診斷豬囊蟲病斑點金標免疫滲濾試劑盒其製備及應用方法

2023-12-09 06:36:56

專利名稱：診斷豬囊蟲病斑點金標免疫滲濾試劑盒其製備及應用方法
技術領域：
本發明涉及家畜寄生蟲病的診斷技術領域，尤其涉及用於診斷豬囊蟲病的斑點金標免疫滲濾試劑盒的製備方法及其應用方法。
背景技術：
豬囊蟲病又稱豬囊尾蚴病(cysticercosis cellulosae)，是由豬帶絛蟲幼蟲寄生於人或豬、野豬等中間宿主引起的人獸共患寄生蟲病。人不僅是豬帶絛蟲唯一的終宿主，同時也是其幼絛期適宜寄生的宿主。
該病症狀及危害因寄生部位不同而異。囊尾蚴寄生於腦內，可呈現腦炎症狀或癲癇，眩暈、嘔吐、感覺障礙、癱瘓、大小便瀦留，神經衰弱等症狀；寄生於眼部可誘致失明；寄生於內臟可引起心、肝囊尾蚴病、肺囊尾蚴病、胰囊尾蚴病等；寄生於肌肉或皮下，可引起無力、頭昏、頭痛、記憶力減退、肌肉痙攣及眼花等症狀；囊尾蚴往往混合寄生於皮肌與腦內，危害的表現複雜多樣，嚴重者可危及生命。
豬囊蟲病在世界各地均有發生，尤其在中非、南非、拉丁美洲和東南亞諸國仍是很重要的公共衛生問題。該病在我國南方諸省呈散發，在東北、華北、西北和西南地區感染率較高。例如星文梅等(2005)對青海化隆縣西部地區地調查，豬的囊蟲病的感染率為3.27％～4.92％；民和縣滿坪地區豬的囊蟲病感染率為3.41％～5.43％(郭宏山，2004)。據山東省清華醫院統計，1991～2002年入院治療的絛/囊蟲病例有2824例(李登俊等，2004)。寧夏人群囊蟲感染率為1.28％(王自存等，2005)。湖北襄樊市1976～2003年生豬囊蟲感染率平均為0.23％(許正敏等，2004)。據趙輝元等(1998)調查研究表明，豬的豬囊尾蚴檢出率在10％～20％的流行區，人體豬肉絛蟲的感染率佔農村人口的0.5％～1％，囊尾蚴病人佔農村人口的1.5‰，由此推斷，我國某些地區囊蟲病的危害還是相當嚴重的。
豬絛蟲卵被吞入豬等中間宿主的胃腸道，蟲卵的胚膜為消化液中的蛋白酶所破壞，卵膜在小腸內破裂逸出六鉤蚴，六鉤蚴破膜而出並鑽入腸壁，經血液循環及淋巴液進入到宿主體內各組織。一般豬感染蟲卵後約經60～70天發育為成熟的囊尾蚴，豬囊尾蚴主要寄生於橫紋肌的肌纖維之間，在膈、舌、心、腦、眼、淋巴結、胃壁、食道、肝臟、肺臟和脂肪等臟器和組織中也可見。豬囊尾蚴在豬體內可寄生3～5年。
豬囊蟲病的防治關鍵在於抓好「驅、檢、管」綜合防治措施。目前檢測囊蟲病的方法主要分兩類病原學檢查和免疫學檢測。前者主要包括囊結檢查(眼觀、手摸、解剖鏡觀察)和CT檢查；後者包括皮內試驗、間接血凝試驗、乳膠凝集試驗、卡紅凝集試驗、補體結合試驗、間接螢光抗體試驗、酶聯免疫吸附試驗、改良ELISA、斑點試驗等。囊結檢查在豬囊蟲病比較嚴重流行的地區，該法檢出率約佔囊蟲病豬的20％左右。CT檢查是檢測腦囊尾蚴病的有效手段之一，但儀器價格昂貴，目前僅用於人，且診斷結果中尚有14.17％的患者不能檢出。免疫學檢測方法具有較高的檢出率，但如果不注意純化抗原，則會出現交叉反應，而且這些檢測方法條件要求嚴格、操作較繁瑣，有些需要特定的儀器設備，檢測所需的時間較長(20分鐘至數小時)。不能滿足快速檢疫的需要。
因此尋找一種快速、簡便，適用於豬囊蟲病流行病學調查、普查、診斷、流通市場現場檢疫的方法，已成為防疫部門迫切希望解決的問題。
金標免疫滲濾法和金標免疫層析法是近幾年發展起來的一種新的免疫學診斷方法，它是以微孔膜作為載體，用膠體金代替ELISA中的酶標記物，可省去底物反應步驟，陽性反應呈紅色斑點或線條，肉眼清晰可見，操作簡便快速，整個試驗過程在數分鐘內完成，且試劑穩定易長期保存，國內外已將該法用於多種疾病的診斷。
