用於幹細胞培養的灌流裝置的製作方法

2023-12-09 04:26:16 2

專利名稱：用於幹細胞培養的灌流裝置的製作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種用於細胞培養的灌流裝置，特別涉及一種用於胚胎幹細胞培 養的灌流裝置。
背景技術：
20世紀50年代，科學家在畸形胎瘤中首次首次發現了胚胎幹細(embryonic StemCell，ES細胞)，從此開創了幹細胞生物學研究的歷程。幹細胞的研究與應用幾乎涉及 所有生命科學和生物醫學領域，是當今生命科學領域的熱點和重點。幹細胞能自我更新和 多向分化的生物學特性使得幹細胞研究在動物克隆、新型高效藥物的開發和腫瘤臨床治療 等方面有著廣泛的應用前景。在胚胎幹細胞體外培養中，除了正常的培養基外，需要先培養一層特殊的細胞 (如小鼠胚胎成纖維-mouse embryonic fibroblast MEF細胞等)，然後再在其上接種要 實驗的幹細胞。這些特殊的細胞就是飼養層細胞，通常是成纖維類細胞，這些細胞可以分 泌一些未知的必須生長因子如白血病抑制因子(leukemia inhibitoryfactor，LIF)、幹細 胞因子(stem cell factor, SCF)和鹼性成纖維細胞生長因子(basic Fibroblast growth factor, bFGF)等，提供胚胎幹細胞、誘導多能幹細胞更好的營養。這些因子對幹細胞的存 活和增殖是必需的，不僅可以使其數量增加，而且與幹細胞在體內外的分化有關。實驗證 明，飼養層細胞的作用不僅僅是產生了一些細胞因子，在大多數細胞發育和分化過程中，細 胞的黏附作用都發揮了相當重要的作用。ES細胞不能作為完全獨立的細胞而生存，總是與 周圍的細胞相聯繫著，在信號傳導中的黏附受體調節著細胞的運動、增殖和分化。通常在胚胎幹細胞/誘導多能幹細胞培養體系下，飼養層細胞與幹細胞處於共培 養狀態，兩者無法分離徹底。如果採用飼養層與幹細胞分別靜態培養的方式，無法實時將飼 養層細胞分泌的因子傳送到幹細胞培養體系內，且操作過程多，大多不被採用。傳統共培養 方式影響幹細胞純度，已在幹細胞應用等方面起到了很大的限制作用。

實用新型內容本實用新型的目的在於克服現有培養體系的不足，提供一種既可滿足幹細胞的獨 立培養環境，以保證細胞純度，又避免參雜飼養層細胞影響的用於幹細胞培養的灌流裝置。本發明提供的用於幹細胞培養的灌流裝置，包括灌流瓶和廢液瓶，還包括飼養層 細胞培養反應器以及待培養細胞灌流槽；所述飼養層細胞培養反應器包括帶有進液口和出 液口的飼養層細胞灌流槽和與所述出液口相連通的連通管；所述連通管與所述待培養細胞灌流槽相連通，所述灌流瓶與所述飼養層細胞灌流 槽的進液口之間以及所述待培養細胞灌流槽與所述廢液瓶之間均通過管道相連通；所述飼養層細胞培養反應器內設置有能阻止飼養層細胞進入待培養細胞灌流槽 的過濾裝置。該過濾裝置可以實現飼養層細胞和待培養細胞是分開培養，也即這樣飼養層 細胞分泌的細胞因子等都可以隨同培養液一起進入待培養細胞灌流槽中，同時又可以阻止
