點免疫結合測試蘋果潛隱病毒方法

2023-12-09 04:28:36

專利名稱：點免疫結合測試蘋果潛隱病毒方法
技術領域：
本發明涉及點免疫結合測試蘋果潛隱病毒方法技術領域。
用酶聯免疫技術測試蘋果潛隱病毒是當前廣泛應用的檢測技術，由於該技術檢測過程需時較長，靈敏度、準確度和穩定性還不夠高，數據重複性差、抗原、抗體和試劑藥品用量大，耗資高，檢測標本不能保存。
本發明的目的是發明一種點免疫結合測試蘋果潛隱病毒方法，使檢測時間縮短、靈敏度、準確度和穩定性高，重複性好，檢測成本低，標本可保存。
本發明是這樣實現的把待檢蘋果葉片放入0.02M磷酸鹽溶液中研磨，然後加入等量氯仿離心10分鐘取上清液為抗原液；取兔抗蘋果褪綠葉斑病毒血清和兔抗蘋果莖溝病毒血清用抗體緩衝液稀釋製成抗血清液，抗體緩衝液由0.02M磷酸鹽溶液，0.05％吐溫20,2％聚乙烯吡咯烷酮和0.2％牛血清白蛋白製成；辣根過氧化物酶標記的A蛋白用0.02M磷酸鹽溶解，使用時用抗體緩衝液稀釋製成酶標A蛋白液；將硝酸纖維素膜用打孔器打圓孔狀印跡，在圓孔狀印跡上滴入2μl抗原液，然後浸入封閉緩衝液中30分鐘，封閉緩衝液由0.02M磷酸鹽，0.05％吐溫20,2％聚乙烯吡咯烷酮和2％牛血清白蛋白製成；然後取出硝酸纖維素膜吸乾，用0.02M磷酸鹽加0.05吐溫20液洗滌，吸乾，然後加抗血清液，每圓孔狀印跡上加25μ1,28℃保溼孵育1小時，然後再用0.02M磷酸鹽溶液加0.05％吐溫20液洗滌，吸乾；然後浸入抗體緩衝液封閉15分鐘，洗滌、吸乾；再加入酶標A蛋白液，每圓孔狀印跡上加25μl,28℃保溼孵育1小時，洗滌、吸乾；每圓孔狀印跡上加25μl底物溶液，保溼避光孵育10-30分鐘，帶病毒樣點顯色；底物溶液由二氨基聯苯胺四鹽酸鹽加咪唑製成，用時加過氧化氫；將顯色的硝酸纖維素膜用水衝洗，再用蒸餾水洗滌，吸乾，如圓孔狀印跡上的斑點與硝酸纖維素膜顏色相同為無蘋果潛隱病毒，如斑點顏色為黃褐色或褐色為有蘋果潛隱病毒。
本發明的優點是檢測過程需時較短，靈敏度、準確度和穩定性高，重複性好、抗原、抗體和試劑藥品用量小，成本低，檢測樣本可保存。
下面結合實施例，對本發明做進一步說明採蘋果葉片時間以春秋二季為宜，每個待檢樣品採1-2片葉，裝入樣品袋，再裝入塑膠袋，保溼存放待檢；取待檢蘋果葉片0.5克加2倍體積的0.02M磷酸鹽緩衝液研磨，加等量氯仿離心10分鐘取上清液為抗原液；取兔抗蘋果褪綠葉斑病毒血清和兔抗蘋果莖溝病毒血清用抗體緩衝液稀釋製成抗血清液，抗體緩衝液由0.02M磷酸鹽溶液，0.05％吐溫20,2％聚乙烯吡咯烷酮和0.2％牛血清白蛋白製成；辣根過氧化物酶標記的A蛋白用0.02M磷酸鹽溶解，使用時用抗體緩衝液稀釋製成酶標A蛋白液；每種病毒抗血清應單獨用1張硝酸纖維素膜，每個重複也可單用1張，硝酸纖維素膜的大小根據等檢樣品數確定，按每個斑點佔1cm2剪裁，用直徑0.5cm2的打孔器在該膜上打圓孔狀印跡，按設計要求繪製排列圖，在圓孔狀印跡上滴入2μl抗原液，然後浸入封閉緩衝液中30分鐘，封閉緩衝液由0.02M磷酸鹽，0.05％吐溫20,2％聚乙烯吡咯烷酮和2％牛血清白蛋白製成；然後取出硝酸纖維素膜吸乾，用0.02M磷酸鹽