一種基於免疫調節的抗肝癌藥物海膽黃多糖sep-1的製作方法

2023-12-09 08:33:16

專利名稱：一種基於免疫調節的抗肝癌藥物海膽黃多糖sep-1的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種基於免疫調節的抗肝癌藥物海膽黃多糖SEP-1。
背景技術：
海膽是一種棘皮動物，主要有紫海膽、蝦胰馬糞海膽及棘冠海膽等品種。海膽含 有豐富的蛋白質、多糖、脂肪酸、維生素及微量元素等營養成分，其可食部分是它體腔內的 生殖腺(卵巢、精巢)，統稱海膽卵，又稱海膽黃或海膽膏；海膽的殼和棘刺是一味重要的 中藥，具有多種藥用功效，《本草原始》謂其有「治心疼」的作用，《中藥志》主載其有「軟堅 散結，化痰消腫、消瘰癧痰核、積痰不化、胸脅脹痛等證」的功用。本實驗在對光棘球海膽 Strongylocentrotus nudus的卵(海膽黃)進行研究時提取分離到了海膽黃多糖，近年研 究表明海膽中含有抗腫瘤及免疫活性物質。多糖是由糖苷鍵連接起來的醛糖或酮糖組成的一類天然大分子化合物，科學家們 從大量的藥理和臨床研究發現，從天然產物中分離出來的多糖往往是一種免疫調節劑，它 能激活免疫細胞而對正常細胞沒有毒副作用；在治療腫瘤時，它不像化療藥物直接殺死生 長的癌細胞，而是作為一種生物免疫反應或加強抗體生成及激活劑補體等，達到抑制和消 滅腫瘤細胞的效果，對正常細胞的影響極小。隨著多糖研究的不斷深入，1978年香菇多糖進 入臨床應用，作為免疫調節劑和腫瘤放化療治療的輔助藥物，效果顯著。目前，很多生物活 性多糖，如從雲芝、茯苓、豬苓、靈芝等多種真菌中分離提取的多糖及許多高等植物、動物多 糖均具廣譜的免疫調節活性和抗腫瘤活性。大量研究表明，多糖還具有降膽固醇、降血糖、 抗氧化、抗炎、抗病毒等活性。本發明涉及的海膽黃多糖系從光棘球海膽黃中分離純化得到均一多糖組分 SEP-1，高效液相結果表明SEP-I為分子量LesxiofiDa的多糖。藥效學研究結果表明，海 膽黃多糖SEP-I對小鼠肝癌細胞H22移植瘤具有顯著抑制作用。本發明所述的海膽黃多糖 SEP-I基於免疫調節的抗肝癌的藥理作用尚未報導。

發明內容
本發明海膽黃多糖在製備抗腫瘤藥物和調節機體免疫功能藥物中的應用。本發明提供海膽黃多糖的製備方法及相對分子量的確定；藥效學實驗表明，海膽 黃多糖具有體內抗小鼠肝癌生長作用，並且體外對H22細胞無明顯的細胞毒作用。


