腫瘤預後評估試劑盒及其製備工藝的製作方法

2023-12-09 04:06:26

專利名稱：腫瘤預後評估試劑盒及其製備工藝的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種腫瘤預後評估試劑盒及其製備工藝。
正常組織中血管生長處於靜止狀態，只在受傷或循環再生的器官中出現可調控、短暫的增殖；但腫瘤組織中，血管生長不受控制，持續進行。腫瘤細胞在一定條件下能夠產生一系列具有促進血管形成功能的細胞因子，如VEGF，bFGF，ANG等。在腫瘤血管生長中起著重要的作用。VEGF通過與血管內皮細胞表面受體結合介異其生物活性，通過激活纖溶酶原激活物和纖溶系統，降解基底膜成份，從而刺激內皮細胞遷移、浸入，形成管狀結構。
腫瘤的發生、發展、轉移必須依賴於新生血管的生成，在腫瘤血管的形成過程中，與血管形成有關的生長因子如VEGF開始表達，當腫瘤受到化療和放療作用後，腫瘤細胞連同腫瘤血管內皮細胞生長受到抑制或損傷，VEGF表達量下降或不表達。VEGF表達量的高低與腫瘤的體積及生長狀態有關，瘤體大，生長快速的腫瘤組織VEGF表達量高；而瘤體小，生長綬慢的腫瘤組織VEGF表達量低。而瘤體相對恆定，增殖與凋亡速率相當的腫瘤組織VEGF相對恆定。腫瘤體積、生長速度受到病人病情、治療方法、治療效果等因素的影響，監測癌症病人這些基因的活動情況及波動變化可以預示病情的變化趨勢，具有重要意義。本試劑盒為臨床醫師提供腫瘤病人的血管形成基因分子水平的動態觀察，為腫瘤病人的治療效果、病情發展、預後變化提供判斷依據。
本發明的目的在於提供一種腫瘤預後評估ELISA試劑盒及其試劑盒中VEGF單克隆抗體和其它緩衝劑、試劑的製備工藝，能夠快速簡單地用於腫瘤的預後評估。
本試劑盒每盒是由以下物質組成的包被緩衝液 1 瓶陽性對照(VEGF) 1 瓶陰性對照(生理鹽水) 1 瓶VEGF的單克隆抗體或多克隆抗體 1 瓶二抗標記物 1 瓶酶底物溶液 1 瓶終止液 1 瓶洗滌液 1 瓶封口膠 1 塊酶標板 1 塊其中，陽性對照(VEGF)、陰性對照(生理鹽水)、二抗標記物、封口膠、酶標板為現有物質，包被緩衝液、VEGF的單克窿抗體或多克窿抗體、酶底物溶液、終止液、洗滌液為由本發明的工藝製備而成的。
本發明的製備工藝是通過以下步驟實現的1.單克隆抗體的製備1.1小鼠免疫BAL B/C小鼠6-8周，用50-100ug VEGF加福氏完全佐劑腹腔注射，間隔2-3周後，用同樣劑量VEGF腹腔加強免疫2-3次，末次免疫後第3-4天取脾細胞融合。
1.2抗原VEGF，由陝西瑞森基因工程藥物研究所提供。
1.3細胞融合，免疫小鼠脾細胞和Sp2/0細胞按10∶1的比例混合，在50％PEG(MW＝1500)的作用下，進行細胞融合，用ELISA間接法初步篩選出陽性克隆，再用中和抑制試驗證實為陽性克隆後，經有限稀釋法克隆2-3次，篩選出分泌抗體陽性的單個克隆，穩定傳代3個月，製備腹水和液氮凍存。
1.4單克隆抗體的鑑定1.4.1雜交瘤細胞系染色體分析取對數生長期的雜交瘤細胞用秋水仙素處理，經Giemsa染色，鏡檢計數。
1.4.2Ig類及IgG亞類測定用美國Sigma公司的抗鼠Ig亞類抗血清與濃縮至原容積1/20的雜交瘤細胞培養上清液作瓊脂雙向免疫擴散。
1.4.3單克隆抗體特異性的測定將VEGF進行電轉移，而後用各株單抗分別進行ELISA染色。
1.4.4單克隆抗體比活性測定將各株單抗的蛋白進行定量，然後按不同稀釋度測定各株的滴度。
2.多克隆及克隆ELISA測定尿樣中的VEGF2.1各種緩衝液及試劑的配製方法A.包被緩衝液0.05M PH9.6的Na2CO3-NaHCO3Na2CO3(MW 105.99) 1.59克NaHCO3(MW 84.01) 2.93克蒸餾水溶至1000mlB.洗滌液PH 7.4的PBS-Tween 20NaCl(MW 58.44)8.0克KH2PO4(MW 136.09)0.2克Na2HPO4·12 H2O(MW 358.14)2.9克(或者 NaHPO41.14克)KCl(MW 74.56) 0.2克蒸餾水溶至1000mlTween 20 0.5ml
C.酶標記物稀釋液在上述洗滌液中加入羊血清，濃度為2％。
D.酶底物溶液鄰苯二胺(O.P.D)-H2O2(1)磷酸—檸檬酸緩衝液PH5.0①0.2M Na2HPO4取Na2HPO4·12 H2O 71.63克用蒸餾水溶至1000ml。
②0.1M檸檬酸液取檸檬酸19.2克，用蒸餾水溶至1000ml，取①液25.7ml，②液24.3ml，再加蒸餾水50ml。