加0.05％吐溫20液洗滌3次，每次5分鐘，吸乾；然後加抗血清液，每圓孔狀印跡上加25μl,28℃保溼孵育1小時，然後再用0.02M磷酸鹽溶液加0.05％吐溫20洗滌3次，每次5分鐘，吸乾；然後浸入抗體緩衝液封閉15分鐘，洗滌3次，每次5分鐘，吸乾；再加入酶標A蛋白液,每圓孔狀印跡上加25μl,28℃保溼孵育1小時，洗滌3次，每次5分鐘，吸乾；每圓孔狀印跡上加25μl底物溶液，保溼避光孵育10-30分鐘，帶病毒樣點顯色，底物溶液由二氨基聯苯胺四鹽酸鹽加咪唑製成，用時加0.1％過氧化氫；將顯色的硝酸纖維素膜用水衝洗，再用蒸餾水洗滌，吸乾，反應中止，根據樣品斑點顯色程度判斷如下陰性- 樣品斑點與白色硝酸纖維素膜顏色相同+ 樣品斑點隱約可見淡黃褐色印跡陽性 + 樣品斑點為淡黃褐色印跡或僅周邊顯黃褐色圓環、半圓環、中間不顯色++樣品斑點黃褐色+++樣品斑點深黃褐色或褐色將檢測結果記入排列圖，寫出檢測報告，連以硝酸纖維素膜一併歸檔保存。
權利要求
1.點免疫結合測試蘋果潛隱病毒方法，其特徵是把待檢蘋果葉片放入0.02M磷酸鹽溶液中研磨，然後加入等量氯仿離心10分鐘取上清液為抗原液；取兔抗蘋果褪綠葉斑病毒血清和兔抗蘋果莖溝病毒血清用抗體緩衝液稀釋製成抗血清液，抗體緩衝液由0.02M磷酸鹽溶液，0.05％吐溫20,2％聚乙烯吡咯烷酮和0.2％牛血清白蛋白製成；辣根過氧化物酶標記的A蛋白用0.02M磷酸鹽溶解，使用時用抗體緩衝液稀釋製成酶標A蛋白液；將硝酸纖維素膜用打孔器打圓孔狀印跡，在圓孔狀印跡上滴入2μl抗原液，然後浸入封閉緩衝液中30分鐘，封閉緩衝液由0.02M磷酸鹽，0.05％吐溫20,2％聚乙烯吡咯烷酮和2％牛血清白蛋白製成；然後取出硝酸纖維素膜吸乾，用0.02M磷酸鹽加0.05％吐溫20液洗滌，吸乾；然後加抗血清液，每圓孔狀印跡上加25μl,28℃保溼孵育1小時，然後再用0.02M磷酸鹽溶液加0.05％吐溫20液洗滌，吸乾；然後浸入抗體緩衝液封閉15分鐘，洗滌、吸乾；再加入酶標A蛋白液，每圓孔狀印跡上加25μl,28℃保溼孵育1小時，洗滌、吸乾；每圓孔狀印跡上加25μl底物溶液，保溼避光孵育10-30分鐘，帶病毒樣點顯色；底物溶液由二氨基聯苯胺四鹽酸鹽加咪唑製成，用時加過氧化氫；將顯色的硝酸纖維素膜用水衝洗，再用蒸餾水洗滌，吸乾，如圓孔狀印跡上的斑點與硝酸纖維素膜顏色相同為無蘋果潛隱病毒，如斑點顏色為黃褐色或褐色為有蘋果潛隱病毒。
全文摘要
點免疫結合測試蘋果潛隱病毒方法,把蘋果葉片放入0.02M磷酸鹽緩衝液中進行研磨,然後加入等量氯仿離心提取抗原液,取兔抗蘋果褪綠葉斑病毒血清和兔抗蘋果莖溝病毒血清用抗體緩衝液稀釋製成抗血清液,辣根過氧化物酶標A蛋白用0.02M磷酸鹽溶解,使用時用抗體緩衝液稀釋,將硝酸纖維素膜打上圓孔狀印跡,在其上滴入2μl抗原液,然後再加上抗血清酶標A蛋白液和底物溶液,根據其斑點顯色情況判斷被檢蘋果是否帶有潛隱病毒。
文檔編號G01N33/50GK1210266SQ9710607
公開日1999年3月10日 申請日期1997年9月3日 優先權日1997年9月3日
發明者石蔭萍, 王強生, 楊建明, 孫清榮, 隋從義 申請人:山東省果樹研究所