治療自體免疫疾病的trkb激動劑的製作方法

2023-12-09 01:52:01

專利名稱：治療自體免疫疾病的trkb激動劑的製作方法
本申請要求在2006年12月20日提交的美國臨時申請60/870,918的優先權，其在這裡通過引用以其整體被併入本文。
發明領域 本發明涉及治療影響中樞神經系統的自身免疫疾病，包括多發性硬化。本發明提供減少中樞神經系統組織的白細胞侵襲的酪氨酸受體激酶B(TrkB)激動劑。

背景技術：
多發性硬化(MS)是中樞神經系統(CNS)的脫髓鞘自身免疫疾病，以炎症、脫髓鞘和軸突損害為特徵。該疾病影響全世界超過百萬的人和在女性中的流行性是在男性中的兩倍。MS的徵狀通常出現在20歲和40歲之間的年齡段。儘管已經研究該疾病的特徵，MS的病因尚不清楚。這類特徵包括對CNS組織的損害、小神經膠質細胞的激活、促炎細胞因子的產生、抑制T-細胞遷移和克隆型擴張、改變的巨噬細胞效應子作用、MHC的產生、上調、和由T-細胞浸潤的直接CNS攻擊。
認為實驗性的自身免疫性腦脊髓炎(EAE)是MS的標準模型。已經使用鼠疾病模型來研究MS的病因和評估用於其治療的藥物(Aharoni，R.等人，2005a)。EAE的臨床特徵包括由大量浸潤的淋巴細胞和巨噬細胞導致的CNS的炎症和脫髓鞘。用髓磷脂的數個不同蛋白成分(包括髓磷脂鹼蛋白(MBP)、蛋白脂質蛋白質(PLP)和髓磷脂少突膠質細胞糖蛋白(MOG))對小鼠進行主動免疫誘導產生自身免疫抗體和上行性麻痺的臨床病徵。該疾病可以是急性的或慢性的，取決於小鼠種系和用於免疫的髓磷脂蛋白。已經使用EAE來研究MS的病因和評估對其治療的藥物(Aharoni，R.等人，2005a)。
MS主要由T-細胞對髓磷脂的應答產生，所述髓磷脂是在神經組織中豐富的多肽。脫髓鞘和臨床癱瘓產生於Th1表型的T-細胞導致的CNS組織的侵襲，所述T細胞對髓磷脂抗原具有特異性。Th1產生炎症細胞因子，包括TNF-α和IFN-γ。對CNS的損害也可能由其它免疫應答導致，包括產生自身免疫抗體和補體激活。在MS的早期和晚期，及在整個疾病過程中發現多種同型的髓磷脂鹼蛋白(MBP)特異性抗體的EAE中有B-細胞參與。從腦和脊椎組織製備的切片顯示白細胞侵襲(特別是淋巴細胞和巨噬細胞)和神經系統下襯組織的破壞。
格拉默(Glatiramer)乙酸酯(GA，COPAXONE)是被批准用於治療MS和其它疾病的免疫抑制藥物(Arnon，R.等人，2003)。該藥物在EAE模型中也是有效的。GA是產生抗炎症細胞因子的Th2/3細胞的誘導物，其穿過血腦屏障在CNS中聚集。這些細胞因子在CNS的組織中產生多種影響，和導致局部產生其它生長因子，例如IL-10、TGF-β和BDNF(Aharoni，R.等人，2003)。延長的GA施用與NT3、NT4和BDNF的更高水平表達有關(Aharoni，R.等人，2005b)。
NT3、NT4和BDNF是對於神經發育、加工生長、突觸可塑性、保護和存活重要的小同源二聚體蛋白的神經營養蛋白(NT)家族的成員。NT包括神經生長因子(NGF)、腦源性神經營養因子(BDNF)、NT3、NT4(也稱為NT4/5)、NT6和NT7。NT通過與稱為受體酪氨酸激酶(也稱為酪氨酸受體激酶)的受體家族相互作用影響靶標細胞。這些受體包括數個高分子量(130-150kDa)、高親和力(～10-11M)酪氨酸受體激酶(Trk)受體和稱為低分子量(65-80kDa)、低親和力(～10-9M)的受體(LNGFR、p75NTR或p75)。NT結合特異性受體酪氨酸激酶導致受體二聚化和內在酪氨酸激酶結構域的激活。NGF優選結合酪氨酸受體激酶A(TrkA)、BDNF，而NT4結合酪氨酸受體激酶B(TrkB)，而NT3結合酪氨酸受體激酶C(TrkC)。全部NT弱結合p75。
對EAE小鼠CNS組織中的BDNF和NT4的報導(Aharoni，R.等人，2003，2005b)表明NT和/或其受體在多發性硬化和相關疾病中的作用。
參考文獻 Aharoni，R.et al.(2005a)J.Neurosci.258217-28.Aharoni，R.et al.(2005b)Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 10219045-50. Aharoni，R.et al.(2003)Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA10014157-62. Aharoni，R.et al.(1997)Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA9410821-26. Arnon，R.et al.(2003)J.MoI.Recognit.16412-21. Davies，A.et al.(1993)Neuron 11565-74. Karnezis，T.et al.(2004)Nat.Neurosci.7736-44. Padlan，E.et al.(1995)FASEB J.133-39. Steinman and Zamvil(2006)Ann.Neurol.6012-21. 另外的參考文獻，特別是涉及標準操作和方法的參考文獻在正文通常被引用。在以上和在申請其它處引用的全部專利、專利申請、Genbank輸入號、參考手冊和公開案在這裡以其整體被引入作為參考。
發明簡述 一方面，本發明提供減少中樞神經系統組織的白細胞侵襲的方法，包括以激活TrkB受體的有效量將包含TrkB激動劑的組合物施用於需要此治療的哺乳動物受試者，由此減少中樞神經系統組織的白細胞侵襲。本發明還提供TrkB激動劑在製備藥物中的用途，所述藥物用於減少哺乳動物的中樞神經系統組織的白細胞侵襲。
在一些實施方案中，所述哺乳動物具有自身免疫性疾病。在一個實施方案中，所述自身免疫性疾病是試驗性的自身免疫性腦脊髓炎。在另一實施方案中，所述自身免疫性疾病是多發性硬化。在其它實施方案中，所述自身免疫性疾病與免疫排斥、視神經疾病、炎性腸病、或帕金森病有關。在優選的實施方案中，該哺乳動物是人。
在一些實施方案中，該TrkB激動劑是天然存在的TrkB激動劑。在一個實施方案中，所述天然存在的TrkB激動劑是NT4。在相關實施方案中，所述天然存在的TrkB激動劑包含NT4的天然存在的片段或衍生物。在一些實施方案中，所述NT4的片段或衍生物結合和激活TrkB。在另一實施方案中，所述天然存在的TrkB激動劑是BDNF。在相關實施方案中，所述天然存在的TrkB激動劑包含BDNF的天然存在的片段或衍生物。在一些實施方案中，所述BDNF的片段或衍生物結合和激活TrkB。
在另一實施方案中，所述TrkB激動劑是抗體。在具體的實施方案中，該抗體是抗體38B8。在另一實施方案中，該抗體由保藏在ATCC保藏號PTA-8766的雜交瘤系產生。在一些實施方案中，所述TrkB激動劑是人抗體。在相關實施方案中，所述TrkB激動劑是人源化的抗體。在一些實施方案中，所述TrkB激動劑是抗體片段或衍生物。在具體的實施方案中，該抗體片段選自Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、Fc或單鏈(ScFv)抗體。在一些實施方案中，所述抗體片段包含激動劑抗體38B8的抗原結合區域。在一些實施方案中，該抗體片段包含由保藏在ATCC保藏號PTA-8766的雜交瘤系產生的抗體的抗原結合區。在相關的實施方案中，該抗體片段包含激動劑抗體38B8的互補決定區(CDR)。在相關的實施方案中，該抗體片段包含由保藏在ATCC保藏號PTA-8766雜交瘤系產生的抗體的互補決定區(CDR)。
在優選的實施方案中，所述侵入的白細胞包括T-細胞和巨噬細胞。在具體的實施方案中，所述侵入的白細胞包括表達CD3和表達CD68的白細胞。在優選的實施方案中，所述中樞神經系統的組織是腦組織或脊椎組織。
在有關的方面，本發明提供治療影響中樞神經系統的自身免疫疾病的方法，包括向需要此治療的哺乳動物受試者施用包含足夠激活TrkB受體的TrkB激動劑的量的組合物，由此減少中樞神經系統的組織的白細胞侵襲。本發明還提供TrkB激動劑在製備藥物中的用途，所述藥物用於治療影響哺乳動物的中樞神經系統的自身免疫疾病。
在一個實施方案中，該自身免疫疾病是試驗性自身免疫性腦脊髓炎。在另一實施方案中，所述自身免疫性疾病是多發性硬化。在其它實施方案中，所述自身免疫性疾病與免疫排斥、視神經疾病、炎性腸病、或帕金森病有關。在優選的實施方案中，該哺乳動物是人。
在一些實施方案中，所述TrkB激動劑是天然存在的TrkB激動劑。在一個實施方案中，該天然存在的TrkB激動劑是NT4。在相關實施方案中，該天然存在的TrkB激動劑包含NT4的天然存在的片段或衍生物。在一些實施方案中，所述NT4的片段或衍生物結合和激活TrkB。在另一實施方案中，該天然存在的TrkB激動劑是BDNF。在相關實施方案中，該天然存在的TrkB激動劑包含BDNF的天然存在的片段或衍生物。在一些實施方案中，所述BDNF的片段或衍生物結合和激活TrkB。
在另一實施方案中，所述TrkB激動劑是抗體。在具體的實施方案中，所述抗體是抗體38B8。在另一實施方案中，所述抗體由保藏在ATCC保藏號PTA-8766的雜交瘤系產生。在一些實施方案中，所述TrkB激動劑是人抗體。在相關的實施方案中，所述TrkB激動劑是人源化的抗體。在一些實施方案中，所述TrkB激動劑是抗體片段或衍生物。在具體的實施方案中，該抗體片段選自Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、Fc或單鏈(ScFv)抗體。在一些實施方案中，該抗體片段包含激動劑抗體38B8的抗原結合區。在一些實施方案中該抗體片段包含由保藏在ATCC保藏號PTA-8766的雜交瘤系產生的抗體的抗原結合區。在相關實施方案中，該抗體片段包含激動劑抗體38B8的互補決定區。在相關實施方案中，該抗體片段包含由保藏在ATCC保藏號PTA-8766的雜交瘤系產生的抗體的互補決定區(CDR)。
在優選的實施方案中，所述侵入性白細胞包括T-細胞和巨噬細胞。在具體的實施方案中，所述侵入性白細胞包含表達CD3和表達CD68的白細胞。在優選的實施方案中，所述中樞神經系統的組織是腦組織或脊椎組織。
在另一方面，本發明提供減少中樞神經系統的組織中白細胞侵入的試劑盒的部分，包含可有效激活TrkB受體量的TrkB激動劑和使用說明書。在相關方面，本發明提供治療影響中樞神經系統的自身免疫疾病的試劑盒的部分，包含可有效激活TrkB受體的量的TrkB激活劑和使用說明書。
