一種基於熱穩定性內切酶檢測基因突變和snp位點的試劑盒及方法
2023-12-09 01:54:21 1
專利名稱：一種基於熱穩定性內切酶檢測基因突變和snp位點的試劑盒及方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學技術領域，特別涉及一種基於熱穩定性內切酶檢測基因突變和SNP位點的試劑盒和方法。
背景技術：
個體化醫療，就是針對病人的特徵，因病因人用藥，使病人在獲得最大利益的同時使毒副作用減少到最輕。目前，基因突變(點突變、缺失突變、插入突變)和單核苷酸多態性(SNP)在個體化醫療中引起廣泛關注。
肺癌是嚴重危害人民生命和健康的常見病。研究表明表皮生長因子受體(EGFR)基因突變與肺癌病人對抗腫瘤藥物易瑞莎的敏感性有關，其中以19號外顯子內缺失突變以及21號外顯子的點突變L858R最為常見。但當用藥一段時間後，EGFR基因會發生二次突變，導致耐藥產生。EGFR基因耐藥主要突變型為Thr790位點的Thr790Met突變，發生C > T突變。此外，若肺癌患者存在K-ras原發性基因突變，即使存在EGFR基因敏感性突變，對易瑞莎等靶向藥物也會產生耐藥。主要突變型為Glyl2位點的Glyl2Arg、Glyl2Cys、Glyl2Ser、Glyl2Ala、Glyl2Asp、Glyl2Val, Glyl3 位點的 Glyl3Asp、Glyl3Val。因此，在對肺癌患者選擇進行靶向藥物治療或對用藥肺癌患者進行用藥監控時，需對EGFR基因Thr790Met突變和K_ras基因的主要突變型進行檢測，以確認是否用藥有效。此外，K-ras基因突變與大腸癌等腫瘤患者酪氨酸激酶抑制劑等靶向藥物的原發性耐藥有關。K-ras基因突變檢測做為結直腸癌患者進入個體化靶向治療療程之前需要進行的檢測，已經被NCCN(美國癌症綜合網絡)列為《結腸癌臨床治療指南》中必不可少的一項。K-ras基因野生型的患者能從愛必妥(Erbitux,又稱西妥昔單抗/Cetuximab)或維克替比(Vectibix,又稱帕尼單抗/Panitumumab)治療中獲益,而K_ras基因突變的大腸癌患者治療效果較差。美國FDA和歐洲藥監局明確規定了在使用靶向藥物愛必妥和維克替比治療轉移性大腸癌前必須檢測K-ras基因。單核苷酸多態性(SNP)是人類基因組中最常見的遺傳多態性表達形式，SNP在基因組中分布相當廣泛，在人類基因組中每300-1000鹼基對就出現一次，SNP總量大概是3 X IO6個。近年的研究表明，SNP位點與個體表型差異、對藥物或疾病的易感性相關。因此，SNP位點的研究已廣泛用於高危群體的發現、疾病相關基因的鑑定、藥物的設計和測試以及生物學的基礎研究中等。SNP位點的檢測，在個體化醫療中也具有廣泛的應用前景和價值。例如，核苷酸切除修復(NER)和鹼基切除修復(BER)是人體內兩種極為重要的DNA修復途徑，XRCCl和ERCCl基因分別在NER和BER途徑中發揮重要作用。XRCCl中Arg399Gln (CAG — CGG)多態性位於蛋白質重要的結構域內，ERCCl中Asnll8Asn多態性(對應於AAC和AAT的無義突變)能夠影響到ERCCl蛋白的表達水平，這兩個基因的多態性影響到腫瘤細胞對鉬類化療藥物的敏感性。有研究表明XRCCl基因中399位GG基因型患者採用鉬類藥物的療效更佳，而ERCCl基因中118位密碼子CC基因型對鉬類藥物化療反應性較好。因此，可通過對SNP位點的檢測實現個體化用藥指導。目前，DNA測序法仍然是檢測SNP位點和基因突變使用最多的方法，但需要獲取組織、分離細胞、提取核酸和進行測序，所需時間長、費用高，對取材和技術要求都比較嚴格，因此應用於臨床仍受到一定程度的限制。
發明內容
為解決現有技術中存在的技術問題，本發明將熱穩定性內切酶與Taq酶融合在一個反應體系中，通過在實時螢光定量PCR中對野生型基因進行實時 酶切，從而實現對突變基因和SNP位點的檢測，為臨床提供一種簡便、快速、準確和經濟的SNP位點和基因突變分析方法。因此，本發明的一個目的在於提供一種檢測基因突變(包括點突變、缺失突變和插入突變)和SNP位點的試劑盒。本發明的另一個目的在於提供一種檢測基因突變(包括點突變、缺失突變和插入突變)和SNP位點的方法，利用該方法可以提高檢測基因突變的解析度。根據一個方面，本發明提供一種檢測基因突變(包括點突變、缺失突變和插入突變)和SNP位點的試劑盒，其中，所述試劑盒包含酶切野生型基因的熱穩定性內切酶。本發明中，所述試劑盒包含擴增引物，優選地，在所述擴增引物中通過錯配鹼基的方式引入所述熱穩定性內切酶的酶切位點，從而使所述熱穩定性內切酶在PCR反應的同時酶切野生型PCR產物。更具體而言，根據本發明的一個實施方式，提供了一種檢測EGFR基因突變、K-ras基因突變、B-raf基因突變、PI3K基因突變和/或XRCCl基因SNP位點的試劑盒。其中，所述EGFR基因突變選自EGFR基因Thr790Met點突變、Leu858Arg點突變，和EGFR基因 19 號外顯子 2235_2249 區域的 2235_2249 del 15、2236_2250 del 15、2236_2253del 18、2237_2251 del 15、2237_2254 del 18、2239_2247 del 9、2239_2253 del 15、2240_2251 del 12、2240_2254 del 15、2235_2252 > AAT、2237_2250 > T、2238_2248 >GC、2238_2252 > GCA、2239_2248 TTAAGAGAAG > C、2239_2251 > C 等 15 種缺失突變中，所述 K-ras 基因突變選自 K-ras 基因 Glyl2Arg> Glyl2Cys> Glyl2Ser> Glyl2Ala> Glyl2Asp>Glyl2Val、Glyl3Asp 和 Glyl3Val 點突變中，所述 B_raf 基因突變為 B_raf 基因 Val600Glu點突變，所述PI3K基因突變選自PI3K基因Glu542Lys和Glu545Lys點突變中，以及所述XRCCl 基因 SNP 位點為 Arg399Gln。本文中「 > 」前表示缺失區域，「 > 」後鹼基表示在缺失後又在此區域內插入的鹼基。本發明中，所述試劑盒包括以下組分(I)檢測EGFR基因Thr790Met突變的組合體a) Thr790Mix 包括 Thr790 上遊引物(SEQ ID No. I)、Thr790 下遊引物(SEQIDNo. 2)、Thr790 探針(SEQ ID No. 3)；b)熱穩定性內切酶Bstn ;和/或(2)檢測EGFR基因Leu858Arg突變的組合體
a) Leu858Mix 包括 Leu858 上遊引物(SEQ ID No. 4)、Leu858 下遊引物(SEQIDNo. 5)、Leu858 探針(SEQ ID No. 6)；b)熱穩定性內切酶PspGI ;和/或(3)檢測EGFR基因19號外顯子15種缺失突變的組合體a) 19del Mix :包括 19del 上遊引物(SEQ ID No. 7)、19del 下遊引物(SEQ IDNo. 8)、19del 探針(SEQ ID No. 9)；