國內利用金標法檢測豬囊蟲病的報導多見於人醫學的試驗。張洪花等(1994)應用金標記豬囊尾蚴囊液抗原為探針，以豬囊尾蚴抗原的McAb為橋聯，建立了非常規斑點免疫金染色法(Dot-IGS)檢測腦囊蟲病患者腦脊液中循環抗原(CAg)的方法，用4G2McAb檢測84例腦囊蟲病腦脊液，CAg陽性率為88.09％，檢測63例其它疾病患者，有2例假陽性。以1F11McAb檢測14例腦囊蟲病人，陽性率為92.86％，檢測其它疾病患者36例，均為陰性。
劉玉冰等(2001)先後以1株豬囊尾蚴囊液抗原McAb滴於硝酸纖維素膜(NC)上，另1株豬囊尾蚴囊液抗原McAb與膠體金結合，建立了檢測腦囊蟲病患者腦脊液(CSF)中CAg的金標免疫滲濾法(DIGFA)，對48例腦囊蟲病患者CSF，26份健康人CSF檢測，陽性檢出率為77.8％～93.75％，陰性符合率為96.15％，對23例非囊蟲病患者CSF檢測，假陽性有1例。
後來，劉玉冰等(2002a，2002b)又以抗豬囊尾蚴囊液抗原4G2McAb製備膠體金探針，將硝酸醋酸混合纖維素膜粘貼在塑料薄片上，其上部緊貼吸水濾紙，在混合纖維素上固定一條豬囊尾蚴囊液抗原線(對照線)和一條單克隆抗體(1F11McAb)線(檢測線)製作成測試條，建立了金標免疫層析法檢測豬囊蟲循環抗原的方法。該方法原理為，將測試條插入待測液中，液體向上滲透，流經McAb線時，待測液中的CAg與其結合成抗原抗體複合物，再加入膠體金標記抗豬囊尾蚴抗原4G2McAb，金標4G2McAb與檢測線上的抗原抗體複合物及對照線上的抗原結合，膠體金顆粒聚集成紅色的線而顯色，用肉眼就可判斷結果，待測液中如無Cag，金標McAb只在對照線上聚集顯色，檢測線不顯色。用該方法檢測腦囊蟲病人CSF和血清各48份，陽性檢出率分別為81.25％和70.83％，檢測健康人CSF和血清各26份，陰性符合率分別為92.31％和90.00％，檢測23份右囊蟲病患者CSF和血清，交叉反應率分別為8.70％和11.32％。檢測包蟲、血吸蟲、華支睪蟲患者血清各10份，交叉率分別為20.00％、10.00％和0。敏感性和特異性與ELISA相近。在另一試驗中應用同樣的膠體金免疫層析法檢測囊蟲病患者血清78份，陽性率為71.79％，其中52例活動型腦囊蟲病人血清的陽性率為80.77％，20份非活動型腦囊蟲病人血清的陽性率為55％，6份單純皮肌型囊蟲病血清的陽性率為50％。檢測40份健康人血清，陰性符合率為87.5％。
袁建華等(2001)在國內外率先開發成功用於囊蟲病診斷的IgG金標層析法診斷試劑盒，該試劑盒由用囊尾蚴囊液可溶性抗原吸附的硝酸纖維素膜和膠體金標記的抗人IgG多克隆抗體及其它試劑組成。採用層析法檢測血清中的抗囊IgG抗體，用於囊蟲病的輔助診斷或流行病學調查。經133例囊蟲病患者血清和131例正常人血清的檢測，陽性率為93.2％，陰性符合率為99.2％，檢測20份包蟲病人血清，交叉反應率為45％，檢測20例其它蠕蟲病人血清，未出現交叉反應。其敏感性、特異性和重複性可與酶標法媲美。操作和觀察時間僅需20分鐘左右。不足之處是價格較高。
唐雨德等(2004)從5株抗囊蟲McAb和1株多抗用於最佳配對的篩選，一株用於標記膠體金，一株用於包被NC膜，以雙抗體夾心ELISA為對照，試驗發現以1A5McAb為金標抗體，以1B6McAb為包被抗體製備金免疫層析法(GICA)試紙條的檢測效果最佳。用此GICA檢測7份囊蟲囊液、48份囊蟲病豬血清，25份非疫區豬血清、21份囊蟲病人血清、8份囊蟲病人腦脊液和36份正常人血清的CAg，結果顯示對囊蟲囊液和囊蟲病豬血清的陽性率為100％，非疫區豬的陰性符合率為100％；囊蟲病人血清和腦脊液陽性符合率達80％，正常人血清全部為陰性。檢測時間5～15分鐘。GICA試紙條37℃保存30天，4℃和室溫下保存105天檢測結果未發生改變。