在另一實施方案中，本發明涉及TrkB激動劑抗體38B8，例如分離的單克隆38B8抗體。在另一實施方案中，本發明涉及由保藏在ATCC保藏號PTA-8766的雜交瘤系產生的分離的TrkB激動劑抗體。在一些實施方案中，所述TrkB激動劑是38B8的抗體片段或衍生物。在另一實施方案中，所述TrkB激動劑是由保藏在ATCC保藏號PTA-8766的雜交瘤系產生的抗體的抗體片段或衍生物。在具體的實施方案中，該抗體片段選自衍生自38B8的Fab、Fab1、F(ab′)2、Fv、Fc、單鏈(ScFv)抗體。在具體的實施方案中，該抗體片段選自由保藏在ATCC保藏號PTA-8766的雜交瘤系產生的Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、Fc、或單鏈(ScFv)抗體。在一些實施方案中，該抗體片段包含激動劑抗體38B8的抗原結合區。在一些實施方案中，該抗體片段包含由保藏在ATCC保藏號PTA-8766的雜交瘤系產生的激動劑抗體的抗原結合區。在相關實施方案中，該抗體片段包含激動劑抗體38B8的互補決定區(CDR)。在相關實施方案中，該抗體片段包含由保藏在ATCC保藏號PTA-8766的雜交瘤系產生的激動劑抗體的互補決定區(CDR)。在另一實施方案中是產生TrkB激動劑抗體38B8的細胞或產生衍生自38B8的片段的細胞。在另一實施方案中是保藏在ATCC保藏號PTA-8766的雜交瘤系。
本發明也涉及本文所述的任何的TrkB激動劑用於治療本文所述的任何自身免疫疾病。本發明還提供藥物組合物，包含本文所述的任何TrkB激動劑和藥物可接受的載體。
在另一實施方案中，本發明涉及包含核苷酸序列的分離的核酸分子，所述核苷酸序列編碼本文所述的任何TrkB激動劑。在一個具體的實施方案中，是包含核苷酸序列的分離的核酸分子，所述核苷酸序列編碼由保藏在ATCC保藏號PTA-8766的雜交瘤系產生的激動劑抗體。本發明還涉及包含這裡所述的任何核酸分子的載體，其中該載體任選包含操縱性連接於核酸分子的表達控制序列。
另一實施方案提供宿主細胞，該細胞包含本文所述的任意的載體或包含本文所述的任意的核酸分子。本發明還提供分離的細胞系，其產生這裡所述的任意的抗體或抗原結合部分或其產生所述抗體或所述抗原結合部分的重鏈或輕鏈。
在另一實施方案中，本發明涉及產生TrkB激動劑抗體或其抗原結合部分的方法，包括在合適的條件下培養本文所述的任意的宿主細胞或細胞系和回收所述抗體或抗原結合部分 本發明還涉及包含本文所述的任意核酸的非人的轉基因動物或轉基因植物，其中該非人的轉基因動物或轉基因植物表達所述核酸。
本發明還提供分離TrkB激動劑抗體或其抗原結合部分的方法，包括從本文所述的非人的轉基因動物或轉基因植物分離抗體的步驟。
本發明的這些和其它的方面從本發明的描述和下列實例中是顯而易見的。
附圖簡述

圖1A和1B繪圖顯示在MOG-誘導數周之後在EAE動物中的相對發病率。MOG是在第0天被施用。(A)在第10天開始，動物接受NT4(10mg/kg)或僅接受作為對照的媒質的每日施用。(B)用對照IgG(10mg/kg；n＝9)、NT4(10mg/kg)從第3天到第9天(n＝8)、或NT4(10mg/kg)從第9天到第15天(n＝8)治療動物。
圖2描述了顯示對於四個受體酪氨酸激酶(即，TrkA、TrkB、TrkC和p75)的四個受體酪氨酸激酶激動劑(即，NGF、BDNF、NT4和38B8)相對親和力的系列圖。X-軸顯示時間(全部在300-450秒範圍內)。Y-軸顯示相對親和力。第一行坐標圖的最高刻度依次為(從左到右)90、20、50和60單位；第二行坐標圖的最高刻度依次為32、60、60、140單位；第三行坐標圖的最高刻度依次為35、35、16和20單位；第四行坐標圖的最高刻度依次為90、80、100和90單位。這些數據在本文和在實施例4中被進一步描述(包括表2)。
圖3描述在MOG誘導後第9天時用TrkB激動劑治療的動物中發病率的示意圖。動物在第9天和16天接受5mg/kg TrkB激動劑抗體38B8或非特異性的IgG(對照)。根據下列評分系統評估小鼠每日EAE的臨床徵狀0＝正常；1＝無力尾；2＝中度後肢虛弱；3＝適度的嚴重後肢虛弱(動物仍然能夠艱難行走)；4＝嚴重後肢虛弱(動物可以移動其後肢但是不能行走)；5＝完全的後肢癱瘓；和6＝死亡。
圖4描述在MOG誘導後第16天時用TrkB激動劑治療的動物中發病率的示意圖。動物在第16天和23天接受5mg/kg TrkB激動劑抗體38B8或媒質(PBS)。
圖5A和5B描述了在疾病進行晚期，在治療動物中的發病率。(A)動物在第18和23天接受5mg/kg TrkB激動劑抗體38B8或非特異性IgG。(B)動物在第22天開始接受每日施用GA(COPAXONE)或僅媒質(對照)。
圖6A和6B描述了在施用TrkB激動劑或地塞米松的動物中的發病率和體重。動物接受38B8(5mg/kg，在第9和第16天每周)、或在第3-12天每日接受地塞米松(4mg/kg)或乙醇媒質(對照)。(A)如上測量發病率。(B)在疾病發生的整個過程中測量動物的體重。
圖7A和7B描述了TrkB激動劑在減少疾病發病率中的效果是劑量依賴的。(A)動物在第9和16天接受1mg/kg或5mg/kg的TrkB激動劑38B8。(B)動物在第9和16天接受5mg/kg或10mg/kg的38B8、或PBS(對照)。
圖8描述了使用體外測定在量增加的數個TrkB激動劑抗體(38B8、23B8、36D1、37D12和19H8)存在下神經元存活的相對量。該試驗操作和結果在本文和實施例1中被描述(例如，表1)。在神經元存活測定中各個抗體的EC50值被顯示在表1的第3欄。
圖9描述了顯示在未治療(對照)動物和用TrkB激動劑抗體38B8治療的動物中指示的MOG-特異性抗體同種型的相對水平的系列圖。各個圖顯示在經TrkB激動劑(38B8)治療的動物或未治療(對照)的動物中指示抗體同種型的量(如通過測量在450μm的光吸收確定)。
圖10描述了顯示脾細胞刺激測定的結果的圖。脾細胞來自MOG-誘導的未治療(對照)動物或MOG誘導的經TrkB激動劑抗體(38B8)治療的動物，在僅MOG或MOG與TrkB激動劑抗體(38B8；50μl/mg)組合，或在兩種不同濃度之一的地塞米松(10-8M和10-5M)存在下體外培養該細胞。
圖11描述了從經對照(A)和TrkB激動劑治療的動物(B)移取的脊椎切片的免疫化學染色的結果。該切片的髓磷脂用勒克司堅牢藍(Luxol Fast Blue)染色而細胞體用甲酚紫染色。
圖12描述了從經對照(A)和TrkB激動劑治療的動物(B)移取的脊椎切片的免疫化學染色的結果。該切片是用CD3的特異性的抗體染色。
圖13描述了從經對照(A)和TrkB激動劑治療的EAE動物(B)移取的脊椎切片的免疫化學染色的結果。該切片是用CD68的特異性的抗體染色。
圖14描述了從經對照和TrkB激動劑治療的EAE動物中移取的脊椎切片的組織學染色的結果。該切片用勒克司堅牢藍(Luxol FastBlue)染色髓磷脂。缺少著色表示脫髓鞘的區域。
發明詳述 定義 本文所用術語「酪氨酸受體激酶」和「受體酪氨酸激酶」被可互換使用，指其TrkB是成員的分子類型。配體(激動劑)與受體酪氨酸激酶的結合引起配體-誘導的受體二聚化和在細胞內激酶結構域中酪氨酸殘基的自磷酸化作用。繼酪氨酸磷酸化之後是多種信號級聯的激活，例如磷脂醯肌醇3-激酶(PI3K)/Akt、MAPK1和PLC-途徑，其一般是以細胞類型特異性的方式調節基因表達。
本文所用″侵入的白細胞″是侵入、浸潤或遷移進入中樞神經系統(CNS)組織(包括腦和脊椎組織)的白細胞，其為自身免疫疾病，優選影響CNS的自身免疫疾病的結果。侵入性白細胞主要是T-細胞和單核細胞，儘管可能存在其它白細胞。
本文所用″減少的白細胞侵入″指減少的白細胞遷移(即，侵入或浸潤)進入CNS組織(包括腦和脊椎組織)。減少白細胞侵入也指減少由白細胞侵入介導的細胞毒影響，特別針對下襯的神經元細胞和/或CNS組織的其它支持細胞。白細胞侵入包括由T-細胞和單核細胞的侵入。減少白細胞侵入包括保護CNS組織免受自身免疫攻擊。由白細胞侵入破壞的CNS的細胞包括表達髓磷脂的細胞和臨近的不表達髓磷脂的細胞。細胞破壞可能是通過凋亡、壞死或其組合。減少的白細胞侵入減少以下列臨床適應症為特徵如疾病惡化減慢、發作或發病率的嚴重性延遲、存活延長、生命質量改善、認知、活動或行為症狀減少或穩定化。減少白細胞侵入也包括預防或減少白細胞遷移進入中樞神經系統(CNS)組織的風險。白細胞侵入減少可以是部分的或完全的，例如，如本文所述，該減少可以是相對或實際減少的約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％或甚至約95％。
本文所用″TrkB受體激動劑″或″TrkB激動劑″是增加TrkB受體的激活量的分子，產生與由天然存在的激動劑BDNF和NT4導致的相似的效果。TrkB激活通常由受體誘導的自身磷酸化發生，其開啟特徵性的細胞內信號轉導事件的級聯反應。TrkB受體激動劑增加這一活化，例如，通過調節受體二聚化或磷酸化，通過調節天然存在的激動劑的結合、通過模擬天然存在的激動劑的結合、通過引起TrkB受體在更長(包括無限)時期內保持活化(例如，磷酸化)狀態、或者調節TrkB激活或開啟細胞內事件的級聯反應，其為TrkB受體激活的特徵。TrkB激動劑包括天然存在的激動劑多肽、片段、變體和其衍生物，包括但不限於已知的TrkB激動劑NT4和BDNF。TrkB激動劑包括激動劑抗體、片段、變體和其衍生物。本文描述了優選的TrkB激動劑特性。本發明的TrkB激動劑可以增加TrkB的激活至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少100％、至少200％或更多。本文所用″片段″多肽是保留較大多肽的至少一些生物特性(例如激活TrkB受體的能力)的所述較大多肽的部分。優選的片段包含產生所述較大多肽的生物特性的所述較大多肽的胺基酸殘基和/或結構。多肽片段可以被稱為肽，儘管在這裡的多肽和肽之間沒有區別。本文描述了示例性片段。可以如本文所述衍生片段。
本文所用″衍生物″多肽具有一個或多個共價或非共價的修飾，例如加入或移去功能基團或部分。本文提供了衍生物的例子。
本文所用的特定多肽序列的″變體″被定義為在多肽序列之一的某長度範圍與特定的多肽序列具有至少40％序列同一性的多肽序列，使用諸如Clustal V或BLAST算法，例如″BLAST 2 Sequences″工具2.0.9版本(May7，1999)，按照默認參數設置。這類多肽對可能在多肽之一的某定義的長度內顯示，例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％或更多的序列同一性。