b)熱穩定性內切酶MwoI ;和/或(4)檢測K-ras基因Glyl2位點突變的組合體a)Glyl2Mix 包括 Gly 12 上遊引物(SEQ ID No. 10)、Gly 12 下遊引物(SEQIDNo. 11)、Gly 12 探針(SEQ ID No. 12)；b)熱穩定性內切酶PspGI和/或(5)檢測K-ras基因Glyl3位點突變的組合體a)Glyl3Mix 包括 Gly 13 上遊引物(SEQ ID No. 13)、Gly 13 下遊引物(SEQIDNo. 14)、Glyl3 探針(SEQ ID No. 15)；b)熱穩定性內切酶PhoI ;和/或(6)檢測B-raf基因Val600Glu突變的組合體a) Val600 Mix :包括 Val600 上遊引物(SEQ ID No. 16)、Val600 下遊引物(SEQIDNo. 17)、Val600 探針(SEQ ID No. 18)；b)熱穩定性內切酶TspRI ;和/或(7)檢測PI3K基因Glu542Lys突變的組合體a)Glu542 Mix :包括 Glu542 上遊引物(SEQ ID No. 19)、Glu542 下遊引物(SEQIDNo. 20)、Glu542 探針(SEQ ID No. 21)；b)熱穩定性內切酶TspRI ;和/或(8)檢測PI3K基因Glu545Lys突變的組合體a)Glu545 Mix :包括 Glu545 上遊引物(SEQ ID No. 22)、Glu545 下遊引物(SEQIDNo. 20)、Glu545 探針(SEQ ID No. 21)；b)熱穩定性內切酶TspRI ;和/或(9)檢測XRCCl基因SNP位點Arg399Gln的組合體a)Arg399 Mix :包括 Arg399 上遊引物(SEQ ID No. 23)、Arg399 下遊引物(SEQIDNo. 24)、Arg399 探針(SEQ ID No. 25)；b)熱穩定性內切酶PspGI。在本發明的一個優選實施方式中，本發明所述的試劑盒包括以下組分(I)檢測EGFR基因Thr790Met突變的組合體a) Thr790 Mix 包括 Thr790 上遊引物(SEQ ID No. I)、Thr790 下遊引物(SEQIDNo. 2)、Thr790 探針(SEQ ID No. 3)、Rox 校正液、純水；b)熱穩定性內切酶Bstn ；c) Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反應緩衝液、dNTP、Mg2+、無菌純水；d)質控標準品人基因組DNA標準品；e)陽性標準品包括人基因組DNA標準品和EGFR基因Thr790Met突變型標準品；和/或(2)檢測EGFR基因Leu858Arg突變的組合體a) Leu858 Mix :包括 Leu858 上遊引物(SEQ ID No. 4)、Leu858 下遊引物(SEQIDNo. 5)、Leu858 探針(SEQ ID No. 6)、Rox 校正液、純水；b)熱穩定性內切酶PspGI ；c) Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反應緩衝液、dNTP、Mg2+、無菌純水；d)質控標準品人基因組DNA標準品；e)陽性標準品包括人基因組DNA標準品和EGFR基因Leu858Arg突變型標準品；和/或
(3)檢測EGFR基因19號外顯子15種缺失突變的組合體a) 19del Mix :包括 19del 上遊引物(SEQ ID No. 7)、19del 下遊引物(SEQ IDNo. 8)、19del 探針(SEQ ID No. 9)、Rox 校正液、純水；b)熱穩定性內切酶MwoI ；c)、Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反應緩衝液、dNTP、Mg2+、無菌純水；d)質控標準品人基因組DNA標準品；e)陽性標準品包括人基因組DNA標準品和EGFR基因2235_2249 del 15突變型標準品；和/或(4)檢測K-ras基因Glyl2位點突變的組合體a) Gly 12 Mix 包括 Gly 12 上遊引物(SEQ ID No. 10)、Gly 12 下遊引物(SEQIDNo. 11)、Gly 12 探針(SEQ ID No. 12)、Rox 校正液、純水;b)熱穩定性內切酶PspGI ；c) Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反應緩衝液、dNTP、Mg2+、無菌純水；d)質控標準品人基因組DNA標準品；e)陽性標準品包括人基因組DNA標準品和K_ras基因Glyl2Arg突變型標準品；和/或(5)檢測K-ras基因Glyl3位點突變的組合體a) Gly 13 Mix 包括 Gly 13 上遊引物(SEQ ID No. 13)、Gly 13 下遊引物(SEQIDNo. 14)、Gly 13 探針(SEQ ID No. 15)、Rox 校正液、純水；b)熱穩定性內切酶PhoI ；c)Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反應緩衝液、dNTP、Mg2+、無菌純水；d)質控標準品人基因組DNA標準品；e)陽性標準品包括人基因組DNA標準品和K_ras基因Glyl3Asp突變型標準品；和/或(6)檢測B-raf基因Val600Glu突變的組合體a) Val600 Mix :包括 Val600 上遊引物(SEQ ID No. 16)、Val600 下遊引物(SEQIDNo. 17)、Val600 探針(SEQ ID No. 18)、Rox 校正液、純水；b)熱穩定性內切酶TspRI ；c) Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反應緩衝液、dNTP、Mg2+、無菌純水；d)質控標準品人基因組DNA標準品；
e)陽性標準品包括人基因組DNA標準品和B_raf基因Val600Glu突變型標準品；和/或(7 )檢測PI3K基因Glu542Lys突變的組合體a)Glu542 Mix :包括 Glu542 上遊引物(SEQ ID No. 19)、Glu542 下遊引物(SEQIDNo. 20)、Glu542 探針(SEQ ID No. 21)、Rox 校正液、純水；b)熱穩定性內切酶TspRI ；c) Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反應緩衝液、dNTP、Mg2+、無菌純水；d)質控標準品人基因組DNA標準品；e)陽性標準品包括人基因組DNA標準品和PI3K基因Glu542Lys突變型標準品；和/或(8)檢測PI3K基因Glu545Lys突變的組合體a)Glu545 Mix :包括 Glu545 上遊引物(SEQ ID No. 22)、Glu545 下遊引物(SEQIDNo. 20)、Glu545 探針(SEQ ID No. 21)、Rox 校正液、純水；b)熱穩定性內切酶TspRI ；c) Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反應緩衝液、dNTP、Mg2+、無菌純水；d)質控標準品人基因組DNA標準品；e)陽性標準品包括人基因組DNA標準品和PI3K基因Glu545Lys突變型標準品；和/或(9)檢測XRCCl基因SNP位點Arg399Gln的組合體a)Arg399 Mix :包括 Arg399 上遊引物(SEQ ID No. 23)、Arg399 下遊引物(SEQIDNo. 24)、Arg399 探針(SEQ ID No. 25)、Rox 校正液、純水；b)熱穩定性內切酶PspGI ；c) Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反應緩衝液、dNTP、Mg2+、無菌純水；d)質控標準品人基因組DNA標準品；e)陽性標準品包括人基因組DNA標準品和K-ras基因Arg399Gln型標準品。在本發明的優選實施方式中，所述組合體中，引物和探針的比例為I : I 5 : 2，優選為5 4。根據另一個方面，本發明提供了一種用於檢測基因突變(包括點突變、缺失突變和插入突變)和SNP位點的方法。