但在上述文獻報導中均存在以下問題，首先，無論是金標免疫層析法還是金標免疫滲濾法均需製備抗豬囊尾蚴囊液抗原的McAb，抗體生產成本很高，是限制金標免疫診斷技術在家畜豬囊蟲病診斷中應用的主要原因之一。所以至今還沒有在家畜檢疫中得到推廣應用的報導；其次，目前製備膠體金標記的探針工藝，通常先以試管目測法確定抗原或者抗體的用量，為了保證充分包被，避免多餘膠體金與非特異蛋白結合而幹擾檢測結果判斷，一般在此基礎上再增加10％～20％的被包被抗原或抗體的用量，然後又為了去除多餘的游離的抗原或抗體，再採用層析或高速離心等純化處理，這些處理或者對設備條件要求很高，或者處理過程周期長，步驟繁雜，使試劑盒成本增高，不利於產業化開發；再之，採用雙夾心金標免疫滲濾法，一塊反應盒僅能檢測1個人的血樣，其檢測成本高，且效率較低；所以金標免疫法至今還沒有在家畜檢疫中得到推廣應用的報導。

發明內容
本發明目的是，針對上述現有金標免疫法在檢測人體豬囊蟲病方法中所存在的速度不快，操作繁瑣，需要特定儀器或者檢測成本過高等不足，提供一種敏感、特異性強、結果可靠、檢測方便，效率較高的，可用於檢測家畜豬囊蟲病的診斷試劑盒；並提供該試劑盒中豬囊蟲抗原膠體金的簡便、省本、省時的製備方法；以及應用該試劑盒對豬囊蟲病進行簡便、快速、準確的診斷方法。
本發明斑點金標免疫滲濾法以親和層析原理為基礎，採用硝酸纖維素膜為固相載體，以吸附在硝酸纖維素上的豬的待檢血樣為固相，以抗原膠體金結合物為液相，並同時作為探針和指示劑，而建立起來的一種新型的免疫檢測方法。其中膠體金顆粒的表面帶負電荷與囊蟲抗原蛋白分子的正電荷基團因靜電作用形成牢固的結合，同時金顆粒又有高電子密度的特性，當被金顆粒標記的抗原與相應的抗體配體結合，金顆粒在抗體配體位點大量聚集時，便形成肉眼可見的紅色斑點。
本發明的目的是通過下述技術方案予以實現的。
診斷豬囊蟲病斑點金標免疫滲濾試劑盒，包括盒體、內置反應盒、黑色試劑瓶、白色試劑瓶、玻璃毛細管及豬囊蟲病標準陽性血紙或血清、陰性血紙或血清；所述反應盒由盒底、盒蓋組成，盒蓋中央有一直徑0.8cm圓孔，盒底內裝滿吸水墊料、緊貼盒蓋圓孔下方放一層1.3×1.3cm硝酸纖維素膜，緊閉盒蓋與盒底即成反應盒；所述白色試劑瓶內裝有洗滌液；所述黑色試劑瓶內裝有豬囊蟲抗原膠體金。
一種製備所述試劑盒的方法，其中盒體、反應盒、黑色試劑瓶、白色試劑瓶及玻璃毛細管均為常規實驗用品，標準陽性血紙、陰性血紙或標準陽性血清和陰性血清按常規方法製備；所述白色試劑瓶內裝有的洗滌液為pH6.2～6.4，含有0.7％牛血清白蛋白(BSA)的0.01Mol磷酸鹽緩衝液(PBS)溶液，具體由Na2HPO4 0.263-0.376g、KH2PO4 1.109-1.000g、NaCl 6g、KCl 0.2g、蒸餾水1000ml、牛血清白蛋白7g配製而成；
所述黑色試劑瓶內裝有的豬囊蟲抗原膠體金按以下步驟製備而成
(1)膠體金的製備 以1％氯金酸、1％檸檬酸三鈉、1％鞣酸、25mM K2CO3及雙蒸水為原料，先將1％氯金酸與雙蒸水按體積1∶79配成A液；將1％檸檬酸三鈉、1％鞣酸、25mMK2CO3與雙蒸水按體積4∶0.035～0.080∶0.035～0.080∶15.84～15.93配成B液；再將A液、B液在水浴內同時加熱到59～61℃，攪拌A液，快速加入B液，繼續攪拌1分鐘，在10～13分鐘內加熱至沸騰，製成顆粒直徑8～12nm的膠體金，該膠體金液顏色由黑→藍→紫→紅色時即成；
(2)膠體金pH值的調整 將步驟(1)膠體金液用0.25MK2CO3調整pH值為6.8～7.1後備用；
(3)豬囊蟲可溶性抗原的製備與透析 將豬囊蟲包囊(包括囊壁、囊液和頭節)置玻璃研磨器中研磨後，用0.85％NaCl溶液按重量配成5％濃度溶液，置-25℃反覆凍融7次，期間用40KHz、400W超聲波裂解處理5次，每次處理20分鐘，然後在4℃下13000r/min離心60分鐘，吸取上清液即為豬囊蟲可溶性抗原；將該抗原裝入透析袋，用雙蒸水透析去除鹽分後，裝瓶冷凍，備用；