3飼養層細胞和其它雜細胞進入待培養細胞灌流槽中。在一種實施方式中，上述過濾裝置為孔徑大小能阻止飼養層細胞穿過但能實現液 體通過的半透膜，所述半透膜設置在所述飼養層細胞灌流槽內。如果所述飼養層細胞灌流槽內設置有細胞培養板，而所述半透膜設置在所述細胞 培養板的上方，所述飼養層細胞灌流槽的進液口和出液口設置在所述半透膜的上方。這樣 飼養層細胞就可留在所述半透膜的下方，其培養液可以通過出液口進入下一步的待培養細 胞灌流槽中。如果所述飼養層細胞灌流槽內設置有細胞培養板，而所述半透膜設置在所述細胞 培養板的下方，所述飼養層細胞灌流槽的進液口和出液口設置在所述半透膜的下方。這樣 飼養層細胞就可留在所述半透膜的上方，其培養液可以通過出液口進入下一步的待培養細 胞灌流槽中。在另一種實施方式中，上述過濾裝置可以為孔徑大小能阻止飼養層細胞穿過但能 實現液體通過的半透膜，並且該半透膜設置在所述連通管內的；在又一實施方式中，該半透 膜可設置在所述飼養層細胞灌流槽的出液口處。當然，該半透膜也可設置在所述代培養細胞灌流槽的進液口。上述灌流瓶與廢液瓶的瓶蓋上均可設有穿過所述瓶蓋的氣體濾頭。這樣可以使得 罐流瓶以及廢液瓶內的壓強與外界相同，並且可以隔絕外界空其中的細菌汙染。上述灌流瓶的瓶蓋上可設有穿過所述瓶蓋的pH計。pH計的測量端與灌流瓶內培 養基接觸，這樣可實時監控灌流瓶內培養基的PH變化情況。上述灌流瓶與所述飼養層細胞灌流槽的進液口之間的管道上設置一個蠕動泵；所 述待培養細胞灌流槽和廢液瓶之間的管道上設置一個蠕動泵。這樣控制培養基液體在微灌 流裝置中的流速以適應細胞的營養需求，可控制液體的流速是0. 02-0. 45ml/h。在一實施例中中，上述待培養細胞灌流槽的底部可設有一層基質如明膠或 Matrigel基質，有利於細胞貼壁生長。在另一實施例中，上述待培養細胞灌流槽內可設置有細胞培養板。該細胞培養板 可以是現有技術中的細胞培養板。上述待培養細胞具體可以是指胚胎幹細胞。本實用新型在使用時，把用於幹細胞培養的培養基裝於灌流瓶1中，灌流瓶1通過 裝設在其上端的氣體濾頭2與外界空氣相通，灌流瓶1中的pH計3對瓶中培養基的pH進 行實時監控；灌流瓶1中的培養基通過蠕動泵5流經輸入管4輸送到飼養層細胞培養反應 器6內，為飼養層細胞提供營養，胚胎幹細胞接種於待培養細胞罐流槽9中，飼養層細胞分 泌的因子和培養液組成條件培養基通過連通管8被傳送到待培養細胞罐流槽9中供幹細胞 生長，幹細胞生長使用後的培養基通過輸出管13輸送到廢液瓶12中收集。本實用新型的灌流裝置，不僅可以滿足幹細胞克隆的獨立培養環境，而且可以保 證幹細胞純度，避免參雜飼養層細胞影響幹細胞應用，再者可通過液體流動及時排除細胞 代謝毒物，更好的模擬體內環境，防止細胞代謝物堆積導致的細胞分化，促進幹細胞生長。 同時本實用新型也可用於幹細胞分化研究，飼養層細胞灌流槽內如培養目的分化細胞，其 所釋放的相關因子可通過灌流裝置流入待培養的幹細胞灌流槽，影響幹細胞分化。本實用新型又由於其操作相對簡便，可重複性強，較傳統模式減少了較多的操作環節，降低了汙染和飼養層細胞參雜的機會，利於幹細胞生長，為幹細胞的大規模培養提供 參考價值。

圖1為本實用新型實施例1的結構示意圖。圖號說明1灌流瓶，2、11氣體濾頭，3pH計，4輸入管，5、10蠕動泵，6飼養層細胞 培養反應器，7嵌入式過濾膜，8連通管，9待培養細胞灌流槽，12廢液瓶，13輸出管，14飼養 層細胞灌流槽。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本實用新型作進一步說明，但本實用新型並不限於以下實 施例。