本發明的方法的特徵在於，在同一個反應體系中採用熱穩定性內切酶進行邊擴增邊酶切野生型PCR產物的反應。在本發明的方法中，優選地，可以包括在擴增引物中通過錯配鹼基的方式引入一個所述熱穩定性內切酶的酶切位點的步驟。在本發明的方法中，優選地，在使所述熱穩定性內切酶在PCR反應的同時酶切野生型PCR產物的反應中，使用的熱穩定性內切酶在95°C的半衰期為20-120min。更具體而言，根據本發明的一個實施方式，提供了一種檢測EGFR基因突變、K-ras基因突變、B-raf基因突變、PI3K基因突變和/或XRCCl基因SNP位點的方法。其中，所述EGFR基因突變選自EGFR基因Thr790Met點突變、Leu858Arg點突變，EGFR基因 19 號外顯子 2235_2249 區域的 2235_2249 del 15、2236_2250 del 15、2236_2253del 18、2237_2251 del 15、2237_2254 del 18、2239_2247 del 9、2239_2253del 15、2240_2251del 12、2240_2254 del 15、2235_2252 > AAT、2237_2250 > T、2238_2248 > GC、2238_2252 > GCA、2239_2248TTAAGAGAAG > C,22392251 > C 等 15 種缺失突變中，所述 K_ras 基因突變選自 K_ras 基因 Glyl2Arg、Glyl2Cys、Glyl2Ser、Glyl2Ala、Glyl2Asp、Glyl2Val、Glyl3Asp 和 Glyl3Val 點突變中，所述 B_raf 基因突變為 B_raf 基因Val600Glu點突變，所述PI3K基因突變選自PI3K基因Glu542Lys和Glu545Lys點突變中，以及XRCCl基因SNP位點為Arg399Gln。所述方法包括I)製備檢測樣本；2)在一個反應體系中進行邊擴增邊酶切反應，其中，可以在引物中通過錯配鹼基方式引入酶切位點，使野生型的PCR產物可被內切酶酶切，其中①檢測EGFR基因Thr790Met突變的引物和探針的製備EGFR基因Thr790位點在下遊引物3』末端第三個鹼基通過c/A錯配，引入熱穩定性內切酶Bstn酶切位點CGCG，引物及探針序列如下EGFR Thr790 上遊引物:5，-ACGTGTGCCGCCTGCT-3』 (SEQ ID No. I)EGFR Thr790 下遊引物5』 -CCGAAGGGCATGAGCcGC-3』 (SEQ ID No. 2)EGFR Thr790 探針5』 -FAM-CATCTGCCTCACCTCCACCGTGC-BHQ2-3，(SEQ IDNo. 3)；②檢測EGFR基因Leu858Arg突變的引物和探針的製備EGFR基因Leu858位點在上遊引物3』末端第二個鹼基通過c/C錯配，引入熱穩定性內切酶PspGI酶切位點CCWGG (W = A或者T)，引物及探針序列如下EGFR Leu858 上遊引物5』 -GTCAAGATCACAGATTTTGGcC-3』 (SEQ ID No. 4)EGFR Leu858 下遊引物5』 -GGAAAATGCTGGCTGACCTAAAG-3』 (SEQ ID No. 5)EGFR Leu858 探針5， -FAM-TTCTTTCTCTTCCGCACCCAGCAGT-BHQ2-3』 (SEQIDNo.6)；③檢測EGFR基因19號外顯子15種缺失突變的引物和探針的製備EGFR基因19號外顯子的缺失突變，在下遊引物3』末端第三個鹼基通過c/C錯配，弓I入熱穩定性內切酶MwoI酶切位點GCNNNNNNNGC (N = A或者T或者G或者C)，引物及探針序列如下EGFR 19del 上遊引物:5，-GTCATAGGGACTCTGGATCCC-3』 (SEQ ID No. 7)EGFR 19del 下遊引物5，-AITTCCTTGITGGCnTCGcAG-3』 (SEQ ID No. 8)EGFR 19del 探針5』 -FAM-CCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAG-BHQ2-3』 (SEQIDNo. 9)；④檢測K-ras基因Glyl2位點突變的引物和探針的製備K-ras基因Glyl2位點在上遊引物3』末端第三個鹼基通過c/C錯配，引入熱穩定性內切酶PspGI酶切位點CCWGG (W = A或者T)，引物及探針序列如下K-ras Glyl2 上遊引物:5』 -TAAACTTGTGGTAGTTGGAcCT-3，(SEQ ID No. 10)K-ras Glyl2 下遊引物:5』 -TGGTCCTGCACCAGTAATATGC-3，(SEQ ID No. 11)K-ras Glyl2 探針5』 -FAM-AGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCA-BHQ2-3』 (SEQIDNo. 12)；⑤檢測K-ras基因Glyl3位點突變的引物和探針的製備K-ras基因Glyl3位點在下遊引物3』末端第二個鹼基通過g/G錯配,引入熱穩定性內切酶PhoI酶切位點GGCC，引物及探針序列如下K-ras Glyl3 上遊引物5』 -GCCTGCTGAAAATGACTGAA-3』 (SEQ ID No. 13)K-ras Glyl3 下遊引物5，-GTCAAGGCACTCTTGCCTAgG-3』 (SEQ ID No. 14)K-ras Glyl3 探針5， -FAM-TAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGT-BHQ2-3， (SEQIDNo.15)；⑥檢測B-raf基因Val600Glu突 變的引物和探針的製備B-raf基因Val600位點，具有天然的熱穩定性內切酶TspRI酶切位點CASTG (S =C或者G)，無需引入酶切位點，即可直接對PCR產物進行酶切，引物及探針序列如下Val600 上遊引物5，-ACCCACTCCATCGAGATTTC-3』 (SEQ ID No. 16)Val600 下遊引物5』 -AACTCTTCATAATGCTTGCTCTGA-3』 (SEQ ID No. 17)Val600 探針5， -FAM-ACCAAAATCACCTATTTTTACTGTGAGGTC-BHQ2-3， (SEQIDNo. 18)；⑦檢測PI3K基因Glu542Lys突變的引物和探針的製備PI3K基因Glu542位點，在上遊引物3 』末端第三個鹼基通過a/A錯配，弓丨入熱穩定性內切酶TspRI酶切位點CASTG (S = C或者G)，引物及探針序列如下Glu542 上遊引物(引入酶切位點):5，-TTTCTACACGAGATCCTCTCaCT-3』 (SEQIDNo. 19)Glu542 下遊引物5』-GCTGAGATCAGCCAAAITCAGT-3』 (SEQ ID No. 20)Glu542 探針5， -FAM-ATGGAGTCACAGGTAAGTGCTAAAATGGAG-BHQ2-3』 (SEQIDNo. 21)；⑧檢測PI3K基因Glu545Lys突變的引物和探針的製備PI3K基因Glu545位點，具有天然的熱穩定性內切酶TspRI酶切位點CASTG (S = C或者G)，無需引入酶切位點，即可直接對PCR產物進行酶切，引物及探針序列如下Glu545 上遊引物5』-GAGATCCTCTCTCTGAAATCACT-3』 (SEQ ID No. 22)Glu545 下遊引物同 SEQ ID No. 20Glu545 探針同 SEQ ID No. 21 ；⑨檢測XRCCl基因SNP位點Arg399Gln的引物和探針的製備XRCCl基因SNP位點Arg399Gln，在下遊引物3』末端第二個鹼基通過c/A錯配，弓丨入熱穩定性內切酶PspGI酶切位點CCWGG (W = A或者T)，引物及探針序列如下Arg399 上遊引物5』-TTGCCAACACCCCCAAGTAC-3』 (SEQ ID No. 23)Arg399 下遊引物5，-GGCGTGTGAGGCCTTACCcC-3』 (SEQ ID No. 24)Arg399 探針5，-FAM-AGGCCGCATCGTGCGTAAGGAG-BHQ2-3，(SEQ ID No. 25)；以及，使用選自上述製備的引物和探針中的一種或多種分別進行螢光定量PCR反應；3)結果分析。本發明中，所述步驟2)中進一步包括a)試劑配製Thr790內參體系包括Taq Mix、Thr790 Mix、純水；Thr790檢測體系包括TaqMix、Thr790 Mix、熱穩定性內切酶Bstn ；