(4)豬囊蟲抗原包被膠體金 將步驟(3)豬囊蟲可溶性抗原0.27～0.30mg，緩慢加入步驟(2)製備的100ml膠體金液中進行包被，攪拌15分鐘後，依次加入10％迭氮鈉500μl、1％牛血清白蛋白100μl，攪勻後在2.5～4.0℃，1500r/min條件下離心30分鐘，吸取紅色上清液，即成囊蟲抗原膠體金，分裝黑色試劑瓶內，冷藏、備用；
一種所述製備方法的的優選方案是，配製膠體金A液配方同上，所述配製膠體金B液的組分與含量為1％檸檬酸三鈉4.0ml、1％鞣酸0.08ml、25mMK2CO30.08ml與雙蒸水15.84ml；製成的膠體金顆粒直徑為10＜D≤11nm；膠體金液pH值調為7.1；膠體金液與豬囊蟲抗原的體積重量比為100ml∶0.30mg。
一種應用所述試劑盒診斷豬囊蟲病的方法，按以下步驟操作
(1)待檢豬乾燥血紙或豬血清的製備 採血5滴/頭，滴在濾紙面上至陰涼乾燥即製成豬血紙；或採豬血3～5ml於乾淨滅菌的試管中，置37℃水浴中30～45min，3000r/min離心30min，吸取上清液即為豬血清，冷凍備用；
(2)血紙浸出液或血清稀釋液的製取 裁取血紙，按每0.24cm2加0.5毫升生理鹽水(0.85％氯化鈉溶液)比例在容器內浸泡，每10分鐘搖動1次，浸泡30分鐘後即成血樣浸出液；或是血清，用生理鹽水(0.85％氯化鈉溶液)稀釋成128倍液；
(3)血樣浸出液或血清稀釋液點樣 用內徑1mm玻璃毛細管吸取上述血樣浸出液或血清稀釋液1μl，點在反應盒圓孔內硝酸纖維素膜面上，每膜可布點1至4份待檢血樣；
(4)滴加洗滌液 點血樣後在室溫下放置40～90秒鐘，滴加100μl洗滌液；
(5)滴加豬囊蟲抗原膠體金 待洗滌液滲入後，再往反應盒膜面滴加100μl豬囊蟲抗原膠體金；
(6)待豬囊蟲抗原膠體金滲入後，再往反應盒膜面上滴加100μl蒸餾水；
(7)觀察並記錄結果 觀察反應盒膜面，若點樣處呈現紅色斑點即為陽性，否則為陰性。
本發明的有益效果
一是本發明診斷豬囊蟲病斑點金標免疫滲濾試劑盒，不需要特殊儀器，僅需按序操作，即可直觀鑑別出血樣豬有否患豬囊蟲病，3分鐘即可檢測20個血樣，比ELISA方法操作簡便，提高檢測效率20倍以上。
二是本發明是在探明了豬囊蟲抗原包被膠體金的最適穩定量及膠體金標記囊蟲抗原最佳pH值的基礎上，將該抗原與膠體金直接結合成抗原膠體金，因無游離的抗原，故結合後不需要濃縮、層析純化或高速離心純化等處理，製作工藝簡單，省工、省時、節省成本，有利於產業化開發，比目前在人醫囊蟲病診斷上所用的雙夾心金標免疫滲濾法或雙抗金標層析法試劑盒(試紙條)降低生產成本50％以上，工效提高20倍以上。
三是該抗原膠體金能檢測出人工感染豬囊蟲病21～28天及其以上的病豬特異抗體，達到了早期診斷的目的(見試驗例2)；與解剖檢蟲法陽性符合率為100％(5/5)，陰性符合率為99.21％(125/126)；與人工感染的血吸蟲、肝片吸蟲、錐蟲、蛔蟲、旋毛蟲病及自然感染的兔豆狀囊尾蚴病之間無交叉反應，具有可用於早期診斷、檢測敏感、特異、檢出率高等特點。
四是診斷試劑在4℃下保存7個月，在室溫下保存3個月，對20份陽性及20份陰性血紙每月檢測一次，每次結果一致，表明該診斷試劑穩定性及重現性均好(見試驗例5)。
五是本發明檢測方法可以用血紙替代常規血清樣品，解決了農村基層製備血清採血量大，並需離心設備進行分離加工，血清的輸送與貯藏還需冷藏等諸多難題；該方法操作簡單，顯色快速，將待檢血紙浸出液1μl點在硝酸纖維素膜上作為固相，一個反應盒最多可點4份血樣而互不幹擾，僅需100μl(2滴)豬囊蟲抗原膠體金作為流動相，其抗原與特異抗體在數秒鐘即能結合，在反應處發生抗原抗體金顆粒聚集，形成肉眼可見的紅色斑點即為陽性，陰性則僅留淡褐黃色或粉紅色背景，該結果判斷容易，並可長期保存，以利於回顧性分析和研究；與現有的診斷豬囊蟲病免疫學方法相比其檢測工效提高20倍以上，顯著降低了生產成本。