實施例1如圖1所示，一種用於細胞培養的微灌流裝置，包括灌流瓶1和廢液瓶12。灌流瓶 1的瓶蓋與廢液瓶12的瓶蓋上分別設有穿過各自瓶蓋的氣體濾頭2和11，這樣可以使得罐 流瓶1以及廢液瓶12內的壓強與外界相同，並且可以隔絕外界空其中的細菌汙染。灌流瓶 1上還設有穿過灌流瓶的瓶蓋的PH計3，pH計3的測量端與灌流瓶內培養基接觸，這樣可 實時監控灌流瓶內培養基的PH變化情況。如圖1所示，本發明提供的灌流裝置還包括飼養層細胞培養反應器6和待培養細 胞灌流槽9。飼養層細胞培養反應器6包括飼養層細胞灌流槽14以及連通管8。飼養層細 胞灌流槽14的兩端分別設有出液口和進液口。飼養層細胞灌流槽14內部設有細胞培養板。該進液口與灌流瓶1之間通過輸入管4連通，這樣既可將灌流瓶1與飼養層細胞 培養反應器6相連通；該出液口與連通管8相連通。該連通管8與待培養細胞灌流槽9是 相連通的。待培養細胞灌流槽9與所述廢液瓶12之間通過輸出管13相連通。本發明的優點是飼養層細胞和待培養細胞是分開培養的。飼養層細胞培養反應器 6內設置有能阻止飼養層細胞進入待培養細胞灌流槽9的過濾裝置。這樣飼養層細胞分泌 的細胞因子等都可以隨同培養液一起進入待培養細胞灌流槽9中，同時又可以阻止飼養層 細胞和其它雜細胞進入待培養細胞灌流槽9中。該過濾裝置具體可以孔徑大小能阻止飼養層細胞穿過但能實現液體通過的半透膜。該半透膜是設置在飼養層細胞培養反應器6的飼養層細胞灌流槽14內的嵌入式 過濾膜7。如果嵌入式過濾膜7設置在飼養層細胞灌流槽14內細胞培養孔板的上方，飼養 層細胞灌流槽14的進液口和出液口應該設置在嵌入式過濾膜7的上方。這樣飼養層細胞 就可以被阻擋在嵌入式過濾膜7的下方，其培養液可以通過出液口進入下一步的待培養細 胞灌流槽9中；如果嵌入式過濾膜7設置在飼養層細胞灌流槽14內細胞培養孔板的下方， 飼養層細胞灌流槽14的進液口和出液口應該設置在嵌入式過濾膜7的下方。這樣飼養層 細胞就可以被阻擋在嵌入式過濾膜7的上方，其培養液可以通過出液口進入下一步的待培 養細胞灌流槽9中。在本實施例中，優選是將帶有飼養層細胞的細胞培養孔板置於嵌入式 過濾膜7的下方培養。[0033]當然，在另一實施例中，該過濾裝置具體還可以是設置在飼養層細胞培養反應器 6的連通管8內的半透膜，該半透膜的孔徑大小也能阻止飼養層細胞穿過但能實現液體通 過。如果本發明提供的微灌流裝置是培養胚胎幹細胞的，那麼待培養細胞灌流槽9內 裝的就是胚胎幹細胞。待培養細胞灌流槽9內可鋪有Matrigel基質(一種從小鼠腫瘤細 胞中提取出的凝膠，包含細胞外基質ECMs，為幹細胞生長提供支架)，也可設置一個現有技 術中的細胞培養板。在本實施例中，為了更好地實現細胞貼壁，在待培養細胞灌流槽9內鋪 的是Matrigel基質。為了控制培養基液體在灌流裝置中的流速以適應細胞的營養需求，可在輸入管4 和輸出管13上分別設置蠕動泵5和10，可控制液體的流速是0. 02-0. 45ml/h。本實用新型在使用時，把用於細胞培養的培養基裝於灌流瓶1中，灌流瓶1通過裝 設在其上端的氣體濾頭2與外界空氣相通，灌流瓶1中的pH計3對瓶中培養基的pH進行 實時監控；灌流瓶1中的培養基通過蠕動泵5流經輸入管4輸送到飼養層細胞培養反應器 6內，為飼養層細胞提供營養，胚胎幹細胞接種於待培養細胞罐流槽9中，飼養層細胞分泌 的因子和培養液組成條件培養基通過連通管8被傳送到待培養細胞罐流槽9中供幹細胞生 長，幹細胞生長使用後的培養基通過輸出管13輸送到廢液瓶12中收集。以上所述之實施方式為本實用新型的實施案例之一，並非以此限制本實用新型的 實施範圍，故凡依本實用新型之形狀、構造及原理所做的等效變化，均應涵蓋在本實用新型 的保護範圍內。