Leu858內參體系包括Taq Mix、Leu858 Mix、純水；Leu858檢測體系包括的TaqMix、Leu858 Mix、熱穩定性內切酶 PspGI ；19del內參體系:包括Taq Mix、19del Mix、純水；19del檢測體系:包括Taq Mix、19del Mix、熱穩定性內切酶MwoI ；Glyl2內參體系:包括Taq Mix、Glyl2 Mix、純水;Glyl2檢測體系:包括Taq Mix、Glyl2 Mix、熱穩定性內切酶PspGI ；Glyl3內參體系:包括Taq Mix、Glyl3 Mix、純水;Glyl3檢測體系:包括Taq Mix、Glyl3 Mix、熱穩定性內切酶PhoI ；Val600內參體系包括Taq Mix、Val600 Mix、純水；Val600檢測體系包括Taq Mix、Val600 Mix、熱穩定性內切酶TspRI ；Glu545內參體系包括Taq Mix、Glu542 Mix、純水；Glu545檢測體系包括TaqMix、Glu542 Mix、熱穩定性內切酶TspRI ；Glu545內參體系包括Taq Mix、Glu545 Mix、純水；Glu545檢測體系包括TaqMix、Glu545 Mix、熱穩定性內切酶TspRI ；Arg399內參體系包括Taq Mix、Arg399 Mix、純水；Arg399檢測體系包括TaqMix、Arg399 Mix、熱穩定性內切酶PspGI ；b)向a)中的內參體系及檢測體系中，加所述步驟I)中製備的檢測樣本，以及陽性對照標準品和質控標準品；C)、運行程序，Thr790Met 檢測程序95°C 3min ;40 個循環92 °C 15sec，60°C 2min(收集螢光);Leu858Arg 檢測程序為95°C 3min ;40 個循環92°C 15sec,60°C 35sec(收集突光)，75°C 2min ；EGFR基因19號外顯子的缺失突變型檢測程序為95°C 3min ;40個循環92°C15sec,60°C 2min(收集突光)；K-ras Glyl2 位點檢測程序95°C 3min ;40 個循環92°C 15sec，55°C 35sec (收集螢光)，75°C 2min ；K-ras Glyl3 位點檢測程序95°C 3min ;40 個循環92°C 15sec，55°C 35sec (收集螢光)，75°C 2min ；B-raf■基因 Val600 檢測程序為95 °C 3min ;40 個循環92 °C 15sec，60°C35sec (收集螢光)，65°C 2min ；PI3K 基因 Glu542 位點檢測程序為95°C 3min ;40 個循環92 °C 15sec，60°C35sec (收集螢光)，65°C 2min ；PI3K 基因 Glu545 位點檢測程序為95°C 3min ；92°C 15sec，60°C 35sec(收集螢光),65。。2min ；XRCCl 基因 SNP 位點 Arg399Gln 檢測程序為95 °C 3min ；92 °C 15sec，60 °C35sec (收集螢光)，75°C 2min。所述步驟3)中的結果分析具體為a)分析所述陽性對照標準品的內參體系和檢測體系，當內參體系或檢測體系無信號，說明檢測體系無效，應停止分析，更換試劑重新檢測；只有當所述陽性對照標準品的內參體系和檢測體系均有信號，則繼續分析結果；b)在a)的條件下，分析所述質控標準品的內參體系和檢測體系，當檢測體系出現信號，說明熱穩定性內切酶無效或存在汙染，應停止分析，更換試劑重新檢測；只有當所述質控標準品的檢測體系無信號而內參有信號時，則繼續分析結果； c)在a)和b)的條件下，當所述樣本的內參Ct值大於36或無信號，說明提取的DNA樣本濃度過低或存在Taq酶抑制劑，需重新進行DNA提取；d)在a)和b)的條件下，當所述樣本的內參Ct值小於質控標準品Ct值，所述樣本檢測體系有信號時，可能由於提取的DNA超出檢測範圍導致熱穩定性內切酶的酶切不完全而引起的非特異性擴增所致，則需稀釋所述樣本重新檢測；只有當所述樣本檢測體系無信號，判斷為陰性結果；e)在a)和b)的條件下，當所述樣本內參Ct值大於所述質控標準品Ct值並且小於36，所述樣本檢測體系無信號時，則判斷為陰性結果；當所述樣本檢測體系有信號時，則判斷為陽性結果。本發明通過在擴增引物中通過錯配鹼基方式引入一個內切酶酶切位點，在實時螢光定量PCR中對野生型基因進行實時酶切，以使突變型基因得到選擇性擴增從而實現對突變基因和SNP位點的檢測。本方法適用於常見的鹼基變異類型，包括體細胞點突變、缺失突變、插入突變和遺傳性SNP位點分析，從而為臨床提供一種簡便、快速、準確和經濟的基因突變和SNP位點分析方法。
圖I為使用本發明的方法檢測EGFR基因Thr790Met突變的陰性樣本有無高溫內切酶的比較結果的圖。圖2為使用本發明的方法檢測EGFR基因Thr790Met突變的陽性樣本有無高溫內切酶的比較結果的圖。圖3為使用本發明的方法檢測K-ras基因Glyl2Arg突變的陰性樣本有無高溫內切酶的比較結果的圖。圖4為使用本發明的方法檢測K-ras基因Glyl2Arg突變的陽性樣本有無高溫內切酶的比較結果的圖。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步說明，但本發明並不限於以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為本領域常規方法。以下實施例中，熱穩定性限制性內切酶BstUI、PspGI、PhoI、MwoI, TspRI購自英國NEB公司，2XPremix Ex Taq購自Takara公司(此Mix已包括PCR緩衝液、dNTP、Mg2+，均由供應商提供)，所用引物及探針由上海生工合成，Tiangen組織樣本基因組DNA提取試劑盒購自北京天跟生物科技有限公司。2 X Rox校正液購自日本TakaRa公司，人基因組DNA標準品購自美國SIGMA-ALDRICH。EGFR基因Thr79Met突變型標準品、EGFR基因Leu858Arg突變型標準品、EGFR基因2235_2249 del 15突變型標準品、K_ras基因Glyl2Arg突變型標準品、K_ras基因Glyl3Asp突變型標準品、B-raf基因Val600Glu突變型標準品、PI3K基因Glu542Lys突變型標準品、PI3K基因Glu545Lys突變型標準品、K_ras基因Arg399Gln型標準品均購自中國生物製品藥品鑑定所。所用儀器為美國ABI公司ABI7300螢光定量PCR儀。實施例I引物和探針設計引物與探針序列設計I、引物設計 分別設計可擴增一段70-150bp的引物，相關參數為Tm值58. (TC -60. 0°C，GC值40.0% -65. 0%，引物大小20±3bp。並在引物中通過錯配鹼基方式引入酶切位點，使野生型的PCR產物可被內切酶酶切。