本文所用應用於多肽序列的″序列同一性″，指在至少兩個多肽序列之間殘基匹配的百分數，其使用標準化算法比對，例如Clustal V、MEGALIGN或BLAST。多肽序列比對的方法是眾所周知的。一些比對方法說明保守胺基酸的取代。如本文所述的這類保守的取代，和通常在取代位點保存了電荷和疏水性，因此保留了多肽的結構(和由此其功能)。
如這裡使用的，″可有效激活TrkB受體的量″或與TrkB激動劑有關的類似表達，指與施用TrkB受體激動劑之前基線水平的激活相比足夠增加TrkB受體激活的量(如在這裡定義和本技術領域公知的)。激活的增加可以是至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少100％、至少200％或更多。這一量應該考慮用藥途徑，TrkB激動劑在體內的半衰期、TrkB激動劑的溶解度、生物利用度、清除率和其它的藥物代謝動力學特徵，動物或患者的體重和代謝等。又見TrkB激動劑。
本文所用″需要治療的動物″或類似表達指患有發展涉及CNS的自身免疫疾病或有其風險的動物，優選哺乳動物，包括人。影響CNS的自身免疫疾病(或病徵，沒有區別)的例子是小鼠中的實驗性自身免疫腦脊髓炎(EAE)、人中的多發性硬化(MS)、和在其它哺乳動物中發現的相似的自身免疫疾病。也在例如，免疫排斥、視神經疾病、炎性腸病、和帕金森病中觀察到CNS的自身免疫攻擊。
本文所用″天然存在的TrkB激動劑″是天然存在的和作為TrkB受體的激活劑起作用的分子。TrkB受體公知的天然存在的激動劑是神經營養素NT4和BDNF。天然存在的TrkB激動劑包括天然存在的變體分子，例如在具有突變的TrkB等位基因的動物中表達的神經營養素多肽。
本文所用「分離的抗體」指基本沒有其它具有不同抗原特異性的抗體(例如，特異性結合TrkB的分離的抗體基本沒有特異性結合除了TrkB之外的抗原的抗體)。然而，特異性結合TrkB的分離的抗體可能對其它抗原(例如來自其它物種的TrkB分子)具有交叉反應性。而且，分離的抗體可基本沒有其它細胞物質和/或化學藥物。
本文所用術語″單克隆抗體″或″單克隆抗體組合物″指單分子組合物的抗體分子的製劑。單克隆抗體組合物顯示對特定表位的單結合特異性和親和力。
一般技術 本發明應用在分子生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學領域使用的常規技術。這類技術在參考文獻中被描述，例如，MolecularCloningA Laboratory Manual，second edition(Sambrook等人，1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(MJ.Gait編輯，1984)；Methods in Molecular Biology，Humana Press；Cell BiologyA Laboratory Notebook(J.E.CeIHs編輯，1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney編輯，1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts，1998)Plenum Press；Cell and Tissue CultureLaboratory Procedures(A.Doyle，J.B.Griffiths和D.G.Newell編輯，1993-8)J.Wiley和Sons；Methods in Enzymology(AcademicPress，Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和CC.Blackwell編輯)；Gene Transfer Vectors for MammalianCells(J.M.Miller和M.P.Calos編輯，1987)；Current Protocolsin Molecular Biology(F.M.Ausubel，等人，編輯，1987)；PCRThe Polymerase Chain Reaction，(Mullis等人，編輯，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人，編輯，1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley和Sons，1999)；lmmunobiology(CA.Janeway和P.Travers，1997)；Antibodies(P.Finch，1997)；Antibodiesa practical approach(D.Catty.編輯，IRL Press，1988-1989)；monoclonal antibodiesa practicala pproach(P.Shepherd和C Dean，編輯，Oxford University Press，2000)；Using antibodiesa laboratory manual(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999)；TheAntibodies(M.Zanetti和J.D.Capra，編輯，Harwood AcademicPublishers，1995). TrkB激動劑 本發明提供使用TrkB激動劑治療多發性硬化和其它影響中樞神經系統(CNS)的自身免疫疾病的方法。根據本發明的一個特徵，TrkB激動劑有效減少白細胞侵入CNS的組織和減少CNS的下襯神經元組織的破壞，並因此緩解這一疾病的臨床現象，例如肢體麻痺。具體的，TYkB激動劑減少單核細胞和T-細胞的遷移，其具有呈遞髓磷脂抗原和向產生它們的細胞施用細胞毒性效應的活性。
使用MS的良好接受的動物模型(實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠)進行了導致本發明的觀察。EAE是實驗性疾病狀態，其與人中的MS共享許多臨床和病理的特徵。許多FDA-批准的MS治療是基於在小鼠和大鼠中的EAE模型第一次被發現並發展的(由Steinman和Zamvil綜述，2006)。在使用髓磷脂少突膠質細胞糖蛋白(MOG)的肽35-55免疫之後，可以在C57BL/6小鼠中誘導EAE(Aharoni，R.等人，2005a)。用MOG免疫誘導髓磷脂-特異性的自身免疫反應，其導致與MS相似的脫髓鞘和發病率。
使用TrkB激動劑的動物試驗 在支持本發明而執行的試驗中，已經表明，在患CNS-特異性的自身免疫疾病的動物中直接施用TrkB激動劑減少發病率和CNS組織損傷(圖1A和1B)。在MOG-誘導之後將天然存在的TrkB激動劑NT4的重組形式施用於EAE動物(實施例5)。用NT4治療的動物顯示與對照動物相比顯著減少的發病率。這一結果證明施用TrkB激動劑在減緩慢性EAE發展中是有效的。更多的試驗表明，關於症狀的發作，在早期施用NT4時提供的保護至少與在晚期施用一樣好(即使不更好)，且為了治療有效而用TrkB激動劑治療不必持續至病徵發作之時(圖1B)。TrkB活化可以是在EAE的誘導中相對上遊的靶標步驟。
實施例1-4和6描述了TrkB抗體，其中的一些基於它們刺激TrkB的生物活性(即激活TrkB的能力)，作為TrkB激動劑起作用(例如，實施例6和表1和2)。數個抗體，包括抗體38B8，是對TrkB特異性的，且顯示對測定的其它受體酪氨酸激酶沒有顯著的結合。與天然存在的激動劑BDNF和NT4(其顯示一些交叉反應性)相比，抗體38B8對於TrkB受體更加具有選擇性。在實施例4和表2中提供這些配體-受體相互作用的動力學分析。
動物試驗顯示，與對照免疫球蛋白相比，TrkB激動劑抗體提供免於EAE發病的顯著保護(圖3，實施例7)。當在MOG-誘導之後遲至16天，和在臨床症狀發作之後施用時，TrkB激動劑抗體是有效的(圖4)。與格拉默乙酸酯(GA)的比較提示，TrkB激動劑的活性機制與GA和其它目前的MS藥物不同(圖5)。其它的結果證明TrkB激動劑的有益效果與免疫抑制劑-地塞米松的效果相似(圖6A和6B)。TrkB激動劑抗體的有益效果是劑量依賴性的(圖7A和7B)。
使用神經元細胞存活測定證明，TrkB激動劑以與天然存在的TrkB激動劑一致的方式影響神經元細胞(實施例8)。加入增加量的TrkB激動劑抗體導致增加的神經元存活(圖8)。在實施例1中被描述了在神經元存活測定和在人KIRA測定中TrkB激動劑抗體38B8、23B8、36D1和37D12的EC50值並總結子表1。
治療MS的目前的藥物(包括GA和地塞米松)是免疫調節劑。TrkB激動劑抗體未表明通過抑制抗-MOG抗體的產生而起作用，並因此，未表明作為常規免疫抑制劑作用(圖9，實施例9)。而且，TrkB激動劑抗體的存在對脾細胞刺激沒有如同免疫抑制劑-地塞米松的明顯效果(圖10)。用TrkB激動劑治療的動物保留產生正常抗-MOG T-細胞和/或B-細胞應答的能力。這些觀察表明免疫抑制劑-地塞米松和TrkB激動劑的活性機制不同，且TrkB激動劑的活性機制在白細胞增殖水平上不是主要的。
組織學分析顯示從用TrkB激動劑治療的動物製備的切片中減少的白細胞侵入。一些TrkB激動劑-治療的動物顯示實際上沒有CNS白細胞侵入的證據(圖11)。通過染色表達CD3的T-細胞和表達CD68的巨噬細胞來執行侵入細胞的鑑定。與對照動物相比，來自用TrkB激動劑治療的動物的脊椎組織顯示T-細胞和單核細胞侵入實質性減少(圖12和13)。嚴重的脫髓鞘區域在對照小鼠中而非用TrkB激動劑治療的小鼠中(圖14)。CNS組織切片的組織化學染色的結果證明，TrkB激動劑治療減少CNS的淋巴細胞和單核細胞的侵入。
以上所述的結果證明，TrkB激動劑有效減少CNS的白細胞侵入和減緩EAE(廣泛接受的MS的動物模型)的進展。該天然存在的TrkB激動劑NT4和TrkB激動劑抗體在減緩疾病發展中都是有效的。所述激動劑抗體顯示出對TrkB的最大選擇性並用於進一步的研究。TrkB激動劑的有益效果是劑量依賴性的，隨著TrkB激動劑增加，發病率減小。與目前的MS藥物不同，TrkB激動劑不是主要通過免疫抑制起作用。組織化學試驗顯示TrkB激動劑減少T-細胞和單核細胞的CNS組織侵襲。
用於CNS自身免疫疾病的TrkB激動劑 不為理論所限，認為TrkB激動劑主要通過調節白細胞的遷移起作用。細胞免疫可能在MS中佔優勢，使TrkB激動劑成為比當前影響體液免疫的免疫抑制劑更有效類型的藥物。而且，本方法可以與當前的免疫抑制治療組合以產生另外的治療效果。
可以使用本發明的TrkB激動劑在多個自身免疫或相關疾病中減少CNS組織的白細胞侵襲。除了是MS的模型，也使用EAE小鼠研究視神經炎。TrkB激動劑預期在由尤其是白細胞侵入介導的全部這些疾病和其它自身免疫疾病中減輕CNS免疫侵入。注意術語疾病和病徵的使用沒有區別。