六是這種以紅色膠體金標記囊蟲抗原來檢測血樣，可省去酶標法加底物顯色的步驟，不用有潛在致癌性的酶的顯色底物，更加安全。
具體實施例方式
本發明通過以下實施例和試驗例作進一步具體描述。
實施例1(診斷豬囊蟲病斑點金標免疫滲濾試劑盒)
盒體內設置的反應盒為長3cm×寬2.5cm×高0.6cm的塑料小盒，分盒底和盒蓋兩部分，盒蓋頂面中央有一個直徑為0.8cm的小圓孔，盒內墊滿吸水材料，在小圓孔下方和吸水材料上方之間放置一張1.3×1.3cm的硝酸纖維素膜，合緊盒蓋即組成反應盒；在試劑盒體內還包含裝有囊蟲抗原膠體金的黑色試劑瓶和裝有洗滌液的白色試劑瓶、點樣用的玻璃毛細管及豬囊蟲病標準陽性血紙或血清、陰性血紙或血清各4份，用於檢驗試劑盒的有效性；所述黑色試劑瓶、白色試劑瓶，由有彈性的小口塑料瓶體、與之配套的細孔滴嘴和瓶蓋組成，容量為10ml或20ml；玻璃毛細管為常規實驗用品，內徑1mm。
豬囊蟲病標準陽性血紙或血清 經血清學檢查為囊蟲病陽性的豬，再經解剖檢蟲法確認為囊蟲病陽性，始可採血製作標準陽性血紙和標準陽性血清，其製備方法是，採上述陽性豬血5滴/頭，滴在濾紙面上至陰涼乾燥即製成豬血紙；或採陽性豬血3～5ml於乾淨滅菌的試管中，置37℃水浴中30～45min，3000r/min離心30min，吸取上清液即為豬血清，冷凍備用。
陰性血紙或血清 在囊蟲非疫區，經血清學檢查為陰性，並經解剖檢蟲法確證為陰性的豬，始可作為標準陰性血樣；其製備方法同上。
標準陽性和陰性血紙或血清主要用於檢測診斷試劑盒的有效性。在每次試劑盒用於檢測之前，須用標準陽性、陰性血紙的生理鹽水浸出液(0.24cm2/0.5ml)，或者標準陽性和陰性血清的(128倍)稀釋液測試，若陽性血樣出現紅色斑點，陰性血樣為黃色或粉紅色斑點，說明試劑盒有效，否則為失效，不可再用。
實施例2(膠體金的製備方法1)
本發明以1％氯金酸、1％檸檬酸三鈉、1％鞣酸、25mM K2CO3與雙蒸水為原料，採用鞣酸-檸檬酸鈉還原法製備膠體金。檸檬酸鈉主要為還原劑，而鞣酸具有還原和保護的雙重作用，控制「晶核」的形成過程。本例A液，B液各原料組分與含量的配比見表1
表1 A液、B液的配製 (單位ml)
將配製好的A液、B液在水浴內同時加熱到59～61℃，在電磁攪拌器上攪拌A液，快速加入B液，繼續攪拌1分鐘，在10～13分鐘內加熱至沸騰，氯金酸在鞣酸-檸檬酸鈉還原劑的作用下，使金離子還原成金原子，其膠體金液顏色由黑→藍→紫→亮紅色，此時合成的膠體金顆粒約為12～13nm，較穩定，在4℃下可保存10個月。
實施例3(膠體金的製備方法2)
表2 A液、B液的配製 (單位ml)
A液與B液的配製與合成方法同實施例1，製成的膠體金顆粒直徑約12nm。
實施例4(膠體金的製備方法3)
表3 A液、B液的配製 (單位ml)
A液與B液的配製與合成方法同實施例1，製成的膠體金顆粒直徑約10～11nm。
實施例5(豬囊蟲可溶性抗原的製備方法)
將豬囊蟲包囊(包括囊壁、囊液和頭節)置玻璃研磨器中研磨後，用0.85％NaCl溶液按重量比配成5％溶液，置-25℃反覆凍融7次，期間用40KHz、400W超聲波探頭浸入溶液內進行超聲波裂解，每次20分鐘，先後共處理5次，然後在4℃下以13000r/min離心60min，吸取上清液即為豬囊蟲可溶性抗原；將上述可溶性抗原裝入透析袋，用雙蒸水進行透析去除鹽分，即為包被膠體金用的豬囊蟲抗原。
實施例6(豬囊蟲抗原包被膠體金最適穩定量的測定)
豬囊蟲抗原的用量(即豬囊蟲抗原包被膠體金的量)對膠體金的穩定狀態起著決定作用，要求達到在囊蟲抗原膠體金中既沒有游離的未結合的金顆粒，也沒有游離的抗原蛋白質為理想狀態，這樣的膠體金探針狀態穩定，又可簡化離心純化等步驟。