圖1海膽黃粗多糖的S-400分子篩洗脫曲線。圖2海膽黃多糖SEP-I的HPLC。圖3海膽黃多糖SEP-I對H22荷瘤鼠的體重保護作用。圖4海膽黃多糖SEP-I協同ConA/LPS刺激脾淋巴細胞增殖作用。
具體實施例方式本發明的目的在於研究一種從海膽黃中提取並分離到的分子量為XX的均一多 糖，其抗腫瘤活性尚未報導，下面將海膽黃多糖SEP-I的製備及抗肝癌活性作詳盡闡述實施例1 海膽黃多糖SEP-I的製備方法a.取新鮮的海膽黃加無水丙酮處理6次，每次半小時，將丙酮蒸乾，得到乾燥的海 膽黃；b.用90°C熱水浸提丙酮處理過且乾燥的海膽黃6小時，共3次，合併浸提液，將浸 提液濃縮，過濾，得濾液；c.調整海膽黃提取液pH6. 5，加入0. 5%的木瓜蛋白酶，60°C保溫過夜，90°C加熱 15min使酶失活，離心收集上清液；d.酶解後的提取液反覆用kvag試劑去蛋白至氯仿和水之間的界面無沉澱為止；e.將去蛋白後的多糖提取液減壓濃縮至適當體積，緩緩加入4倍體積的無水乙 醇，4°C放置過夜，離心收集沉澱，真空乾燥得到海膽黃粗多糖(EWP)。f.將乾燥後的粗糖，溶於水並超濾得到分子量較大的海膽黃粗多糖(EWP-H)Jf 其配成20mg/mL的水溶液，上DE52纖維素離子交換柱，用0 1. Omol/L的NaCl溶液梯度 洗脫，流速1. OmL/min,每管5mL分部收集，苯酚-硫酸法逐管測定糖含量，繪製洗脫曲線，合 並相同組分；g.將離子交換收集到的組分經kphacryl 400柱，以0. 05mol/L的NaCl溶液 洗脫，流速0. 45mL/min，檢測方法同上，繪製洗脫曲線得到兩個峰，截取其中分子量小於 2X IO6Da的組分，透析濃縮、乾燥，得海膽黃多糖SEP-I (附圖1)。實施例2 海膽黃多糖SEP-I分子量的測定Waters 600高效液相色譜系統，採用Siodex KS-805色譜柱，2414示差折光檢測 器，流動相為水，樣品濃度為5. Omg/ml，進樣量20ul，流速1. 0ml/min,柱溫30°C，記錄樣品 色譜曲線。結果顯示(附圖2)，海膽黃多糖SEP-I的出峰時間為6. 102min，純度為90%，並按 照標準曲線推算出其平均相對分子量為1. 65X IO6Da0為驗證海膽黃多糖SEP-I通過體內免疫調節產生抑瘤作用，進行了六項抗腫瘤試驗。實施例3 海膽黃多糖SEP-I對H22荷瘤小鼠的抑瘤作用按移植性腫瘤研究法建立H22荷瘤小鼠模型。選擇接種H227d後的小鼠，消毒腹 部皮膚，用無菌空針抽吸腹水，生理鹽水稀釋，臺盼藍染色後用血球計數板在倒置式顯微鏡 下計數，活細胞數為98%以上，調整細胞濃度為4X107ml。實驗採用18_20g ICR小鼠60 只，隨機分為6組空白對照組，腫瘤模型組，SEP-I低、中、高劑量治療組，陽性對照組(環 磷醯胺CTX)，每組10隻，稱重並記錄。除正常對照組外，於其他各組小鼠右前肢腋窩皮下 接種0. 2mlH22細胞懸液。接種24h後開始給藥，正常對照組和模型組均給等量的生理鹽水， 環磷醯胺組劑量為20mg/kg，SEP-I低、中、高三個劑量組分別為4，8，16mg/kg/d，給藥方式 均為尾靜脈注射(iv)。每天固定時間給藥一次並記錄小鼠的活動情況，連續12d。末次給 藥24h後稱重，頸椎脫白處死小鼠，取瘤塊、脾臟及胸腺分別稱重，計算抑瘤率、脾指數和胸 腺指數。公式如下
權利要求
1.一種具有抗腫瘤活性和免疫調節作用的海膽黃多糖SEP-I及其製備方法，其特徵在 於包括以下步驟a.取新鮮的海膽黃加無水丙酮處理，經水提、去蛋白、醇沉、真空乾燥後得到海膽黃粗 多糖(EWP)；b.將EWP溶於水並超濾得到分子量較大的海膽黃粗多糖(EWP-H)，依次經DE52纖維素 離子交換柱、S^hacryl 400柱後，截取洗脫液中分子量小於2 X IO6Da的組分，透析濃縮、幹 燥，得海膽黃多糖SEP-I。
2.如權利要求1所述的海膽黃多糖SEP-I的製備方法，其特徵在於該製備得到的海膽 黃多糖SEP-I分子量為1. 65 X IO6Da0
3.一種根據權利要求2所述的海膽黃多糖SEP-I對小鼠肝癌細胞H22有較好的抑瘤效 果和免疫調節作用。
4.一種根據權利要求3所述的基於免疫調節作用的海膽黃多糖SEP-I的抗肝癌活性及 機理研究。
全文摘要
本發明涉及一種有效抗小鼠肝癌細胞的海膽黃多糖SEP-1，分子量為1.65×106Da。SEP-1於4，8，16mg/kg/d劑量下對小鼠肝癌細胞H22移植瘤的抑制率依次為43.2％、52.8％、60.1％；同時其對H22荷瘤鼠體重無明顯影響，表明該均一組分多糖具有抗小鼠肝癌效果顯著、毒副作用低、不良反應少等優點。其抗肝癌作用基於激活機體的細胞免疫和體液免疫，顯示其在腫瘤治療以及調節機體免疫活性方面具有廣闊的應用前景。
文檔編號C08B37/00GK102134284SQ20111009022
公開日2011年7月27日 申請日期2011年4月12日 優先權日2011年4月12日
發明者周長林, 奚濤, 康迪, 王慧, 王夢妤, 竇潔 申請人:中國藥科大學