本發明的特徵是向患有自身免疫疾病的動物直接施用TrkB激動劑。儘管以多肽的方式描述本發明的優選的實施方案，本發明包含施用編碼這類TrkB激動劑多肽的多核苷酸，其將在體內指導編碼的TrkB激動劑的表達。直接的DNA注射和基因治療遞送的方法是本技術領域公知的。將TrkB激動劑多肽，或編碼它們的多核苷酸與通過施用藥物(例如GA)誘導相反，直接施用於動物。本發明還包含素擬肽分子，其以與天然存在的TrkB激動劑和/或激動劑抗體一致的方式結合和激活TrkB。
根據本文所述的方法使用的具體的TrkB激動劑在以下進行了更加詳細的描述。另外的TrkB激動劑是對本技術領域的技術人員之一而言顯而易見的，而不背離本發明的範圍。
天然存在的TrkB激動劑和其衍生物 TrkB激動劑包括天然存在的激動劑多肽，包括但不限於公知的TrkB激動劑NT4和BDNF。NT4和/或BDNF多肽序列可能來自與相應的TrkB受體相同的物種，或來自不同的物種，只要產生的多肽結合於TrkB和作為激動劑起作用。
TrkB激動劑包括天然存在的和變體的NT4(即，NT-4/5和相似的名稱)。NT4多肽被描述在美國專利申請公開2005/0209148、2003/0203383和2002/0045576，和在PCT WO 2005/08240中。NT4(即，NT4/5)多肽已經在許多哺乳動物中被鑑定。目標胺基酸取代包括G77至K、H、Q或R；和R84至E、F、P、Y或W。可以除去蛋白酶切割位點以延長NT4和BDNF多肽的半衰期，或加入蛋白酶切割位點以允許其活性的調節。TrkB激動劑可以是綴合或融合於延長半衰期部分，例如PEG，IgG Fc區域，白蛋白，或肽或表位，例如Myc、HA(血凝素)，His-6或FLAG。
BDNF多肽也已經在許多哺乳動物中被鑑定(見，例如，美國專利5,180,820和美國專利申請公開2003/0203383)。
本發明的天然存在的和變體的NT4和BDNF多肽包括嵌合體、變體、片段(包括肽)、和/或其衍生物。優選的片段包括天然存在的多肽的TrkB結合部分，或嵌合的、共有的或突變的與其相當的結合部分。片段包括合成的肽。變體包括具有保守和非保守的胺基酸取代的天然存在的胺基酸序列變體。
保守的取代涉及相似大小、電荷或疏水性的胺基酸殘基。例如，Ala可以由Val、Leu或Ile取代。Arg可以由Lys、Gln或Asn取代。Asn可以由Gln、His、Lys或Arg取代。Asp可以由Glu取代。Cys可以由Ser取代。Gln可以由Asn取代。Glu可以由Asp取代。Gly可以由Pro取代。His可以由Asn、Gln、Lys或Arg取代。Ile可以由Leu、Val、Met、Ala、Phe或正亮氨酸取代。Leu可以由正亮氨酸、Ile、Val、Met、Ala或Phe取代。Lys可以由Arg、Gln或Asn取代。Met可以由Leu、Phe或Ile取代。Phe可以由Leu、Val、Ile或Ala取代。Pro可以由GIy取代。Ser可以由Thr取代。Thr可以由Ser取代。Trp可以由Tyr取代。Tyr可以由Trp、Phe、Thr或Ser取代。VaI可以由Ile、Leu、Met、Phe、Ala或正亮氨酸取代。
可以通過選擇性取代實現功能上的重要修飾，其在維持以下的影響上顯著不同(a)在取代區域中多肽骨架的結構，例如，作為摺疊(sheet)或螺旋構象，(b)在靶標位點上分子的電荷或疏水性，或(c)側鏈的大小。基於一般側鏈特性被分組天然存在的殘基(這些中的一些可以落入數個功能基團) (1)疏水的Met、Ala、Val、Leu、Ile、正亮氨酸； (2)中性親水的Cys、Ser、Thr； (3)酸性Asp、Glu； (4)鹼性Asn、Gln、His、Lys、Arg； (5)芳香族的Trp、Tyr、Phe；和 (6)引起轉折的殘基Gly和Pro。
非保守的取代將一類中的成員與另一類中的成員交換或涉及在先前段落中未鑑定為保守的取代。
變體包括天然存在的胺基酸序列變體和基因工程的變體，只要產生的多肽或衍生物結合於TrkB和作為激動劑起作用。在本文和所引用的參考文獻中描述了測量TrkB活性的測定。
更多的變體包括具有來自酪氨酸受體激酶的Trk家族的其它相關配體(包括NT3和NGF)的部分胺基酸序列的TrkB激動劑多肽。變體還包括具有共有的Trk或共有的受體酪氨酸激酶結合和/或激活序列的多肽。
其它衍生物包括共價和非共價修飾的肽和多肽(例如，醯化、聚乙二醇化、法尼基化、糖基化或磷酸化的多肽)。特殊的聚乙二醇化的和其它修飾形式的NT4被描述在美國專利申請公開2005/0209148中。該多肽可以包括另外的功能基團來調節結合和/或活性，使能夠在體內成象、調節半衰期、調節穿過血腦屏障的運輸或幫助將多肽靶向特定的細胞類型或組織。多肽可以包含胺基酸取代以利於修飾(例如，加入聚乙二醇化、糖基化或其它位點)，只要該取代不實質影響該多肽結合於TrkB或激動劑活性。
常見的修飾是聚乙二醇化以降低系統清除率且最少喪失生物活性。使用本技術領域公知的方法，可以將聚乙二醇聚合物(PEG)連接於NT4和BDNF多肽(以及TrkB激動劑抗體)的多個功能基團(見，例如，Roberts等人(2002)，Advanced Drug Delivery Reviews54459-476；Sakane等人(1997)Pharm.Res.141085-91)。可以將PEG連接於，例如，氨基基團、羧基基團、修飾的或天然的N-末端、胺基團和巰基基團。在一些實施方案中，用PEG分子修飾一個或多個表面胺基酸殘基。PEG分子可以是不同大小的(例如，範圍從約2至40kDa)。連接於NT4、BDNF或其它多肽的PEG分子可以具有的分子量約為2000、10,000、15,000、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000Da的任意。PEG分子可以是單個鏈或支鏈的。為了將PEG連接於TrkB激動劑多肽，可以使用在一個或兩個末端具有功能基團的PEG的衍生物。基於在多肽上可獲得的反應基團類型選擇功能基團。連接衍生物到多肽的方法是本領域公知的。
已經產生聚乙二醇化的NT4並顯示在動物中作為NT4起作用(見，例如，美國專利申請公開2005/0209148的實施例6和7和PCT WO2005/082401)。在成熟的人NT4位置50的絲氨酸殘基可以被替換為半胱氨酸以產生NT4-S50C，而後被聚乙二醇化，其中所述PEG被連接於在位置50的半胱氨酸。N-末端特異性連接到PEG的一個例子是將位置1的殘基突變為絲氨酸或蘇氨酸，以利於聚乙二醇化。相似的方法應用於BDNF和在本發明中使用的其它多肽。
多肽或其衍生物可以直接的或經由合成的接頭被連接於其它分子。與其價值已被報導的天然存在的TrkB激動劑相比，優選的TrkB激動劑多肽、片段或其衍生物顯示相似或更好的結合親和力、選擇性和活化。小部分的激動劑多肽可以被稱為「肽」，儘管這一術語不應視為限制。
在本文所述的多個試驗和測定(包括動力學測定、EAE動物模型、KIRA測定和神經元存活測定)中，優選的TrkB激動劑顯示與BDNF和NT4相比相似的生物特性。
TrkB抗體激動劑及其衍生物 TrkB激動劑包括激動劑抗體、片段、變體及其衍生物。合適的激動劑抗體是對TrkB有選擇性的，且以與天然存在的NT4和BDNF多肽相似或更多的親和力結合。然而，與天然存在的TrkB激動劑相比，抗體的長期循環半衰期使結合親和力較不關鍵。測定抗體38B8的結合親和力為46±10nM(見上述和實施例4)。使用在實施例4中描述的具體的測定條件，優選的TrkB激動劑抗體具有的Kd為少於100nM、少於10nM、少於1nM、少於100pM或甚至少於10pM。
在本文所述的多個試驗和測定(包括結合測定、EAE動物模型、KIRA測定和神經元存活測定)中，優選的TrkB激動劑也呈現與抗體38B8(和天然存在的激動劑)相比相似的生物特性。例如，在實施例1(包括表1)中所述的神經元存活測定中，優選的TrkB激動劑呈現的EC50值為少於11pM。優選的TrkB激動劑具有的EC50值為從約1pM至約10pM、從約0.1pM至約1pM、從約0.01pM至約0.1pM或甚至低於0.01pM。示例性的EC50值是38B8為0.2pM和36D1為5pM。使用KIRA測定，優選的TrkB激動劑也呈現與抗體38B8相比相似的生物特性(實施例1，包括表1)。優選的TrkB激動劑具有的EC50值在KIRA測定中為少於50nM，優選從約5nM至少於50nM，從約0.5nM至約5nM或甚至低於0.5nM。在提供的測定條件下，示例性的EC50值是約5nM。
TrkB激動劑抗體包括多克隆抗體、單克隆抗體、重組抗體、雜交的、共有的、嵌合的、雙特異性或綴合的抗體。如果可應用，該抗體可以是任意的同種型(即，IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)。抗體包括抗體片段(例如，Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、Fc和單鏈(ScFv)抗體)。合適的TrkB激動劑抗體或其功能片段或衍生物以本文所述的方式，例如，關於單克隆抗體激動劑38B8，結合於並激活TrkB。TrkB激動劑抗體包括抗體片段，其包括包含衍生自抗體的胺基酸序列的多肽。特別重要的是參與抗原識別的胺基酸序列，例如在CDR區域中的那些。
單克隆抗體和小鼠雜交瘤方法是本領域眾所周知的。非人抗體用於治療人的用途可以耐受與免疫抑制藥物組合。這類藥物被常規施用治療或減少MS和其它自身免疫和炎症疾病的症狀。免疫調節藥物是本領域公知的且包括糖皮質激素、殺細胞物質(例如，烷化劑、抗代謝藥、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤和巰嘌呤)、細胞毒性抗體(例如，T-細胞受體和IL-2-特異性抗體)、對嗜免疫劑發揮作用的藥物(例如，環孢菌素、他克莫司、西羅莫司、雷帕黴素(rapamicin)、雷帕鳴(RAPAMUNE)、普樂可復(PROGRAF)和FK506)、幹擾素(例如，IFN-β)、鴉片、TNF-結合蛋白(例如，循環受體)、麥考酚酯和用於抑制動物對外源抗體或治療抗原的免疫應答的其它生物劑。
人源化源自不同物種(例如小鼠)的單克隆抗體的方法是本領域眾所周知的。為了治療人，優選人或人源化的抗體。人源化的抗體包含最小量的非人胺基酸序列，這樣它們在人中是最小限度免疫原性或非免疫原性的。優選的人源化抗體不被人免疫系統識別為外源。這類抗體可以是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白片段(例如，Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2)或其它包含抗原結合必須的胺基酸殘基的免疫球蛋白鏈部分，在抗原結合位點外的主要胺基酸序列衍生自人免疫球蛋白。在互補決定區(CDR)之內的胺基酸殘基也可以由人特異性的殘基取代，只要抗原結合沒有不利影響。