首選採用目測法確定膠體金與待標記囊蟲抗原用量的大致比例，具體做法是分三批次進行，每批次為6支試管，一、二、三批次試管中分別加入實施例2，3，4所制的1ml膠體金，再加入不同量的由實施例5所制抗原，按表4、5、6所示進行。
表4 膠體金與囊蟲可溶性抗原用量比例的測定
表5 膠體金與囊蟲可溶性抗原用量比例的測定
表6 膠體金與囊蟲可溶性抗原用量比例的測定
注未加抗原的膠體金液，在加入NaCl溶液後膠體金液由紅色變成藍色；加入抗原量不足者，由紅色變紫色或紫紅色；加入抗原量達到或超過最低穩定量者，則膠體金液的紅色不變，如表4、5、6中的第5、第5、第6管可作為穩定1ml膠體金液所需的囊蟲可溶性抗原的用量(0.27-0.31μg)。
實施例7(豬囊蟲抗原膠體金的製備方法1)
膠體金pH值的調整膠體金與豬囊蟲抗原的結合在接近等電點的條件下最穩定，因此，在加囊蟲抗原被包膠體金之前，先用0.25M K2CO3調整膠體金酸鹼度至pH 6.8～7.1，以使膠體金與豬囊蟲抗原能夠牢固地結合。
取實施例2所制膠體金液100ml，在電磁攪拌下用0.25M K2CO3調pH值為6.8，然後逐滴加入實施例5所制豬囊蟲可溶性抗原0.27mg，繼續攪拌15分鐘後，依次加入10％迭氮鈉500μl、1％牛血清白蛋白100μl，攪勻後，1500r/min離心30分鐘，吸出上清紅色液體，則為豬囊蟲抗原膠體金產品，按包裝規格10ml/瓶或20ml/瓶分裝於黑色塑料試劑瓶內，置4～8℃保存。
實施例8(豬囊蟲抗原膠體金的製備方法2)
取實施例3所制膠體金液100ml，在電磁攪拌下用0.25M K2CO3將膠體金pH值調至6.9，然後逐滴加入實施例5所制豬囊蟲可溶性抗原0.28mg，其餘步驟同實施例7。
實施例9(豬囊蟲抗原膠體金的製備方法3)
取實施例4所制膠體金液100ml，在電磁攪拌下用0.25M K2CO3將膠體金pH值調至7.1，然後逐滴加入實施例5所制豬囊蟲可溶性抗原0.30mg，其餘步驟同實施例7。
實施例10(洗滌液的配製)
表7 pH6.2洗滌液按以下配方配製(1)
表8 pH6.4洗滌液按以下配方配製(2)
上面四種原料在蒸餾水中溶解，測pH無誤後，再加入7.0gBSA，待完全溶解後按量分裝於10ml或20ml的白色塑料試劑瓶中，保存。
實施例11(豬囊蟲病斑點金免疫滲濾檢測方法)
按以下具體步驟操作
(1)待檢豬乾燥血紙或豬血清的製備 採豬血，滴在新華濾紙條上，於陰涼處乾燥，在室溫陰涼乾燥的條件下可保存半年(若置封口塑膠袋中冷凍或冷藏可保存2-3年以上)備用；採豬血3～5ml於乾淨滅菌的試管中，置37℃水浴中30～45min，3000r/min離心30min，吸取上清液即為豬血清。冷凍備用。
(2)血紙浸出液或血清稀釋液的製取 用打孔器裁取乾燥血紙圓片(0.24cm2)1片，投入已編號的清潔、乾燥試管或青黴素瓶內，加入0.5毫升生理鹽水(0.85％NaCl)浸泡，每隔10分鐘搖動1次，30分鐘後充分搖勻，則成血紙浸出液；如果是血清，則用生理鹽水稀釋成128倍稀釋液；
(3)血樣浸出液或血清稀釋液點樣 用內徑1mm玻璃毛細管吸取血樣浸出液或血清稀釋液1μl，具體操作是將吸取樣液後的玻璃毛細管輕貼硝酸纖維素膜面0.5秒鐘(即約1μl)後，立即向上移走毛細管，若1個血樣，將血樣點在塑料反應盒硝酸纖維素膜中央；若2～4個血樣，則沿距小孔邊緣1mm左右按順時針點樣，並用記號筆在圓孔外四周按順時針編上相應血樣號；要求每個樣品用一根毛細管，以免汙染。
(4)滴加洗滌液 點血樣後在室溫下放置40～90秒鐘，滴加實施例10製備的洗滌液2滴(100μl)；
(5)滴加豬囊蟲抗原膠體金 待洗滌液滲入後，再往反應盒膜面滴加2滴(100μl)實施例7、8或9製備的豬囊蟲抗原膠體金；
(6)待豬囊蟲抗原膠體金滲入後，再往反應盒膜面上滴加2滴(100μl)蒸餾水或自來水；