EGFR基因Thr790位點在下遊引物3』末端第三個鹼基通過c/A錯配，引入熱穩定內切酶Bstn酶切位點CGCG。EGFR基因Leu858位點在上遊引物3』末端第二個鹼基通過c/C錯配，引入熱穩定性內切酶PspGI酶切位點CCWGG (W = A或者T)。EGFR基因19號外顯子22352249區域15種缺失突變，在下遊引物3』末端第三個鹼基通過c/C錯配，引入熱穩定性內切酶MwoI酶切位點GCNNNNNNNGC (N = A或者T或者G或者C)。K-ras Gly 12位點在上遊引物3』末端第三個鹼基通過c/C錯配,引入熱穩定內切酶PspGI酶切位點CCWGG(W = A或者T)。K-ras Glyl3位點在下遊引物3』末端第二個鹼基通過g/G錯配，引入熱穩定內切酶PhoI酶切位點GGCC。B-raf基因Val600位點，具有天然的熱穩定性內切酶TspRI酶切位點CASTG (S = C或者G)，無需引入酶切位點，即可直接對PCR產物進行酶切。PI3K基因Glu542位點，在上遊引物3』末端第三個鹼基通過a/A錯配，引入熱穩定性內切酶TspRI酶切位點CASTG(S = C或者G)。PI3K基因Glu545位點，具有天然的熱穩定性內切酶TspRI酶切位點CASTG (S = C或者G)，無需引入酶切位點，即可直接對PCR產物進行酶切。XRCCl基因SNP位點Arg399Gln，在下遊引物3』末端第二個鹼基通過c/A錯配，引入熱穩定性內切酶PspGI酶切位點CCWGG(W = A或者T)。所設計的引物序列如下EGFR Thr790 上遊引物:5，-ACGTGTGCCGCCTGCT-3』 (SEQ ID No. I)EGFR Thr790 下遊引物(引入酶切位點):5，-CCGAAGGGCATGAGCcGC-3』 (SEQIDNo. 2)EGFR Leu858 上遊引物(引入酶切位點)5』 -GTCAAGATCACAGATTTTGGcC-3J (SEQID No. 4)EGFR Leu858 下遊引物5』 -GGAAAATGCTGGCTGACCTAAAG-3』 (SEQ ID No. 5)EGFR 19del 上遊引物5，-GTCATAGGGACTCTGGATCCC-3』 (SEQ ID No. 7)EGFR 19del 下遊引物(引入酶切位點):5，-AITTCCTTGITGGCnTCGcAG-3，(SEQIDNo. 8)K-ras Glyl2 上遊引物(引入酶切位點)5』-TAAACTTGTGGTAGTTGGAcCT-3』 (SEQID No. 10)K-ras Glyl2 下遊引物:5，-TGGTCCTGCACCAGTAATATGC-3，(SEQ ID No. 11)K-ras Glyl3 上遊引物5』 -GCCTGCTGAAAATGACTGAA-3』 (SEQ ID No. 13)K-ras Glyl3 下遊引物(引入酶切位點)5』-GTCAAGGCACTCTTGCCTAgG-3』 (SEQIDNo. 14)Val600 上遊引物5，-ACCCACTCCATCGAGATTTC-3』 (SEQ ID No. 16)。Val600 下遊引物5』 -AACTCTTCATAATGCTTGCTCTGA-3』 (SEQ ID No. 17)Glu542 上遊引物(引入酶切位點):5，-TTTCTACACGAGATCCTCTCaCT-3』 (SEQIDNo. 19) Glu542 下遊引物5』-GCTGAGATCAGCCAAAITCAGT-3』 (SEQ ID No. 20)Glu545 上遊引物5』-GAGATCCTCTCTCTGAAATCACT-3』 (SEQ ID No. 22)Glu545 下遊引物同 SEQ ID No. 20Arg399 上遊引物5』-TTGCCAACACCCCCAAGTAC-3』 (SEQ ID No. 23)Arg399 下遊引物(引入酶切位點):5』-GGCGTGTGAGGCCTTACCcC-3』 (SEQ IDNo.24)。3、探針設計分別在ARMS引物擴增片段內設計探針，相關參數為Tm值68. (TC -70. 0°C，GC值40. 0% -70. 0%,對探針進行5』端FAM標記，3』端TAMRA標記，其序列如下EGFR Thr790 探針5，-FAM-CATCTGCCTCACCTCCACCGTGC-BHQ2-3，(SEQ IDNo. 3)EGFR Leu858 探針5』 -FAM-TTCTTTCTCTTCCGCACCCAGCAGT-BHQ2-3』 (SEQ IDNo. 6)EGFR 19del 探針5， -FAM-CCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAG-BHQ2-3， (SEQIDN0. 9)K-ras Glyl2 探針5， -FAM-AGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCA-BHQ2-3， (SEQIDNo. 12)。K-ras Glyl3 探針5， -FAM-TAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGT-BHQ2-3， (SEQIDNo.15)。Val600探針5』-FAM-ACCAAAATCACCTATTTTTACTGTGAGGTC-BHQ2_3』 (SEQ IDNo. 18)Glu542探針5』-FAM-ATGGAGTCACAGGTAAGTGCTAAAATGGAG-BHQ2_3』 (SEQ IDNo. 21)Glu545 探針同 SEQ ID No. 21Arg399 探針5』-FAM-AGGCCGCATCGTGCGTAAGGAG-BHQ2-3』 (SEQ ID No. 25)。實施例2利用本方法檢測基因突變和SNP位點本發明的檢測方法是在擴增引物中通過錯配鹼基方式引入一個內切酶酶切位點，在實時螢光定量PCR中對野生型基因進行實時酶切，使突變型基因得到選擇性擴增，從而實現對突變基因和SNP位點的檢測。因此，本發明的突變富集ARMS螢光定量PCR的檢測方法整合了酶切富集PCR技術和ARMS螢光定量PCR技術，即在一個反應體系中對樣品分別進行酶切、PCR富集和ARMS螢光定量PCR鑑定。具體過程為I、樣本製備採用Tiangen組織樣本基因組DNA提取試劑盒提取樣本基因組DNA。2、檢測方法EGFR基因Thr790位點的檢測下遊引物3』末端的第三個鹼基引入c/A錯配後，在60°C經Taq酶PCR擴增後，其產物在野生型Thr790位點產生熱穩定性內切酶BstM酶切位點CGCG，同時Bstn酶在60°C時具有最大酶切活性。因此，在60°C 2min時，Taq酶PCR擴增後，BstUI酶對擴增出的野生型Thr790進行酶切，使其野生型基因不能作為模板進行下一輪PCR指數級擴增；而當Thr790位點發生Thr790Met突變後，PCR產物無Bstn酶的CGCG酶切位點，因此，突變型的Thr790位點可進行PCR指數級擴增，產生螢光信號。EGFR Thr790位點突變檢測體系如表I所示。PCR反應程序為95°C 3min ；92°C 15sec，60°C 2min(收集螢光)，共40個循環。表I
權利要求
1.一種檢測基因突變和SNP位點的試劑盒，其中，所述試劑盒包含酶切野生型基因的熱穩定性內切酶。
2.根據權利要求I所述的試劑盒，其中，所述試劑盒包含擴增引物，在所述擴增引物中通過錯配鹼基的方式引入所述熱穩定性內切酶的酶切位點，從而使所述熱穩定性內切酶在PCR反應的同時酶切野生型PCR產物。