人抗體是唯一地或基本包含人抗體的胺基酸序列的抗體。人抗體也包括包含至少一種人重鏈多肽或至少一種人輕鏈多肽的抗體或其重要片段，任選與來自另一動物的重鏈或輕鏈組合。一個這類例子是包含鼠輕鏈和人重鏈多肽的抗體。
合適的TrkB激動劑抗體、片段或其衍生物可以在轉基因動物、哺乳動物細胞(包括B-細胞)、鳥類細胞、昆蟲細胞、酵母或細菌中表達或分泌。例如，可以通過免疫能夠產生全部為人免疫球蛋白或基本為人免疫球蛋白的轉基因動物(例如，小鼠)產生合適的人抗體。也可以通過基因改組(gene-shuffling)、噬菌體展示、大腸桿菌展示、核糖體展示、mRNA展示、蛋白質片段互補或RNA-肽篩選產生抗體。用於設計和產生人源化和人的抗體及其衍生物的方法被描述在，例如，美國專利7,005,504、6,800,738、6,407,213、6,054,297、6,331,415，和5,750,373(Genentech)；美國專利6,833,268、6,207,418、6,114,598，和6,075,181(Abgenix)；美國專利6,498,285(Alexion)；美國專利7,074,557、5,885,793、5,837,242、5,733,743、5,565,332(Cambridge Antibody Technology)；美國專利7,118,879、6,979,538、6,326,155、5,994,125、5,837,500(Dyax)；美國專利6,753,136、6,667,150、6,300,064、5,514,548(MorphoGen/Protein Design Labs)；和6,461,824、6,204,023、5,821,123、5,595,898、5,576,184、4,698,420(Xoma)；美國專利7,041,870、6,680,209、6,500,931、6,111,166、6,096,311、6,071,517、6,063,116(Medarex)；和美國專利4,816,397(Celltech)。用於產生人或人源化的抗體的方法也被描述在Vaughan等人(1996)Nature Biotechnology 14309-14；Sheets等人(1998)Proc.Natl Acad.ScL USA 956157-6162；Hoogenboom和Winter(1991)J.MoI.Biol.，227381；Marks等人(1991)J.MoI.Biol.，222581；Cole等人(1985)in Monoclonal Antibodies和CancerTherapy(Alan R.Liss)p.77；和Boerner等人，1991，J.Immunol.，147(1)86-95。
可對TrkB激動劑抗體進行共價或非共價的修飾(例如，乙醯化的、聚乙二醇化的(見例如，實施例5)、法尼基化、糖基化、磷酸化等)並也可以包括另外的功能基團來調節結合、調節激動劑活性、使多肽在體內能夠成象、調節多肽的半衰期或調節運輸穿過血腦屏障。多肽可能包含利於修飾的胺基酸取代(例如，另外的聚乙二醇化、糖基化或其它位點)，只要該取代基本不影響多肽與TrkB的結合或激動劑活性。多肽或其衍生物可以直接或經由合成的接頭被連接於其它分子。
如本文和所可用的參考文獻中所述，合適的抗體片段或衍生物包含介導TrkB-結合和激活的胺基酸殘基。主要由在六個小環區域中的殘基確定抗體特異性，所述環區域被稱為互補決定區(CDR)或高變環，位於輕鏈和重鏈的N-末端附近。在輕鏈中的CDR通常是在胺基酸殘基24和34(CDR1-L)、50-56(CDR2-L)和89-97(CDR3-L)之間。在重鏈中的CDR通常是在胺基酸殘基31和35b(CDR1-H)、50-65(CDR2-H)和95-102(CDR3-H)之間。一些CDR的長度比其它更加可變。CDR1-L長度變化從約10-17個殘基，而CDR3-H長度變化從約4-26個殘基。其它的CDR是適當的標準長度。Padlan，E.A.等人(1995)FASEB.J.133-39。在本發明中使用的優選的TrkB激動劑抗體片段包含來自CDR或來自CDR內的重鏈和/或輕鏈結構域的胺基酸殘基。
如上所述和本領域公知的，本發明使用的抗體包括天然存在的胺基酸序列變體，其具有保守和非保守的胺基酸取代。
與天然存在的TrkB激動劑相比，優選的TrkB激動劑抗體、片段或其衍生物顯示出相似或更好的結合親和力、選擇性和激活能力。小部分的激動劑多肽可以被稱為「肽」，儘管這一術語不應被解釋為限制。
TrkB激動劑製劑 可以將TrkB激動劑用於製備藥物，該藥物用於治療影響中樞神經系統的自身免疫疾病(例如多發性硬化)。如本文定義的，在這一方式中，可以使用包含TrkB激動劑的組合物來治療哺乳動物(包括人患者)中的疾病。TrkB激動劑組合物還可以包含合適的藥物可接受的賦形劑，其為本領域公知的。儘管可以使用其它施用形式，TrkB激動劑組合物通常被配製為通過注射(例如，腹膜內、靜脈內、皮下、肌肉內等)施用。可以將TrkB激動劑配製為用於注射的製劑，通過將其溶解、懸浮或乳化於含水或非水的溶劑(例如植物或其它類似的油、合成的脂肪酸甘油酯、較高級脂肪酸或丙二醇的酯)；且如果需要，含常規的添加物，例如，增溶劑、等滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩定劑和防腐劑。
合適的載體、稀釋劑和賦形劑是本領域眾所周知的，且包括如下材料例如碳水化合物、蠟、水溶性和/或可膨脹的聚合物、親水或疏水材料、明膠、油、溶劑、水等等。將依賴於應用本發明的化合物的方法和目的來決定使用的具體載體、稀釋劑或賦形劑。通常，安全的溶劑是非毒性的含水溶劑，例如水和其它可以溶解和混合於水中的無毒性溶劑。合適的含水溶劑包括水、乙醇、丙二醇、聚乙二醇(例如，PEG400、PEG300)等及其混合物。該製劑也可以包括一個或多個緩衝液、穩定劑、表面活性劑、溼潤劑、潤滑劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑、抗氧化劑、不透明物質、助流劑、操作助劑、著色劑、甜味劑、芳香劑、調味劑和其它已知的添加劑以提供藥物的適當存在(即，本發明的化合物或其藥物組合物)或幫助製備製藥產物(即，藥物)。一些製劑可以包括載體(例如脂質體)。脂質體的製劑包括，但不限於，細胞轉染劑、多層脂囊和單層囊泡。用於胃腸道和非胃腸道藥物遞送的賦形劑和製劑如Remington，The Science and Practice ofPharmacy(2000)中所述。
施用和劑量 在本文示例的施用方案和治療劑量是基於這類因素，例如動物體重、在血液中TrkB激動劑的半衰期和TrkB激動劑的親和力。優選的施用方案和劑量使在施用之間維持TrkB激動劑在體內的治療量。NT的有效劑量範圍(包括天然存在的TrkB激動劑)在本文和在Davies等人(1993)和在其它參考文獻中被示例。激動劑抗體的有效劑量範圍在這裡被示例(例如，在EAE動物中1-10mg/kg)，並提供用於確定類似激動劑抗體的最適劑量的起點。
如執行支持本發明的試驗證明的(見，例如，圖1B、3和4)，在疾病過程早期的「脈衝治療」似乎足以降低動物的發病率。對於治療效率無需持續施用TrkB激動劑。
具體劑量方案(即，劑量、時間和重複)將決定於待治療的人或動物的年齡、病情和體重。可以從動物試驗推斷起始的給藥方案。TrkB激動劑施用的時間/頻率應該基於當施用時具體TrkB激動劑的循環半衰期(或在神經組織中的半衰期)、穿過血腦屏障的激動劑的量、激動劑在細胞中的半衰期、毒性和副作用。
在本研究中，通過腹膜內(i.p.)注射來施用TrkB激動劑；但其它施用途徑(例如，靜脈內、皮下、肌肉內)也預期有效。顱內或脊柱內的施用(或施用於CNS的其它組織)可能是有效的。其它施用途徑也可適合，決定於具體的TrkB激動劑、其包被、綴合或具體的生物特性(例如，口服、舌下、滑膜內、黏膜、經皮、關節內、陰道內、肛門、尿道、鼻、耳、經由吸入、噴注、經由導管、作為彈丸、以支架或其它可植入裝置、以栓狀組合物、以靜脈滴注、以貼片或溶解薄膜等)。
TrkB激動劑優選是經由合適的外周途徑施用。雖然如此，應該理解小百分比的激動劑可能穿過血腦屏障並被遞送至中樞神經系統的細胞。在一些情況下，能夠進入CNS的外周施用TrkB激動劑的量很小(甚至少於1％)。
本發明的特徵是將TrkB激動劑直接施用於患有自身免疫疾病的哺乳動物受試者。「直接」意指將TrkB激動劑多肽或多核苷酸通過標準接種途徑遞送於動物。可以將TrkB激動劑與其它藥理製劑組合遞送於動物，包括免疫抑制劑，例如，糖皮質激素、殺細胞劑(例如，烷化劑、抗代謝劑、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤和巰嘌呤)、細胞毒性抗體(例如，T-細胞受體和IL-2-特異性抗體)、作用於嗜免疫劑的藥物(例如，環孢菌素、他克莫司、西羅莫司、雷帕黴素)、幹擾素(例如，IFN-β)、鴉片、TNF-接合蛋白(例如，循環受體)、麥考酚酯和其它用於抑制動物對外源抗體或治療抗原的免疫應答的生物物質。
TrkB激動劑抗體超過天然存在的TrkB激動劑的優點是與循環的蛋白配體相比傾向具有相對長的循環半衰期的抗體。例如，當天然存在的激動劑可能需要每日施用時，抗體可能僅需要每周施用。另一優點是，抗體傾向於具有更高的接合親和力，且相比細胞受體對其蛋白配體而言，抗體對於其抗原更有選擇性。
使用TrkB激動劑的治療可以與對多發性硬化和相關病徵的常規治療組合。用於治療和處置多發性硬化的常規藥物包括，但不限於ABC(即，Avonex-Betaseron/Betaferon-Copaxone)治療(例如，幹擾素β1a(AVONEX，REBIF)、幹擾素β1b(BETASERON，BETAFERON)和格拉默乙酸酯(COPAXONE)；化學治療劑(例如，米託蒽醌(NOVANTRONE)、硫唑嘌呤(IMURAN)、環磷醯胺(CYTOXAN，NEOSAR)、環孢菌素(SANDIMMUNE)、甲氨蝶呤和克拉屈濱(LEUSTATIN)；皮質類固醇和促腎上腺皮質激素(ACTH)(例如，甲潑尼松龍(DEPO-MEDROL、SOLU-MEDROL)、潑尼松(DELTASONE)、潑尼松龍(DELTA-CORTEF)、地塞米松(MEDROL、DECADRON)、促腎上腺皮質激素(ACTH)和促皮質素(ACTHAR)；疼痛介導(觸物感痛)(例如，卡馬西平(TEGRETOL、EPITOL、ATRETOL、CARBATROL)1加巴噴丁(NEURONTIN)、託吡酯(TOPAMAX)、唑尼沙胺(ZONEGRAN)、苯妥英(DILANTIN)、地昔帕明(NORPRAMIN)、阿米替林(ELAVIL)、丙米嗪(TOFRANIL、IMAVATE、JANIMINE)、多塞平(SINEQUAN1 ADAPIN1 TRIADAPIN，ZONALON)、普羅替林(VIVACTIL)1大麻和合成的大麻素(MARINOL)、已酮可可鹼(TRENTAL)、布洛芬(NEUROFEN)、阿司匹林、醋氨酚和羥嗪(ATARAX)；和其它的治療(例如，那他珠單抗(ANTEGREN)、阿侖珠單抗(CAMPATH-1H)、4-氨基吡啶(FAMPRIDINE)、3，4二氨基吡啶、依利羅地、IV免疫球蛋白(GAMMAGARD，GAMMAR-IV，GAMIMUNE N，IVEEGAM，PANGLOBULIN，SANDOGLOBULIN，VENOGLOBULIN)、普瑞巴林和齊考諾肽)。