(2)O.P.D-H2O2鄰苯二胺(O.P.D)10mg磷酸—檸檬酸緩衝液25ml3％H2O2(分析純)0.4mlE.終止液2MH2SO4濃硫酸(95-98％)22.2ml蒸餾水 177.3ml(配時將濃硫酸緩慢滴入蒸餾水中，邊加邊搖勻。)2.2操作步驟取單克隆或多克隆抗體，正常鼠IgG(均稀釋成10mg/ml)平行包被40孔板(如A排包被單克隆或多克隆抗體，B排包被正常鼠IgG)，0.1ml/孔，放入溼盒中4℃冰箱過夜，用洗滌液洗滌板3次，每次3分鐘，甩幹。在平行包被的孔中加入被檢抗原0.1ml/孔，37℃孵育1小時，同上洗滌3次，甩幹。再在各孔內加入單克隆或多克隆抗體(稀釋成10mg/ml)，0.1ml/孔，37℃孵育1小時，同上洗滌3次，甩幹，在各孔中加入酶標的二抗(稀釋成1∶4000)，0.1
加入酶底物溶液0.1ml/孔，37℃避光孵育20分鐘。在各孔內加入2M H2SO40.025ml/孔，終止反應，用酶聯檢測儀測定各孔的490nm的吸光度。
2.3結果判定OD比值計算
實施例一、試劑盒組成96人份48人份 20人份包被緩衝液 瓶10ml 5ml 2.5ml陽性對照(VEGF) 瓶1ml 0.5ml 0.25ml陰性對照(生理鹽水) 瓶1ml 0.5ml 0.25mlVEGF的單克隆抗體或多克隆抗體瓶10ml 5ml 5ml二抗標記物 瓶10ml 5ml 5ml酶底物溶液 瓶6ml 3ml 3ml終止液 瓶6ml 3ml 3ml洗滌液 瓶25ml 12.5ml 6ml封口膠 塊10塊 10塊1塊酶標板 塊96孔板48孔板 24孔板二、標本收集
1.晨尿、脫水及大量輸液病人不宜採尿。
2.最好新鮮尿樣，4℃可保存48小時，-20℃可保存4周。
3.尿液不能反覆凍融。
三、試劑貯存1.4℃保存，有效期為4-6個月。
2.包被液必須蓋緊，4℃保存，長期不用，應更換新包被液。四、檢測步驟1.取出酶標板，每孔加包被液2滴(其中3孔不加，直接加陽、陰性對照液各2滴，一孔留作空白對照)。
2 加病人尿液10ul，與包被液混勻。加蓋封口膜，置溼盒，4℃過夜或37℃3.5-4小時以上。
3 到時取出，吸去包被液，每孔加洗滌液200ul，洗3次，每次加洗液後靜置1分鐘後，甩淨，拍幹餘液。
4 加一抗2滴，37℃溼盒60分鐘。
5 同步驟3，洗3次。
6 加二抗2滴，37℃溼盒60分鐘。
7 同步驟3，洗3次。
8 每孔滴加底物A和B各1滴(空白不滴)，混勻，置溼盒37℃×30分鐘(或室溫45分鐘)避光。到時，每孔加終止液1滴，在酶標儀490mm處測OD值。五、判斷結果OD比值計算
六、臨床評估參考
1 待檢標本OD比值≥2.1，表明血管形成肽基因表活躍。
2 待檢標本OD比值在1.5-2.0之間為可疑。
3 待檢標本OD比值在1.5以下，表示血管形成肽基因表達處於靜止期。
權利要求
1.腫瘤預後評估ELISA試劑盒，包括陽性對照(VEGF)，生理鹽水，二抗標記物，封口膠，酶標板，其特徵在於，其中還包括包被緩衝液、VEGF的單克隆抗體或多克隆抗體、酶底物溶液、終止液和洗滌液。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所說的包被緩衝液為0.05M、PH9.6的Na2CO3-NaHCO3，所說的酶底物溶液為鄰苯二胺(O.P.D)-H2O2，所說的終止液2MH2SO4，所說的洗滌液為PH 7.4的PBS-Tween 20。
3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所說的VEGF的單克隆抗體採用以下方法製備(1)小鼠免疫BAL B/C小鼠6-8周，用50-100ug VEGF加福氏完全佐劑腹腔注射，間隔2-3周後，用同樣劑量VEGF腹腔加強免疫2-3次，末次免疫後第3-4天取脾細胞融合；(2)細胞融合，免疫小鼠脾細胞和Sp2/0細胞按10∶1的比例混本混合，在50％PEG(MW＝1500)的作用下，進行細胞融合，用ELISA間接法初步篩選出陽性克隆，再用中和抑制試驗證實為陽性克隆後，經有限稀釋法克隆2-3次，篩選出分泌抗體陽性的單個克隆，穩定傳代3個月，製備腹水和液氮凍存。
全文摘要
本發明提供一種腫瘤預後評估試劑盒,其中包括陽性對照(VEGF)、生理鹽水、二抗標記物、封口膠、酶標板緩衝液、VEGF的單克隆抗體或多克隆抗體、酶底物溶液、終止液、洗滌液;同時,本發明還提供了VEGF的單克隆抗體和其它緩衝液、試劑的製備工藝,能夠快速簡單地用於腫瘤的預後評估。
文檔編號G01N33/531GK1260492SQ9911590
公開日2000年7月19日 申請日期1999年11月9日 優先權日1999年11月9日
發明者趙永同, 祁淼 申請人:趙永同, 祁淼