(7)觀察並記錄結果 觀察反應盒膜面，若點血樣處呈現紅色斑點即為陽性，否則為陰性。
試驗例說明
(1)供試血紙和血清樣品
i人工感染囊蟲病豬21、28、35和42天採血，製備血清及血紙，32份。
ii從河南屠宰場採集的自然感染囊蟲病豬血紙及血清5份。
iii從浙江非疫區採集的126頭豬血紙。
(2)測定試劑，裝置與方法
試劑盒 實施例1；
囊蟲抗原膠體金 按實施例7、8或9製備；
豬囊蟲病斑點金免疫滲濾檢測方法 按實施例11方法；
ELISA檢測豬囊蟲病試劑盒 由浙江省農科院畜牧獸醫研究所提供；
試驗例1(豬囊蟲病不同檢測方法符合率對比試驗)
表9斑點金標免疫滲濾法與ELISA法陽性、陰性符合率對比
注以本發明的斑點金免疫滲濾法與ELISA法分別檢測人工感染囊蟲病豬血紙、血清各32份及自然感染囊蟲病豬血紙、血清各5份，兩者檢測陽性率均相同，陽性符合率為100％；用斑點金免疫滲濾法和ELISA分別檢測非疫區豬陰性血紙、血清各126份，其陽性率依次為0.79％和1.58％，陰性率依次為99.21％和98.42％。血紙與血清陽、陰性符合率為100％。
試驗例2(豬囊蟲病應用不同方法早期診斷效果對比試驗)
表10斑點金標免疫滲濾法和ELISA法對豬囊蟲病早期診斷效果對比
以斑點金標免疫滲濾法和ELISA法檢測人工感染囊蟲病21天、28天的豬血清各8份，兩者陽性檢出符合率完全相同。本發明的斑點金標免疫滲濾法可用於豬囊蟲病的早期診斷。
試驗例3(豬囊蟲病斑點金標免疫滲濾法的特異性試驗)
以本發明豬囊蟲病斑點金標免疫滲濾法試劑盒分別檢測人工感染囊蟲的豬血清、人工感染血吸蟲病豬血清、人工感染肝片吸蟲羊血清、人工感染錐蟲的羊血清、人工感染蛔蟲的豬血清，結果見下表
表11豬囊蟲病斑點金標免疫滲濾法與其它疾病的交叉反應試驗
由上表可見，本發明斑點金標免疫滲濾法僅對豬囊蟲病起反應，囊蟲與血吸蟲、肝片吸蟲、錐蟲、蛔蟲兔豆狀囊尾蚴及旋毛蟲等病之間末見交叉反應現象。
試驗例4(豬囊蟲病斑點金標免疫滲濾法不同人員、批次的重複性試驗)
表12斑點金標免疫滲濾法檢測豬囊蟲病的可重複性檢驗
注肩號1、2、3分別代表使用不同批次製備的囊蟲抗原膠體金。
由3個不同的操作者對32份豬囊蟲病的豬血紙和血清，40份囊蟲陰性的豬血紙和血清進行檢測，結果一致；由相同的操作者用不同批次的豬囊蟲抗原膠體金進行檢測，其結果也相同。說明該檢測方法的重複性良好。
試驗例5(囊蟲抗原膠體金保存期試驗)
表13囊蟲抗原膠體金保存期測定
注豬囊蟲抗原膠體金系按實施例6方法製備。
用在室溫(15～32℃)和冷藏保存的囊蟲抗原膠體金分別對30份陽性及30份陰性血紙每星期檢測一次，二個月後每個月檢測一次，試驗結果豬囊蟲抗原膠體金在4～8℃下可保存7個月仍有效，在室溫下可保存3個月之久。
權利要求
1、診斷豬囊蟲病斑點金標免疫滲濾試劑盒，包括盒體、內置反應盒、黑色試劑瓶、白色試劑瓶、玻璃毛細管及豬囊蟲病標準陽性血紙或血清、陰性血紙或血清，其特徵在於所述反應盒由盒底、盒蓋組成，盒蓋中央有一直徑0.8cm圓孔，盒底內裝滿吸水墊料、緊貼盒蓋圓孔下方放一層1.3×1.3cm硝酸纖維素膜，緊閉盒蓋與盒底即成反應盒；所述白色試劑瓶內裝有洗滌液；所述黑色試劑瓶內裝有豬囊蟲抗原膠體金。
2、一種製備權利要求1所述試劑盒的方法，其中盒體、反應盒、黑色試劑瓶、白色試劑瓶及玻璃毛細管均為常規實驗用品，標準陽性血紙、陰性血紙或標準陽性血清和陰性血清按常規方法製備；其特徵在於所述白色試劑瓶內裝有的洗滌液為pH6.2～6.4，含有0.7％牛血清白蛋白的0.01Mol磷酸鹽緩衝溶液；
所述黑色試劑瓶內裝有的豬囊蟲抗原膠體金按以下步驟製備而成