試劑盒部分 本發明也提供實踐本發明的方法的試劑盒部分(試劑盒)。試劑盒包括適當分離和滅菌的TrkB激動劑和根據本文所述本發明的任意方法使用的說明書。通常，這些說明書包括對如何施用TrkB激動劑的描述。該試劑盒可能還包括說明書，其用於鑑定需要治療和監測或測量治療效果的動物。說明書通常包括有關劑量、劑量方案(施用頻率)和施用途徑的信息。在試劑盒中提供的說明書可以是文字的或以數據文件或表格的機器/計算機可讀的形式。
該試劑盒也可以包含施用TrkB激動劑的儀器，包括注射器、針頭、導管、吸入器、泵、乙醇交換、紗布、CNS活組織檢查儀器、組織抗體和染料等。按照需要對試劑盒的成分滅菌。試劑盒還可以提供另外的藥理製劑，包括，但不限於，免疫抑制劑，例如GA和地塞米松。試劑盒可以包括日期郵戳、防撬包裝、和射頻鑑定(RFID)標籤或其它庫存控制特徵。
實施例 提供下列實施例進一步說明本發明。本發明的另外的方面只要不背離本發明的範圍對於本領域技術人員是顯而易見的。
實施例1TrkB激動劑抗體的產生和篩選 免疫以產生單克隆抗-TrkB激動劑抗體 用8μg的人TrkB細胞外結構域作為抗原按照常規方案注射5次Balb/C小鼠。在293細胞中使用載體pTriEx-2Hygro(Novagen，Madison W1)表達His-標記的人TrkB細胞外結構域(殘基31-430)。根據產品說明書(Qiagen，Valencia，CA)使用Ni-NTA樹脂純化TrkB細胞外結構域。對於先前的4次注射，通過混合人TrkB與RIBI佐劑系統和鋁來製備抗原。在11天過程中約每3天，經由頸背、足墊和IP注射獲得總共8μg的抗原。在第13天，將小鼠安樂死和移出脾臟。將淋巴細胞與8653細胞融合以製備雜交瘤克隆。使克隆生長，然後用人和大鼠TrkB ELISA通過ELISA篩選選擇抗-TrkB陽性細胞。
ELISA篩選抗-TrkB抗體 根據結合人和大鼠TrkB的能力對來自生長的雜交瘤克隆的上清液進行篩選。用96-孔板進行測定，所述平板使用100μl的0.5μg/ml大鼠或人TrkB-Fc融合蛋白包被過夜。在各個步驟之間使用含有0.05％吐溫-20的PBS從孔洗去多餘的試劑。用含有0.5％BSA的磷酸緩衝鹽水(PBS)封閉平板。將上清液加入平板，並在室溫孵育2小時。另入綴合了馬辣根過氧化物酶(HRP)的山羊-抗小鼠Fc以結合與TrkB結合的小鼠抗體。然後加入四甲基聯苯胺作為HRP的底物檢測在上清液中存在的小鼠抗體的量。停止反應，並通過讀取在450nm的吸光度定量抗體的相對量。在ELISA測定中顯示五十個抗體陽性。在這些抗體中，進一步檢測五個抗體，並顯示具有激動劑活性。見下表2。
KIRA測定 使用這一測定在ELISA中針對人TrkB誘導受體酪氨酸激酶激活的能力篩選呈陽性的抗體。Sadick，等人(1997)Experimental CellResearch 234354-61。使用用gD標記的人TrkB轉染的穩定細胞系，檢測從雜交瘤克隆純化的鼠抗體的活化細胞表面受體的能力，所述活化與使用天然配體BDNF和NT-4/5時所見活化相似。天然配體誘導TrkB受體的激酶結構域的自體磷酸化。將細胞暴露於多種濃度的抗體之後，對其裂解和執行ELISA以檢測TrkB受體的磷酸化作用。測定各個推定的TrkB激動劑的EC50(在以下表2和圖10顯示)和與天然配體NT-4/5的EC50進行比較。
E15結狀神經元存活測定 獲自E15胚胎的結狀神經節神經元是由BDNF支持，從而在飽和濃度的神經元營養因子下培養48小時的存活率接近100％。在缺少BDNF時，在48小時後少於5％的神經元存活。因此，E15結節性神經元的存活率是評估抗-TrkB抗體的激動劑活性的敏感測定，即，激動劑抗體會促進E15結節性神經元的存活。
將按時交配的懷孕的Swiss Webster雌性小鼠通過CO2吸入處以安樂死。移出子宮角，並提取在胚胎期E15的胚胎。分離結節性神經節，接著用胰蛋白酶消化、機械分離，並在確定的無血清培養液中在用聚-L-鳥氨酸和層粘連蛋白包被的96孔平板中以每孔200-300個細胞的密度平板接種。參考人BDNF，以劑量應答的方式一式三份地評估抗TrkB抗體的激動劑活性。對培養48小時的細胞在Biomek FX液體處理工作站(Beckman Coulter)進行自動化免疫細胞化學操作。該操作包括固定(4％甲醛，5％蔗糖，PBS)、透化(0.3％Triton X-100在PBS中)、非特異性結合位點的封閉(5％普通山羊血清，0.1％BSA，PBS)並用初級和二級抗體依次孵育以檢測神經元。針對蛋白質基因產物9.5(PGP9.5，Chemicon)的兔多克隆抗體，其為確立的神經元表型標記，被用作初級抗體。Alexa Fluor 488山羊抗-兔(MolecularProbes)被用作二級試劑連同核染料Hoechst 33342(MolecularProbes)來標記在培養液中存在的全部細胞的細胞核。在Discovery-1/Genll圖像儀(Universal Imaging Corporation)執行圖像獲取和圖像分析。在Alexa Fluor 488和Hoechst 33342的兩個波長自動獲取圖像，使用核著色作為參考點，因為其存在於所有孔中，用於基於圖像的圖像儀的自動聚焦體系。選擇每個孔的合適目標和數個成像位點覆蓋各個孔的整個表面。基於用抗-PGP9.5抗體的特異性染色，建立自動圖像分析來計算在培養48小時後各個孔中存在的神經元的數目。圖像的精確閾值和形態學的應用和基於螢光強度的選擇性濾波器得到每孔精確的神經元數值。對於各個推定的TrkB激動劑抗體測定EC50(在以下表1和圖8中顯示)，並與天然配體的EC50進行比較。
下列表格顯示定義的五個抗-TrkB抗體和其對小鼠神經元存活的活性和對人TrkB的磷酸化活性 表1五個抗-TrkB抗體對神經元存活和磷酸化的影響 將抗-TrkB激動劑抗體對小鼠顱內注射雄性C57B6退役種鼠(8-12個月齡)獲自Charles River實驗室(Hollister facility)並使其適應控制了溫度/溼度的環境，12個小時的日/夜循環，在注射前自由進食和水至少5天。用異氟烷麻醉各個小鼠，以修剪顱上方的毛髮切片。將小鼠固定在立體定位的外科裝置(Kopf model 900)，麻醉並用設置於培養基的電熱墊保溫。將聚烯吡酮磺擦於頭蓋骨的切刮部分來滅菌該區域。在顱上製備約1cm長的小的中線經度切割，恰好在耳後開始向著眼睛。揭下頭蓋骨，並用棉籤清潔頭蓋骨表面約1cm直徑的圓形空間以除去任何結締組織。用棉籤沾30％過氧化氫來清潔表面，以暴露前囟點。使用鑽頭作為探針測量頭蓋骨深度，水平和垂直調節顱骨以確定其在鑽孔前是水平的。深度的偏差(在前囟點調零)，從0.5mm近中相對0.5mm側向，以及0.5mm向前相對0.5mm向後，被最小化在±0.05mm的差異範圍內。根據小鼠腦圖(Franklin，K.B.J.& Paxinos，G.，The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates.Academic Press，San Diego，1997)，對單個的、側向的、下丘腦內注射的坐標如下從前囟點向後1.30mm；從正中線-0.5mm；深度，從頭蓋骨(在前囟點)表面5.70mm。通過頭蓋骨鑽小孔，避免接觸腦。將鑽用連接於漢密爾頓氏注射器(84851型)的斜尖的26號注射針代替，並返回至相同的坐標。在2分鐘過程中以量遞增的方式將2μl的化合物注射進外側下丘腦。注射後將針頭保留在這一位置30秒，然後抬起1mm。另一30秒之後，再抬起該針頭1mm。30秒之後，完全移去該針頭。然後閉合該切口，並用2-9mm傷口夾(Autoclip，Braintree Scientific，Inc.)保持在一起。在第0天執行該注射。每天監測體重和食物攝取直至第15天。
如在表1(以上)所示，以特定劑量的抗體38B8和36D1的顱內注射顯著降低小鼠的體重和食物攝取。以特定劑量給出的對照IgG抗體和23B8，不顯著影響食物攝取或體重。產生抗體38B8的鼠雜交瘤系在2007年11月21號被保藏在美國典型培養物保藏中心，10801University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，並被指定ATCC保藏號PTA-8766。
實施例2TrkB激動劑的鑑定 可以使用本領域承認的方法(包括下列一個或多個方法)鑑定TrkB激動劑(例如抗體)。例如，可以使用在美國專利5,766,863和5,891,650中描述的激酶受體激活(KIRA)測定。這一ELISA-類型測定適合定性或定量的測量激酶活性，通過測量受體蛋白酪氨酸激酶(rPTK，例如Trk受體)的自身磷酸化，以及適合鑑定和表徵可能的激動劑或選擇的rPTK的拮抗劑。測定的第一階段涉及激酶受體(在情況下是TrkB受體)的激酶結構域的磷酸化，其中該受體存在於真核細胞的細胞膜中。該受體可以是內源性受體或編碼所述受體的核酸或受體構建體，可以被轉化進入細胞。通常，用這類細胞基本均一群(通常是哺乳動物細胞系)包被第一固相(例如，第一測定平板的孔)，從而細胞附著於固相。通常，該細胞是粘附細胞，並由此天然粘著於第一固相。如果使用「受體構建體」，其通常包含激酶受體和flag多肽的融合。該flag多肽在ELISA部分的測定中被捕獲劑(通常是捕獲抗體)識別。然後將分析物(例如候選的激動劑)加入具有粘著細胞的孔，從而酪氨酸激酶受體(例如，TrkB受體)被暴露於(或接觸)所述分析物。這一測定使能夠鑑定目標酪氨基激酶受體(例如，TrkB)的激動劑配體。暴露於分析物之後，使用裂解緩衝液(其中具有增溶的去汙劑)溶解附著細胞，並溫和振蕩，由此釋放細胞裂解物，可將其直接用於測定的ELISA部分，而無需濃縮或澄清細胞裂解物。