權利要求用於幹細胞培養的灌流裝置，包括灌流瓶和廢液瓶，其特徵在於所述灌流裝置還包括飼養層細胞培養反應器以及待培養細胞灌流槽；所述飼養層細胞培養反應器包括帶有進液口和出液口的飼養層細胞灌流槽和與所述出液口相連通的連通管；所述連通管與所述待培養細胞灌流槽相連通，所述灌流瓶與所述飼養層細胞灌流槽的進液口之間以及所述待培養細胞灌流槽與所述廢液瓶之間均通過管道相連通；所述飼養層細胞培養反應器內設置有能阻止飼養層細胞進入待培養細胞灌流槽的過濾裝置。
2.根據權利要求1所述的灌流裝置，其特徵在於所述過濾裝置為孔徑大小能阻止飼 養層細胞穿過但能實現液體通過的半透膜，所述半透膜設置在所述飼養層細胞灌流槽內。
3.根據權利要求2所述的灌流裝置，其特徵在於所述飼養層細胞灌流槽內設置有細 胞培養板，所述半透膜設置在所述細胞培養板的上方，所述飼養層細胞灌流槽的進液口和 出液口設置在所述半透膜的上方。
4.根據權利要求2所述的灌流裝置，其特徵在於所述飼養層細胞灌流槽內設置有細 胞培養板，所述半透膜設置在所述細胞培養板的下方，所述飼養層細胞灌流槽的進液口和 出液口設置在所述半透膜的下方。
5.根據權利要求1所述的灌流裝置，其特徵在於所述過濾裝置為孔徑大小能阻止飼 養層細胞穿過但能實現液體通過的半透膜；所述半透膜設置在所述連通管內的。
6.根據權利要求2-5中任一所述的灌流裝置，其特徵在於所述灌流瓶與廢液瓶的瓶 蓋上均設有穿過所述瓶蓋的氣體濾頭。
7.根據權利要求6所述的灌流裝置，其特徵在於所述灌流瓶的瓶蓋上設有穿過所述 瓶蓋的PH計。
8.根據權利要求7所述的灌流裝置，其特徵在於所述灌流瓶與所述飼養層細胞灌流 槽的進液口之間的管道上設置一個蠕動泵；所述待培養細胞灌流槽和廢液瓶之間的管道上 設置一個蠕動泵。
9.根據權利要求8所述的灌流裝置，其特徵在於所述待培養細胞灌流槽的底部鋪設有一層基質。
10.根據權利要求8所述的灌流裝置，其特徵在於所述待培養細胞灌流槽內設置有細 胞培養板。
專利摘要本實用新型公開了一種用於幹細胞培養的灌流裝置。該灌流裝置包括灌流瓶和廢液瓶，還包括飼養層細胞培養反應器以及待培養細胞灌流槽；所述飼養層細胞培養反應器包括帶有進液口和出液口的飼養層細胞灌流槽和與所述出液口相連通的連通管；所述連通管與所述待培養細胞灌流槽相連通，所述灌流瓶與所述飼養層細胞灌流槽的進液口之間以及所述待培養細胞灌流槽與所述廢液瓶之間均通過管道相連通；所述飼養層細胞培養反應器內設置有能阻止飼養層細胞進入待培養細胞灌流槽的過濾裝置。本實用新型既可滿足幹細胞的獨立培養環境，以保證幹細胞純度，又避免參雜飼養層細胞影響，較傳統模式減少了較多的操作環節，降低了汙染和飼養層細胞參雜的機會。
文檔編號C12M3/06GK201626960SQ2010201069
公開日2010年11月10日 申請日期2010年2月1日 優先權日2010年2月1日
發明者李奎, 牟玉蓮, 王皓, 石放雄, 齊念民 申請人:中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所;上海博因生物技術有限公司