3.—種檢測基因突變和SNP位點的試劑盒，其中，所述基因突變選自EGFR基因突變、K-ras基因突變、B-raf基因突變和PI3K基因突變中，以及所述SNP位點為XRCCl基因SNP位點， 其中，所述EGFR基因突變選自EGFR基因Thr790Met點突變、Leu858Arg點突變，和EGFR基因 19 號外顯子 2235_2249 區域的 2235_2249 del 15、2236_2250 del 15、2236_2253del 18、2237_2251 del 15、2237_2254 del 18、2239_2247 del 9、2239_2253 del 15、2240_2251 del 12、2240_2254 del 15、2235_2252 > AAT、2237_2250 > T、2238_2248 >GC、2238_2252 > GCA、2239_2248TTAAGAGAAG > C、2239_2251 > C 的 15 種缺失突變中，所述 K-ras 基因突變選自 K-ras 基因 Glyl2Arg> Glyl2Cys> Glyl2Ser> Glyl2Ala> Glyl2Asp>Glyl2Val、Glyl3Asp 和 Glyl3Val 點突變中，所述 B_raf 基因突變為 B_raf 基因 Val600Glu點突變，所述PI3K基因突變選自PI3K基因Glu542Lys和Glu545Lys點突變中，以及所述XRCCl 基因 SNP 位點為 Arg399Gln， 其中，所述試劑盒包括以下組分 (1)檢測EGFR基因Thr790Met突變的組合體 a)Thr790 Mix :包括Thr790上遊引物(SEQ ID No. I)、Thr790下遊引物(SEQ IDNo. 2)、Thr790 探針(SEQ ID No. 3)； b)熱穩定性內切酶BstUI;和/或 (2)檢測EGFR基因Leu858Arg突變的組合體 a)Leu858 Mix :包括Leu858上遊引物(SEQ ID No. 4)、Leu858下遊引物(SEQ IDNo. 5)、Leu858 探針(SEQ ID No. 6)； b)熱穩定性內切酶PspGI;和/或 (3)檢測EGFR基因19號外顯子15種缺失突變的組合體a)19del Mix :包括 19del 上遊引物(SEQ ID No. 7)、19del 下遊引物(SEQ ID No. 8),19del 探針(SEQ ID No. 9)； b)熱穩定性內切酶MwoI;和/或 (4)檢測K-ras基因Glyl2位點突變的組合體a)Glyl2Mix :包括 Glyl2 上遊引物(SEQ ID No. 10)、Glyl2 下遊引物(SEQ IDNo. 11)、Glyl2 探針(SEQ ID No. 12)； b)熱穩定性內切酶PspGI和/或 (5)檢測K-ras基因Glyl3位點突變的組合體a)Glyl3Mix :包括 Glyl3 上遊引物(SEQ ID No. 13)、Glyl3 下遊引物(SEQ IDNo. 14)、Glyl3 探針(SEQ ID No. 15)； b)熱穩定性內切酶PhoI;和/或 (6)檢測B-raf基因Val600Glu突變的組合體a)Val600Mix 包括 Val600 上遊引物(SEQ ID No. 16)、Val600 下遊引物(SEQIDNo. 17)、Val600 探針(SEQ ID No. 18)； b)熱穩定性內切酶TspRI;和/或 (7)檢測PI3K基因Glu542Lys突變的組合體 a)Glu542Mix 包括 Glu542 上遊引物(SEQ IDNo. 19)、Glu542 下遊引物(SEQIDNo. 20)、Glu542 探針(SEQ ID No. 21)； b)熱穩定性內切酶TspRI;和/或 (8)檢測PI3K基因Glu545Lys突變的組合體 a)Glu545Mix 包括 Glu545 上遊引物(SEQ ID No. 22)、Glu545 下遊引物(SEQIDNo. 20)、Glu545 探針(SEQ ID No. 21)； b)熱穩定性內切酶TspRI;和/或 (9)檢測XRCCl基因SNP位點Arg399Gln的組合體 a)Arg399Mix 包括 Arg399 上遊引物(SEQ ID No. 23)、Arg399 下遊引物(SEQIDNo. 24)、Arg399 探針(SEQ ID No. 25)； b)熱穩定性內切酶PspGI。
4.根據權利要求3所述的試劑盒，其中，所述試劑盒包括以下組分 (1)檢測EGFR基因Thr790Met突變的組合體 a)Thr790 Mix :包括Thr790上遊引物(SEQ ID No. I)、Thr790下遊引物(SEQ IDNo. 2)、Thr790 探針(SEQ ID No. 3)、Rox 校正液、純水； b)熱穩定性內切酶BstUI； c)Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反應緩衝液、dNTP、Mg2+、無菌純水； d)質控標準品人基因組DNA標準品； e)陽性標準品包括人基因組DNA標準品和EGFR基因Thr790Met突變型標準品；和/或 (2)檢測EGFR基因Leu858Arg突變的組合體 a)Leu858 Mix :包括Leu858上遊引物(SEQ ID No. 4)、Leu858下遊引物(SEQ IDNo. 5),Leu858 探針(SEQ ID No. 6)、Rox 校正液、純水； b)熱穩定性內切酶PspGI； c)Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反應緩衝液、dNTP、Mg2+、無菌純水； d)質控標準品人基因組DNA標準品； e)陽性標準品包括人基因組DNA標準品和EGFR基因Leu858Arg突變型標準品；和/或 (3)檢測EGFR基因19號外顯子15種缺失突變的組合體 a)19del Mix :包括 19del 上遊引物(SEQ ID No. 7)、19del 下遊引物(SEQ ID No. 8),19del 探針(SEQ ID No. 9)、Rox 校正液、純水； b)熱穩定性內切酶MwoI； c)、TaqMix :包括Taq酶、Taq酶反應緩衝液、dNTP、Mg2+、無菌純水； d)質控標準品人基因組DNA標準品；e)陽性標準品包括人基因組DNA標準品和EGFR基因2235_2249del 15突變型標準品；和/或 (4)檢測K-ras基因Glyl2位點突變的組合體 a)Glyl2Mix :包括 Glyl2 上遊引物(SEQ ID No. 10)、Glyl2 下遊引物(SEQ IDNo. 11)、Gly 12 探針(SEQ ID No. 12)、Rox 校正液、純水； b)熱穩定性內切酶PspGI； c)Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反應緩衝液、dNTP、Mg2+、無菌純水； d)質控標準品人基因組DNA標準品； e)陽性標準品包括人基因組DNA標準品和K-ras基因Glyl2Arg突變型標準品；和/或 (5)檢測K-ras基因Glyl3位點突變的組合體 a)Glyl3Mix :包括 Glyl3 上遊引物(SEQ ID No. 13)、Glyl3 下遊引物(SEQ IDNo. 14)、Gly 13 探針(SEQ ID No. 15)、Rox 校正液、純水； b)熱穩定性內切酶PhoI； c)Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反應緩衝液、dNTP、Mg2+、無菌純水； d)質控標準品人基因組DNA標準品； e)陽性標準品包括人基因組DNA標準品和K-ras基因Glyl3Asp突變型標準品；和/或 (6)檢測B-raf基因Val600Glu突變的組合體 a)Val600 Mix 包括 Val600 上遊引物(SEQ ID No. 16)、Val600 下遊引物(SEQIDNo. 