由此製備的細胞裂解物即可接著用於測定的ELISA階段。在ELISA階段的第一步驟，用捕獲劑(通常是捕獲抗體)包被第二固相(通常是ELISA微孔板的孔)，所述捕獲抗體特異性結合於酪氨酸激酶受體，或在是受體構建體的情況下，結合於flag多肽。進行第二固相的包被，從而該捕獲劑附著於第二固相。該捕獲劑通常是單克隆抗體，但是，如在本實施例中所描述，也可以使用多克隆抗體或其它製劑。然後將獲得的細胞裂解物暴露於或接觸附著的捕獲劑，從而該受體或受體構建體附著於(或被捕獲在)第二固相。然後進行清洗步驟，以除去未結合的細胞裂解物，留下捕獲受體或受體構建體。然後，將附著的或捕獲的受體或受體構建體暴露於或接觸抗-磷酸酪氨酸抗體，其鑑定在酪氨酸激酶受體中的磷酸化的酪氨酸殘基。在優選的實施方案中，將抗-磷酸酪氨酸抗體綴合(直接或間接的)於催化非放射顯色劑的顏色改變的酶。因此，可以通過接下來的試劑顏色改變測量受體的磷酸化。該酶可以被直接結合於抗-磷酸酪氨酸抗體，或綴合分子(例如，生物素)可以綴合於抗-磷酸酪氨酸抗體，接著該酶可以經由綴合分子結合於抗-磷酸酪氨酸抗體。最後，例如，通過在顯色劑中的顏色改變測量抗-磷酸酪氨酸抗體與捕獲受體或受體構建體的結合。
在最初的鑑定之後，進一步通過已知的測定靶標生物活性的生物測定證實和提煉候選物(例如，抗-TrkB單克隆抗體)的激動劑活性。例如，可以在PC12神經突增生測定中使用用全長TrkB轉染的PC12細胞測定候選物激動TrkB的能力(Jian等人，Cell Signal.8365-70，1996)。這一測定通過大鼠嗜鉻細胞瘤細胞(PC12)對合適配體刺激的應答測量神經突進程的增生。這些細胞表達內源性TrkA，並因此應答NGF。然而，它們不表達內源性TrkB，並因此用TrkB表達構建體轉染以引起對TrkB激動劑的應答。在將轉染的細胞與候選物孵育之後，測量神經突增生，並計數例如，具有超過細胞直徑2倍的神經突的細胞。在經轉染的PC12細胞中刺激神經突增生的候選物(例如，抗-TrkB抗體)證明TrkB激動劑活性。
也可以在胚胎發育的特異性階段通過使用多個特異性神經元測定TrkB的激活。合適選擇的神經元的存活可以依賴於TrkB激活，並因此隨著下列這些神經元在體外的存活測定TrkB的激活是可能的。如果候選物激活TrkB，向合適的神經元的初級培養物加入候選物將導致這些神經元的至少數天期間的存活。這使能夠確定候選物(例如，抗-TrkB抗體)激活TrkB的能力。在這一類型測定的一個例子中，從E15小鼠胚胎分裂、解離結狀神經節，並將產生的神經元以低密度平板接種在組織培養皿中。然後將候選物抗體加入培養液，並將平板孵育24-48小時。這一時間之後，通過多種方法中的任一方法評估神經元的存活。與接受對照抗體的樣品相比，接受激動劑的樣品通常呈現增加的存活率，且這使可確定激動劑的存在。見，例如，Buchman等人(1993)Development 118(3)989-1001。
可以在表達TrkB的多種細胞類型通過其激活下遊信號轉導的能力鑑定TrkB激動劑，所述細胞是天然的或在轉染編碼TrkB的DNA之後表達TrkB。這一TrkB可以是人或其它哺乳動物(例如嚙齒類或靈長類)的TrkB。可以通過改變表達TrkB的細胞的多個生物化學或生理的參數，例如蛋白質表達水平或蛋白質的蛋白磷酸化水平，或改變細胞的代謝或生長狀態(包括本文所述的神經元存活和/或神經突增生)來檢測下遊信號級聯。檢測相關生物化學或生理參數的方法是本領域公知的。
實施例3測定抗體結合親和力 可以通過測量抗體單功能Fab片段的結合親和力進行確定抗體對TrkB的結合親和力。為了獲得單功能的Fab片段，可以用木瓜蛋白酶切割抗體(例如，IgG)或重組表達。抗體的抗-TrkB Fab片段的親和力可以通過表面等離激元測定(BIAcore3000表面等離激元(SPR)系統，BIAcore，INC，Piscaway NJ)。根據供應商的說明書，可以使用N-乙基-N′-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)激活CM5晶片。人TrkB-Fc融合蛋白(″hTrkB″)(或任何其它的TrkB，例如大鼠TrkB)可以被稀釋在10mM乙酸鈉pH 5.0，並以0.0005mg/ml的濃度注射於激活的晶片。在個體晶片通道使用變速流時間，可以獲得兩個範圍的抗原密度用於詳細動力學研究的200-400應答單位(RU)和用於篩選測定的500-1000RU。用乙醇胺封閉所述晶片。再生研究已經顯示，Pierce洗脫緩衝液(產品號21004，Pierce Biotechnology，Rockford，IL)和4M NaCI(2∶1)的混合物可有效除去結合的Fab，的混合物時保留在晶片上的hTrkB的活性。使用HBS-EP緩衝液(0.01M HEPES，pH 7.4，0.15NaCl，3mM EDTA，0.005％表面活性劑P29)作為BIAcore測定的電泳緩衝液。將純化的Fab樣品的系列稀釋液(0.1-10x估計的K0)以100μl/min注射1分鐘，並解離至2小時。使用已知濃度(通過胺基酸分析測定)的Fab作為標準物通過ELISA和/或SDS-PAGE電泳測定Fab蛋白質的濃度。使用BIAevaluation程序，通過將數據擬合至1∶1的Langmuir結合模式，同時獲得動力學結合速率(kon)和解離速率(koff)(通常在25℃測量)(Karlsson，R.Roos，H.Fagerstam，L.Petersson，B.(1994)。Methods Enzymology 699-110)。以Koff/kon計算平衡解離常數(KD)值。
實施例4配體/受體相互作用的動力學分析，通過Biacore測量 一般方法 使用裝備CM5感應晶片的Biacore 3000儀器(Biacore AB，Uppsala，Sweden)在25℃執行相互作用分析。HBS-EP電泳緩衝液(用於固定受體)是與胺-偶聯試劑(NHS、EDC、乙酸鹽pH 4.5和乙醇胺)一起購自Biacore。Fc-融合的重組人受體(TrkA、TrkB、TrkC和P75)和天然配體(NGF、BDNF、NT4/5和NT3)是購自R&D sytems或自己製備。
受體的固定 在低水平(通常500RU或4fmol/mm2)將受體(每個晶片3個)固定在CM5感應晶片，留下一個未修飾的流動細胞(每個晶片)作為參考表面。在HBS-EP電泳緩衝液中以5μl/min使用標準胺偶聯的操作方案並包括三個步驟。簡而言之，這包括三個步驟。首先，使用在50mM NHS中200mM EDC的新鮮製備混合物注射7分鐘來激活流動細胞；這一步驟將晶片的羧酸基團轉化為活性酯。接下來，在pH 4.5在10mM乙酸鈉緩衝液中將受體稀釋至～10μg/mL，並偶聯於晶片直到達到期望的水平。最後，用1M乙醇胺鹽酸鈉(pH 8.5)注射7分鐘封閉多餘的活性酯。
配體分析 在電泳緩衝液(10mM Hepes(pH 7.4)，150mM(NH4)2SO4，1.5mM CaCl2，1mM EGTA和0.005％(v/v)吐溫-20)中將配體(NGF、BDNF、NT4/5和NT3)以5倍的梯度稀釋至濃度跨度0.08-250nM。將抗體200.38B8(38B8)的Fab片段以3倍梯度稀釋至從0.7-480nM。將樣品以100μl/min注射30秒使解離時間達10分鐘。在各個結合周期之後，用溫和的酸性混合物(10mM甘氨酸-HCl(pH 4.0)、500mM NaCl和20mM EDTA)再生受體表面。重複注射證實該測定是可重現的。通過全面擬合結合數據為物質運輸模型來測定動力學速率常數(kon和koff)，並由其速率計算結合親和力，KD＝koff/kon。
結果 在操作盤中的多數配體/受體相互作用表徵為速率上的快速、限制性擴散，其在Biacore(kon～1x107 1/Ms)的解析度之上。顯著的例外是ProNGF，其通常表示為慢的速率。解離速率(off rate)是更加可變的，例如，ProNGF或成熟NGF與TrkA的相互作用具有非常慢的解離速率(T1/2＞1小時)，而NT3/TrkA相互作用在數秒內衰變(T1/2＝9秒)。38B8-Fab/TrkB相互作用具有雙相解離速率，所以僅衰變初期被擬合至模型。將受體以低水平包被在晶片上，從而將其空間分開足夠遠(平均而言)這樣二聚化配體不能夠在鄰近受體分子之間分子間順式-橋連。由於空間位阻，在融合了Fc的受體分子的兩臂之間二聚體配體不可能分子內的橋連。通過促進其中迫使配體經由其兩個可用結合位點中的僅一個而結合的條件，我們將親和力問題最小化併合理地將我們的數據擬合為簡單的1∶1結合模型。
表2總體動力學分析(將結合根據親合力由高到低進行排序) 注 1.對於在兩個獨立試驗中分析的那些相互作用給出″平均值±StDev″(即，標準偏差) 2.以斜體顯示的結合速率表明在Biacore(＞1e7 1/Ms)的解析度的非常迅速的解離速率，因為它們接近擴散極限。我們使用此作為甄別值(cut-off value)，其意指全部KD僅可被引用作為限制。
3.NB＝對於某些配體/受體配對沒有檢測到結合(與來自文獻的公知的特異性一致)。
實施例5直接施用TrkB激動劑降低動物中的發病率 在為支持本發明而執行的試驗中，直接施用TrkB激動劑顯示降低患有CNS特異性自身免疫疾病的動物中的發病率和CNS組織損害(圖1A和1B)。如在美國專利申請公開2005/0209148中所述產生天然存在的TrkB激動劑NT4的重組形式並在MOG誘導(第0天)之後施用於C57BL/6雌性小鼠。
在MOG誘導後的前10天向動物每日施用NT4(10mg/kg，n＝8)，(圖1A)。向對照動物施用媒質(n＝8)。
動物的發病率被計分如下1＝無力尾；2＝中度後肢虛弱；3＝適度的嚴重後肢虛弱(動物仍然能夠艱難行走)；4＝嚴重後肢虛弱(動物可以移動其後肢但是不能行走)；5＝完全的後肢癱瘓；和6＝死亡。與對照動物相比，用NT4治療的動物顯示顯著減少發病率。這一結果證明TrkB激動劑可有效減緩慢性EAE的進展。
圖1B顯示在MOG誘導後的不同時期用NT4每日治療的動物的發病率。用對照IgG(n＝9)、從3天至9天用NT4(n＝8)或從9天至15天用NT4(n＝8)治療動物。兩個施用方案對於減少動物發病率均有效。當早期施用時(即，早期的「脈衝治療」)由NT4提供的保護是比當晚期施用時至少同樣好(即便為了治療有效布不是更好)。這些結果表明，用TrkB激動劑治療不必持續至症狀發作的時間。TrkB激活可以是在EAE誘導中相對上遊的靶向步驟。
