得到的野菊多糖，加入適量水配製成含野菊多糖90g/L的溶液，搖勻，密封儲藏。在白朮生長的苗期噴施與葉面上，結果與對照組比較，能顯著提高白朮內酯含量。
還需說明的是：經本申請人實驗。以野菊多糖作為誘導子配製的誘導劑顯示出誘導白朮中白朮內酯類成分的顯著累積，且與施用劑量及施用方法有關聯，因此，施用濃度的下限值可以下降到含野菊多糖0.1g/L，當然施用濃度的上限值也可以根據實際情況上調。