17)、Val600 探針(SEQ ID No. 18)、Rox 校正液、純水； b)熱穩定性內切酶TspRI； c)Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反應緩衝液、dNTP、Mg2+、無菌純水； d)質控標準品人基因組DNA標準品； e)陽性標準品包括人基因組DNA標準品和B-raf基因Val600Glu突變型標準品；和/或 (7)檢測PI3K基因Glu542Lys突變的組合體 a)Glu542Mix 包括 Glu542 上遊引物(SEQ IDNo. 19)、Glu542 下遊引物(SEQIDNo. 20)、Glu542 探針(SEQ ID No. 21)、Rox 校正液、純水； b)熱穩定性內切酶TspRI； c)Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反應緩衝液、dNTP、Mg2+、無菌純水； d)質控標準品人基因組DNA標準品； e)陽性標準品包括人基因組DNA標準品和PI3K基因Glu542Lys突變型標準品；和/或 (8)檢測PI3K基因Glu545Lys突變的組合體 a)Glu545Mix 包括 Glu545 上遊引物(SEQ ID No. 22)、Glu545 下遊引物(SEQIDNo. 20)、Glu545 探針(SEQ ID No. 21)、Rox 校正液、純水； b)熱穩定性內切酶TspRI； c)Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反應緩衝液、dNTP、Mg2+、無菌純水； d)質控標準品人基因組DNA標準品；e)陽性標準品包括人基因組DNA標準品和PI3K基因Glu545Lys突變型標準品；和/或 (9)檢測XRCCl基因SNP位點Arg399Gln的組合體 a)Arg399Mix 包括 Arg399 上遊引物(SEQ ID No. 23)、Arg399 下遊引物(SEQIDNo. 24)、Arg399 探針(SEQ ID No. 25)、Rox 校正液、純水； b)熱穩定性內切酶PspGI； c)Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反應緩衝液、dNTP、Mg2+、無菌純水； d)質控標準品人基因組DNA標準品； e)陽性標準品包括人基因組DNA標準品和K-ras基因Arg399Gln型標準品。
5.根據權利要求3或4所述的試劑盒，其特徵在於，所述組合體中，引物和探針的比例為I : I 5 2，優選為5 4。
6.一種檢測基因突變和SNP位點的方法，其特徵在於，在一個反應體系中採用熱穩定性內切酶在PCR反應的同時進行酶切野生型PCR產物的反應。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述方法包括在擴增引物中通過錯配鹼基的方式引入所述熱穩定性內切酶的酶切位點。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述熱穩定性內切酶在95°C的半衰期為20_120min。
9.根據權利要求6所述的方法，其中，所述基因突變選自EGFR基因突變、K-ras基因突變、B-raf基因突變和PI3K基因突變中，以及所述SNP位點為XRCCl基因SNP位點， 其中，所述EGFR基因突變選自EGFR基因Thr790Met點突變、Leu858Arg點突變，和EGFR基因 19 號外顯子 2235_2249 區域的 2235_2249 del 15、2236_2250 del 15、2236_2253 del18、2237_2251 del 15、2237_2254 del 18、2239_2247del 9、2239_2253 del 15、2240_2251del 12、2240_2254 del 15、2235_2252 > AAT、2237_2250 > T、2238_2248 > GC、2238_2252> GCA、2239_2248TTAAGAGAAG > C、2239_2251 > C 的 15 種缺失突變中，所述 K_ras 基因突變選自 K-ras 基因 Glyl2Arg、Glyl2Cys、Glyl2Ser、Glyl2Ala、Glyl2Asp、Glyl2Val、Glyl3Asp和Glyl3Val點突變中，所述B_raf基因突變為B_raf基因Val600Glu點突變，所述PI3K基因突變選自PI3K基因Glu542Lys和Glu545Lys點突變中，以及所述XRCCl基因SNP 位點為 Arg399Gln， 所述方法進ー步包括以下步驟 1)製備檢測樣本； 2)在一個反應體系中進行邊擴增邊酶切反應，其中，在引物中通過錯配鹼基方式引入酶切位點，使野生型的PCR產物被內切酶酶切，其中 ①檢測EGFR基因Thr790Met突變的引物和探針的製備 EGFR基因Thr790位點在下遊引物3』末端第三個鹼基通過c/A錯配，引入熱穩定性內切酶Bstn酶切位點CGCG，引物及探針序列如下EGFR Thr790 上遊引物:5，-ACGTGTGCCGCCTGCT-3』 (SEQ ID No. I)EGFR Thr790 下遊引物5』 -CCGAAGGGCATGAGCcGC-3 』 (SEQ ID No. 2)EGFR Thr790 探針5，-FAM-CATCTGCCTCACCTCCACCGTGC-BHQ2-3，(SEQ IDNo. 3)； ②檢測EGFR基因Leu858Arg突變的引物和探針的製備EGFR基因Leu858位點在上遊引物3』末端第二個鹼基通過c/C錯配，引入熱穩定性內切酶PspGI酶切位點CCWGG，W = A或者T，引物及探針序列如下EGFR Leu858 上遊引物5』 -GTCAAGATCACAGATTTTGGcC_3 』 (SEQ ID No. 4)EGFR Leu858 下遊引物5，-GGAAAATGCTGGCTGACCTAAAG-3 』 (SEQ ID No. 5)EGFR Leu858 探針5，-FAM-TTCTTTCTCTTCCGCACCCAGCAGT-BHQ2-3，(SEQID No. 6)； ③檢測EGFR基因19號外顯子15種缺失突變的引物和探針的製備 EGFR基因19號外顯子的缺失突變，在下遊引物3』末端第三個鹼基通過c/C錯配，引入熱穩定性內切酶MwoI酶切位點GCNNNNNNNGC，N = A、T、G或者C，引物及探針序列如下 EGFR 19del 上遊引物:5，-GTCATAGGGACTCTGGATCCC-3，(SEQ ID No. 7)EGFR 19del 下遊引物5』 -ATTTCCTTGTTGGCTTTCGcAG-3』 (SEQ ID No. 8) EGFR 19del 探針5』 -FAM-CCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAG-BHQ2-3』 (SEQIDNo.9)； ④檢測K-ras基因Glyl2位點突變的引物和探針的製備 K-ras基因Gly 12位點在上遊引物3』末端第三個鹼基通過c/C錯配,引入熱穩定性內切酶PspGI酶切位點CCWGG，W = A或者T，引物及探針序列如下 K-ras Glyl2 上遊引物:5，-TAAACTTGTGGTAGTTGGAcCT-3，(SEQ ID No. 10) K-ras Glyl2 下遊引物:5，-TGGTCCTGCACCAGTAATATGC-3，(SEQ ID No. 11) K-ras Glyl2 探針5， -FAM-AGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCA-BHQ2-3， (SEQ IDNo. 