實施例6鑑定高度選擇性的TrkB激動劑抗體 在實施例1-4中描述了導致鑑定TrkB激動劑抗體的試驗和觀察。進一步表徵抗體之一，抗體38B8顯示，儘管標稱結合於TrkA、TrkC或p75，但該抗體對TrkB是高度選擇性的(圖2)。將38B8Fab片段對TrkA、TrkB、TrkC和p75的相對親和力與天然存在的激動劑NGF、BDNF和NT4的親和力比較。在圖2中的各坐標圖是顯示相對結合比時間的圖象。抗體38B8是對TrkB特異性的，並顯示對測定的其它受體酪氨酸激酶沒有顯著的結合。與顯示一些交叉反應性的天然存在的激動劑BDNF和NT4相比，38B8對TrkB是甚至有更高的選擇性的。如預期的，NGF顯示出幾乎不結合TrkB，並優選結合TrkA和p75神經營養蛋白受體。測定38B8的結合親和力是46±10nM。實施例4中提供了這些配體-受體相互作用的動力學分析(包括Kon、Koff和Kd數據)，特別是在表2中。
BDNF和NT4顯示比38B8抗體激動劑對TrkB具有更高的親和力。然而，用該天然存在的配體的二聚體形式和38B8Fab的單體形式執行結合試驗。此外，抗體通常比生長因子具有更長的循環半衰期，使它們甚至當對於其靶標受體具有較低結合親和力時是有效的。使用TrkB激動劑抗體用於進一步研究。
實施例7TrkB激動劑抗體在自身免疫疾病中有效降低發病率 動物試驗顯示與對照免疫球蛋白相比，TrkB激動劑抗體提供顯著的免於EAE發病的保護(圖3)。在MOG誘導之後，在第9和16天施用5mg/kg激動劑抗體(38B8，n＝9)或對照IgG(n＝9)治療小鼠。在MOG誘導後晚至16天和在臨床病徵發作之後施用TrkB激動劑抗體也是有效的(圖4)。較遲的施用，例如，誘導後第18天，減少發病率的效果較差(圖5A)。基於雙因素方差分析(two-way ANOVAanalysis)，在更遲的治療之後臨床病徵的區別不顯著。
在其它動物中，在MOG誘導之後第22天施用格拉默乙酸酯(GA，COPAXONE，TYSABRI)有效降低發病率(圖5B)。這些結果提示TrkB激動劑的作用機制與GA及其它的當前MS藥物的機制不同。
將TrkB激動劑抗體與治療MS的另一當前藥物地塞米松比較。圖6A描述了顯示動物中發病率的圖，所述動物是被施用TrkB激動劑抗體38B8(5mg/kg每周在第9和16天)或在第3-12天每日施用地塞米松(4mg/kg)或乙醇媒質(對照)之後。該結果證明TrkB激動劑的有益效果與免疫抑制劑地塞米松相似。與對照動物相比，經TrkB激動劑治療的動物傾向於喪失體重(圖6B)。
TrkB激動劑抗體的有益效果是劑量依賴性的。圖7A和7B顯示在施用1(n＝8)或5mg/kg(n＝9)38B8或5(n＝10)和10mg/kg(n＝9)38B8之後，動物發病率的區別。該結果證明5mg/kg激動劑抗體比1mg/kg提供更多免於發病的保護(即，較少的發病率)，而與5mg/kg相比，10mg/kg進一步減少發病率。在更高劑量，保護的增加較不顯著，表明施用額外的TrkB激動劑具有邊緣的治療價值。
實施例8TrkB激動劑抗體和NT保護培養的神經元細胞 使用體外的神經元細胞存活測定已經顯示，NT促進神經元存活(Davies，A.，等人(1993)Neuron 11565-74)。使用相似的測定證明TrkB激動劑抗體以與天然存在的TrkB激動劑一致的方式影響神經元細胞(見實施例1)。實際上在對照培養液(即，沒有神經營養因子)中的全部神經元在48小時之內死亡。然而，在BDNF、NT3、NT4或NGF的存在下培養的神經元的60-80％存活48個小時(Id.)。
在支持本發明而執行的試驗中，按照前述，將量增加的TrkB激動劑抗體38B8、23B8、36D1、37D12和19H8(見，例如，實施例1，包括表1)加入神經元培養液(圖8)。有一些變化，加入量增加的TrkB激動劑抗體導致增加的神經元存活(對於38B8在10-100pM範圍內高達75％，而對於19H8在0.1-10pM範圍高達100％)。在神經元存活測定中抗體38B8的EC50值是0.2pM。在神經元存活測定中38B8、23B8、36D1和37D12的EC50值，以及在人KIRA測定中這些抗體的EC50值和它們對動物體重的影響(對TrkB激動劑的識別的應答)在實施例1被討論，並在表1中被總結。注意具有更高的11pM的EC50值的抗體23B8對動物體重不產生影響，表明對於TrkB激動劑生物活性需要低於11pM的EC50值。具有5pM的EC50值的抗體36D1影響動物體重。這些數據與對NT的報導結果一致，證明TrkB激動劑抗體以與天然存在的TrkB激動劑一致的方式影響神經元細胞。
實施例9TrkB激動劑不主要通過免疫抑制起作用 治療MS的當前藥物(包括GA和地塞米松)是免疫調節劑，其顯示免疫抑制和與免疫應答有關的其它影響。為了確定是否TrkB激動劑的治療效果也是在免疫抑制水平，用TrkB激動劑抗體(38B8)或僅媒質(對照)治療動物，並測量不同的同種型(即，IgG1、lgG2a、lgG2b、lgG3和IgM)的循環MOG(髓磷脂)特異性抗體的水平(圖9)。儘管在TrkB激動劑治療之後觀察到MOG-特異性抗體水平的一些變化，似乎不足以解釋動物發病率的顯著減少。儘管不歸於本發明的具體機制，該結果提示TrkB激動劑不是通過抑制抗-MOG抗體的產生而起作用的，因此似乎不如同常規免疫抑制劑起作用。
為了確定是否TrkB激動劑抑制T-細胞和B-細胞被髓磷脂刺激的能力，使用脾細胞增殖測定測量MOG在TrkB激動劑存在下刺激分離的脾細胞的能力。為了比較，在免疫抑制劑地塞米松存在下用MOG刺激脾細胞。將來自MOG誘導的未治療(對照)動物(n＝9)或MOG誘導的經TrkB激動劑抗體(38B8)治療的動物(n＝8)的脾細胞在僅MOG(0)、MOG與TrkB激動劑抗體(38B8；50μl/mg)組合或在兩個不同濃度之一的地塞米松(10-8M和10-5M)的存在下進行體外培養。參考圖10，在Y軸表示脾細胞刺激相對未用MOG體外刺激的脾細胞的不同量。
TrkB激動劑抗體的存在對於脾細胞刺激沒有明顯效果，使用較低濃度的免疫抑制劑地塞米松的情況也是如此。地塞米松在10-5M的更高濃度幹擾MOG刺激。
總體而言，從經TrkB激動劑治療的動物獲得的脾細胞以與經對照治療的動物一致的方式應答MOG刺激，表明用TrkB激動劑治療的動物保留產生正常抗-MOG T-細胞和/或B-細胞應答的能力。此外，從經TrkB激動劑治療的動物和對照動物獲得的脾細胞對於在培養基中TrkB激動劑的存在應答相似。這些觀察進一步提示免疫抑制劑地塞米松和TrkB激動劑的作用機制是不同的，且TrkB激動劑的作用機制在白細胞增殖水平不是主要的。
實施例10TrkB激動劑阻斷炎症細胞侵襲CNS，並減少脫髓鞘 執行組織學分析以更好理解在動物中由TrkB激動劑介導的保護機制。從對照和經TrkB激動劑抗體(38B8)治療的動物製備脊椎切片，和然後用勒克司堅牢藍染色髓磷脂，並用甲酚紫染色細胞體(圖11)。在對照動物中，該染色顯示白細胞侵襲區和相對表達髓磷脂的神經元細胞的背景的細胞破壞。在從用TrkB激動劑治療的動物製備的切片觀察到減少的白細胞侵襲。一些經TrkB激動劑治療的動物顯示實際上沒有CNS白細胞侵襲的跡象。
使用對兩個白細胞標識物特異性的抗體進行侵襲細胞的鑑定，所述白細胞標識物是存在於T-細胞上的CD3和存在於巨噬細胞上的CD68。圖12顯示用CD3抗體染色的結果。多個亮染色的點區域是明顯的，特別是在用甲酚紫深染色的相同區域。從經TrkB激動劑治療的小鼠獲得的脊椎切片顯示顯著弱著色，提示T-細胞侵襲在經治療的動物中大量減少。也用對與單核細胞相關的CD68標識物特異性的抗體染色脊椎切片(圖13)。從對照小鼠製備的切片比來自經TrkB激動劑治療的小鼠的切片染色更強烈，特別是在用甲酚紫和CD3特異性抗體強染色的相同區域。這類觀察表明，與對照動物相比，來自經TrkB激動劑治療的動物的脊椎組織顯示T-細胞和單核細胞侵襲實質性減少。
用勒克司堅牢藍染色脊椎切片測量脫髓鞘。對應於具有重度淋巴細胞侵襲的區域，對照小鼠的腦顯示嚴重脫髓鞘的區域(即，缺少著色，如在圖14中由黑色箭頭指示的)，其在用TrkB激動劑治療的小鼠中不明顯。在來自經TrkB激動劑治療動物的切片中未觀察到嚴重的脫髓鞘和/或神經元死亡的區域。綜上，CNS組織切片的組織化學染色結果證明TrkB激動劑治療降低CNS的淋巴細胞和單核細胞侵襲。
天然存在的和人工的TrkB激動劑在減緩EAE進展中都是有效的。天然存在的激動劑NT4和激動劑抗體對於減慢疾病進程都是有效的。激動劑抗體顯示出對TrkB具有最大選擇性，並被用於進一步研究TrkB激動劑影響EAE進展的機制。當在EAE症狀發作(通常對於這些具體動物是第12或13天)之前和幾天之後施用TrkB激動劑是有效的。在MOG誘導之後施用至16天(或在症狀發作之後約4天)對於減少發病率是有效的。TrkB激動劑的有益效果是劑量依賴性的，減少的發病率與TrkB激動劑的劑量增加相關聯。組織化學試驗顯示TrkB激動劑降低T-細胞和單核細胞對CNS組織的侵入。對髓磷脂的染色顯示在經TrkB激動劑治療的動物中對神經細胞損害降低。
與在測定中測試的其它藥物不同，TrkB激動劑不是主要通過免疫抑制起作用。這是由觀察到的TrkB激動劑不影響M0G特異性自身免疫抗體的產生而證明的。此外，從用TrkB激動劑治療的MOG誘導的動物中分離的脾細胞保留了在體外由MOG刺激的能力。因此，TrkB激動劑以與其它化合物(例如GA和地塞米松)不同的方式起作用。
應該理解的是，這裡所述的實施例和實施方案是僅用於說明目的和暗示本領域技術人員應該考慮到對其的多種修飾或改變和這些修飾或改變被包括在本申請的精神和範圍內。本文引用的全部公開案、專利和專利申請是以其整體通過參考被併入，其引用程度就如同將每一個別公開案、專利或專利申請案特定且個別地以全其整體通過參考方式被併入。
權利要求
1.TrkB激動劑在製備藥物中的用途，所述藥物用於治療影響哺乳動物的中樞神經系統的自身免疫性疾病。
2.權利要求1的用途，其中所述自身免疫性疾病是試驗性自身免疫性腦脊髓炎。
3.權利要求1的用途，其中所述自身免疫性疾病是多發性硬化。
4.權利要求1的用途，其中所述TrkB激動劑是天然存在的TrkB激動劑。
5.權利要求4的用途，其中所述天然存在的TrkB激動劑是NT4。
6.權利要求4的用途，其中所述天然存在的TrkB激動劑是BDNF。
7.權利要求1的用途，其中所述TrkB激動劑是抗體。
8.權利要求7的用途，其中所述TrkB激動劑是抗體片段或其衍生物。
9.由ATCC保藏號PTA-8766進行保藏的雜交瘤系產生的分離的單克隆TrkB激動劑抗體。
10.雜交瘤系，其以ATCC保藏號PTA-8766進行保藏。
全文摘要
本發明提供酪氨酸受體激酶(TrkB)激動劑減少在自身免疫疾病，例如多發性硬化中的中樞神經系統的白細胞侵襲。TrkB激動劑包括天然存在的激動劑，例如NT4和BDNF，以及激動劑例如激動劑抗體。
文檔編號C07K16/18GK101605556SQ200780047255
公開日2009年12月16日 申請日期2007年12月5日 優先權日2006年12月20日
發明者林家揚, 華 龍, D·曹 申請人:瑞納神經科學公司