(1)膠體金的製備 以1％氯金酸、1％檸檬酸三鈉、1％鞣酸、25mMK2CO3及雙蒸水為原料，先將1％氯金酸與雙蒸水按體積1∶79配成A液；將1％檸檬酸三鈉、1％鞣酸、25mMK2CO3與雙蒸水按體積4∶0.035～0.080∶0.035～0.080∶15.84～15.93配成B液；再將A液、B液在水浴內同時加熱到59～61℃，攪拌A液，快速加入B液，繼續攪拌1分鐘，在10～13分鐘內加熱至沸騰，製成顆粒直徑10～13nm的膠體金，該膠體金液顏色由黑→藍→紫→紅色時即成；
(2)膠體金pH值的調整 將步驟(1)膠體金液用0.25MK2CO3調整pH值為6.8～7.1後備用；
(3)豬囊蟲可溶性抗原的製備與透析 將豬囊蟲包囊經研磨後，用0.85％NaCl溶液按重量配成5％濃度溶液，置-25℃反覆凍融7次，期間用40KHz、400W超聲波裂解處理5次，每次處理20分鐘，然後在4℃下，以13000r/min離心60分鐘，吸取上清液即為豬囊蟲可溶性抗原；將該抗原裝入透析袋，用雙蒸水透析去除鹽分後，裝瓶冷凍，備用；
(4)豬囊蟲抗原包被膠體金 將步驟(3)豬囊蟲可溶性抗原0.27～0.30mg，緩慢加入步驟(2)100ml膠體金液中進行包被，攪拌15分鐘後，依次加入10％迭氮鈉500μl、1％牛血清白蛋白100μl，攪勻後在2.5～4.0℃，1500r/min條件下離心30分鐘，吸取紅色上清液，即成囊蟲抗原膠體金，分裝黑色試劑瓶內，冷藏、備用。
3、根據權利要求2所述的製備方法，其特徵在於所述配製膠體金B液的組分與含量為1％檸檬酸三鈉4.0ml、1％鞣酸0.08ml、25mMK2CO30.08ml與雙蒸水15.84ml；製成的膠體金顆粒直徑為10＜D≤11nm；膠體金液pH值調整為7.10；膠體金液與豬囊蟲抗原的體積重量比為100ml∶0.30mg。
4、一種應用權利要求1所述試劑盒診斷豬囊蟲病的方法，其特徵是按以下步驟操作
(1)待檢豬乾燥血紙或豬血清的製備 採血5滴/頭，滴在濾紙面上至陰涼乾燥；或採血3～5ml/頭，經37℃水浴保溫30～45min，3000r/min離心30min，吸取上清液即為血清，冷凍備用；
(2)血紙浸出液或血清稀釋液的製取 裁取血紙，按每0.24cm2加0.5毫升生理鹽水比例在容器內浸泡，每10分鐘搖動1次，浸泡30分鐘後即成血樣浸出液；或將血清，用生理鹽水稀釋成128倍液；
(3)血樣浸出液或血清稀釋液點樣 用內徑1mm玻璃毛細管吸取上述血樣浸出液或血清稀釋液1μl，點在反應盒圓孔內硝酸纖維素膜面上，每膜布點1至4份的待檢血樣；
(4)滴加洗滌液 點血樣後在室溫下放置40～90秒鐘，滴加100μl洗滌液；
(5)滴加豬囊蟲抗原膠體金 待洗滌液滲入後，再往反應盒膜面上滴加100μl豬囊蟲抗原膠體金；
(6)待豬囊蟲抗原膠體金滲入後，再往反應盒膜面上滴加100μl蒸餾水；
(7)觀察並記錄結果 觀察反應盒膜面，若點樣處呈現紅色斑點即為陽性，否則為陰性。
全文摘要
本發明提供了診斷豬囊蟲病斑點金標免疫滲濾試劑盒其製備及應用方法，屬於家畜寄生蟲病的診斷技術領域。本發明以硝酸纖維素膜為固相載體，吸附豬的待檢血樣，以豬囊蟲抗原與膠體金結合物為液相，並同時作為探針和指示劑，當抗原與相應的抗體配體結合，金顆粒在抗體配體位點大量聚集，便形成肉眼可見的紅色斑點。應用時將被檢豬血樣幹紙浸出液或血清稀釋液1μl點在硝酸纖維素膜上，加洗滌液100μl，再滴加豬囊蟲抗原膠體金100μl，2－3分鐘內即形成或不形成紅色斑點，結果判斷容易，一個反應盒可做1－4份待檢血樣，檢測成本低，具有敏感、特異、檢出率高，省工、省時、採血樣方便等優點，適用於豬囊蟲病診斷與流通市場檢疫等領域應用。
文檔編號G01N33/532GK1866014SQ20061005084
公開日2006年11月22日 申請日期2006年5月19日 優先權日2006年5月19日
發明者盧福莊, 張雪娟, 程天印, 項美華, 付媛, 方蘭勇, 馮尚連, 程菊芬 申請人:浙江省農業科學院