12)； ⑤檢測K-ras基因Glyl3位點突變的引物和探針的製備 K-ras基因Glyl3位點在下遊引物3』末端第二個鹼基通過g/G錯配,引入熱穩定性內切酶PhoI酶切位點GGCC，引物及探針序列如下K-ras Glyl3 上遊引物5，-GCCTGCTGAAAATGACTGAA-3』 (SEQ ID No. 13)K-ras Glyl3 下遊引物5，-GTCAAGGCACTCTTGCCTAgG-3』 (SEQ ID No. 14)K-ras Glyl3 探針5，-FAM-TAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGT-BHQ2-3，(SEQ IDNo. 15)； ⑥檢測B-raf基因Val600Glu突變的引物和探針的製備 B-raf基因Val600位點，具有天然的熱穩定性內切酶TspRI酶切位點CASTG，S = C或者G，無需引入酶切位點，即可直接對PCR產物進行酶切，引物及探針序列如下Val600 上遊引物:5，-ACCCACTCCATCGAGATTTC-3』 (SEQ ID No. 16)Val600 下遊引物5』 -AACTCTTCATAATGCTTGCTCTGA-3』 (SEQ ID No. 17)Val600 探針5』 -FAM-ACCAAAATCACCTATTTTTACTGTGAGGTC-BHQ2-3』 (SEQID No. 18)； ⑦檢測PI3K基因Glu542Lys突變的引物和探針的製備 PI3K基因Glu542位點，在上遊引物3』末端第三個鹼基通過a/A錯配，弓丨入熱穩定性內切酶TspRI酶切位點CASTG，S = C或者G，引物及探針序列如下Glu542 上遊引物:5，-TTTCTACACGAGATCCTCTCaCT-3』 (SEQ ID No. 19)Glu542 下遊引物5』 -GCTGAGATCAGCCAAATTCAGT-3』 (SEQ ID No. 20)Glu542 探針5』-FAM-ATGGAGTCACAGGTAAGTGCTAAAATGGAG-BHQ2-3』 (SEQ ID No. 21)； ⑧檢測PI3K基因Glu545Lys突變的引物和探針的製備 PI3K基因Glu545位點，具有天然的熱穩定性內切酶TspRI酶切位點CASTG，S = C或者G，無需引入酶切位點，即可直接對PCR產物進行酶切，引物及探針序列如下Glu545 上遊引物5』 -GAGATCCTCTCTCTGAAATCACT-3』 (SEQ ID No. 22) Glu545 下遊引物同 SEQ ID No. 20 Glu545 探針同 SEQ ID No. 21 ； ⑨檢測XRCCl基因SNP位點Arg399Gln的引物和探針的製備 XRCCl基因SNP位點Arg399Gln，在下遊引物3』末端第二個鹼基通過c/A錯配，引入熱穩定性內切酶PspGI酶切位點CCWGG，W = A或者T，引物及探針序列如下Arg399 上遊引物5』 -TTGCCAACACCCCCAAGTAC-3』 (SEQ ID No. 23)Arg399 下遊引物5』 -GGCGTGTGAGGCCTTACCcC-3 』 (SEQ ID No. 24)Arg399 探針5』-FAM-AGGCCGCATCGTGCGTAAGGAG-BHQ2-3』 (SEQ ID No. 25)； 以及，使用選自上述製備引物和探針中的一種或多種分別進行螢光定量PCR反應； 3)結果分析。
10.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述步驟2)中進ー步包括 a)試劑配製 Thr790內參體系:包括Taq Mix、Thr790 Mix、純水；Thr790檢測體系:包括Taq Mix、Thr790 Mix、熱穩定性內切酶BstUI ； Leu858內參體系包括Taq Mix、Leu858 Mix、純水；Leu858檢測體系包括Taq Mix、Leu858 Mix、熱穩定性內切酶PspGI ； 19del內參體系:包括Taq Mix、19del Mix、純水；19del檢測體系:包括Taq Mix、19delMix、熱穩定性內切酶MwoI ； Glyl2內參體系:包括Taq Mix、Glyl2 Mix、純水;Glyl2檢測體系:包括Taq Mix、Glyl2Mix、熱穩定性內切酶PspGI ； Glyl3內參體系:包括Taq Mix、Glyl3 Mix、純水;Glyl3檢測體系:包括Taq Mix、Glyl3Mix、熱穩定性內切酶PhoI ； Val600內參體系包括Taq Mix、Val600 Mix、純水；Val600檢測體系包括Taq Mix、Val600 Mix、熱穩定性內切酶TspRI ； Glu545內參體系包括Taq Mix、Glu542 Mix、純水；Glu545檢測體系包括Taq Mix、Glu542 Mix、熱穩定性內切酶TspRI ； Glu545內參體系包括Taq Mix、Glu545 Mix、純水；Glu545檢測體系包括Taq Mix、Glu545 Mix、熱穩定性內切酶TspRI ； Arg399內參體系包括Taq Mix、Arg399 Mix、純水；Arg399檢測體系包括Taq Mix、Arg399 Mix、熱穩定性內切酶PspGI ； b)向a)中的內參體系及檢測體系中，加入所述步驟I)中製備的檢測樣本，以及陽性對照標準品和質控標準品； C)、運行程序， Thr790Met 檢測程序95°C 3min ;40 個循環92°C 15sec，60°C 2min 收集螢光；Leu858Arg 檢測程序為95°C 3min ;40 個循環92°C 15sec，60°C 35sec 收集螢光，.75 °C 2min ； EGFR基因19號外顯子的缺失突變型檢測程序為95°C 3min ;40個循環92°C 15sec，.60 °C 2min收集螢光； K-ras Glyl2 位點檢測程序95°C 3min ;40 個循環92°C 15sec，55°C 35sec 收集螢光，75。。2min ； K-ras Glyl3 位點檢測程序95°C 3min ;40 個循環92°C 15sec，55°C 35sec 收集螢光，75。。2min ； B-raf 基因 Val600 檢測程序為95°C 3min ；40 個循環92°C 15sec，60°C 35sec 收集突光，65。。2min ； PI3K 基因 Glu542 位點檢測程序為95°C 3min ;40 個循環92°C 15sec，60°C 35sec 收集螢光，65°C 2min ；PI3K 基因 Glu545 位點檢測程序為95°C 3min ；92°C 15sec，60°C 35sec 收集螢光，.65 °C 2min ； XRCCl 基因 SNP 位點 Arg399Gln 檢測程序為95°C 3min ；92°C 15sec，60°C 35sec 收集突光，75。。2min。
全文摘要
本發明公開了一種檢測基因突變(包括點突變、缺失突變、插入突變)和SNP位點的方法和試劑盒，該方法將熱穩定性內切酶與Taq酶融合在一個反應體系中，通過在實時螢光定量PCR中對野生型鹼基位點進行實時酶切，從而實現對特異性鹼基位點的檢測。本方法適用於常見的鹼基變異類型，包括體細胞點突變、缺失突變、插入突變和遺傳性SNP位點分析，從而為臨床提供一種簡便、快速、準確和經濟的基因突變和SNP位點分析方法。
文檔編號G01N21/64GK102660641SQ20121011510
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月18日 優先權日2012年4月18日
發明者劉淇, 徐磊, 李雪, 謝飛飛, 趙金銀, 陳唯軍 申請人:北京宏微特斯生物科技有限公司