微生物轉化法生產香蘭素的製作方法
2023-12-09 09:15:26
專利名稱：微生物轉化法生產香蘭素的製作方法
技術領域：
本發明涉及以谷糠、麥麩等農副產品以及當歸、川芎等中藥原料或其提取物殘渣為原料，或由此原料中富集、分離、提取得到的阿魏酸、薑黃素、以及天然(異)丁子香酚、4-甲基愈創木酚為底物，利用微生物轉化法生產天然香蘭素的工藝技術。
二、技術背景香蘭素，學名4-羥基-3-甲氧基苯甲醛，別名香草醛、香蘭醛。英文名vanillin，4-Hydroxy-3-Methoxybenzaldehyde，分子式C8H8O3，分子量152.15。外觀為白色至黃色針狀結晶或晶性粉末，有香莢蘭豆特有的香氣，微甜，沸點284-285℃，相對密度1.056。微溶於水(1g/100ml，14℃)，易溶於乙醇、冰醋酸等。易受光的影響，在空氣中逐漸氧化，遇見鹼性物質變色。ADI0-10mg/kg，LD501580mg/kg.
香蘭素為廣譜性高檔香料，是世界上產量最大、用途最多的香料之一，廣泛用於冰淇淋、飲料、巧克力、糖果、布丁、焙烤食品以及酒類、香菸、高檔化妝品中，除作為增香劑外，香蘭素還作為食品中的抗氧化劑；同時，香蘭素、乙基香蘭素、阿魏酸等芳香化合物還是醫藥原料及醫藥合成中重要的中間體，其需求量每年以10％的速度增加，目前年需求量在1.5萬噸以上。
香蘭素是天然芳香植物—香莢蘭中的主要成份，其在幹香莢蘭豆中的含量約為15-20g/kg，從天然植物中提取的成本較高。香莢蘭在種植過程中需要對花朵進行人工授粉，勞動強度大，難以大規模栽種；而且，香莢蘭植物的主要種植國家和地區的種植面積和產量有限(1999年全球產量僅2200-2400噸其中，馬達加斯加950-1400噸/年、印度尼西亞150-300噸/年、大溪地島150-200噸/年、墨西哥20-40噸/年、中國10-20噸/年；我國的海南省已經開始種植香莢蘭，但還沒有香蘭素工業產品供應)，因此，單靠增加香莢蘭豆的產量，從植物中提取香蘭素已不能滿足日益增長的市場需要，並且，每年從香莢蘭豆中提取的天然香蘭素只有約20噸。
目前，絕大部分的香蘭素是採用化學法進行合成，雖然該方法已經成熟，且成本低廉，但不論是採用有毒原料----愈創木酚、還是採用丁香酚、木質素合成生產香蘭素，不僅會造成環境汙染，而且所合成香蘭素的安全性也受到質疑，加之目前歐共體和美國等發達國家已開始限制合成香蘭素的添加使用量，消費者日益注重食品及其組分的安全性和天然性，因此，國內外對天然香蘭素的需求趨勢在不斷上升，採用生物技術生產天然香蘭素也受到了廣泛的關注。
目前，我國香蘭素的生產全部採用化學合成的方法，雖然能創造一定的經濟效益，但由於技術水平低，廢棄物處理不當等原因，對環境造成很大破壞，尋求天然香蘭素的生產方法是必然的趨勢。目前，比較有前景的實驗室研究有河南醫科大學和華中理工大學利用香莢蘭植物細胞懸浮培養物生產香蘭素，但要實現商業化生產還需要很長時間，國內目前還沒有以微生物轉化法生產香蘭素的相關研究報導。
國外對微生物轉化法生產香蘭素的研究也只有十幾年的歷史，而且也還沒有商業化生產的報導。
由於天然香蘭素巨大的市場需求(1.5萬噸/年)以及微生物轉化法生產香蘭素的誘人前景，對該領域的深入研究將會帶來巨大的經濟與社會效益。目前該領域技術的發展趨勢也表明前體物的選擇更多地集中在那些易得、價格低廉的農副產品；當然，此工作的前提是香蘭素生物轉化技術的發展和基因工程菌株的構建，特別是以澱粉或葡萄糖直接合成香蘭素工程菌株的構建技術。
生產香蘭素或香子蘭香精系列產品，除考慮技術的可行性外，還要綜合考慮其經濟性、安全性等。據估算，採用植物細胞培養技術生產香蘭素，成本高達15000美元/公斤，而採用傳統方法從香莢蘭豆中提取的成本為4000美元/公斤，利用微生物轉化法成本約為1000美元/公斤。利用提取法生產的天然香蘭素每年只有約20噸，遠不能滿足人們對天然香蘭素和天然香蘭素香精產品的巨大需求，如果微生物轉化法生產香蘭素的成本能進一步降低的話，相信全球每年1.5萬噸、且還有以10％增長率的香蘭素市場需求量，即使有超過10％的產品被微生物轉化法生產的香蘭素所取代，每年也會有1500噸的巨大市場需求。
香蘭素微生物轉化的前體物阿魏酸一般在谷糠和麥麩、甜菜等農副產品下腳料中含量較高，據估計，我國每年有1000萬噸的米糠，1000萬噸的麥麩等。目前，這些資源開發的比例極小。該發明技術的推廣使用，不僅把農副產品轉化成高附加值產品，而且可以解決環保和農業資源與農村人力資源問題，具有很高的經濟與社會效益。
發明內容
1、發明內容概論本發明涉及以谷糠、麥麩等農副產品以及當歸、川芎等中藥原料或其提取物殘渣為原料，或由此原料進行富集、分離、提取得到的阿魏酸、薑黃素、以及天然(異)丁子香酚、4-甲基愈創木酚為底物，利用微生物轉化法生產天然香蘭素的工藝技術。
2、本發明的技術實施方案及工藝谷糠、麥麩等農副產品下腳料經過篩選除去沙石、金屬等雜質後進行處理。
微波處理既可以殺滅物料中的有害微生物，延長原料的保質期，又有助於阿魏酸和不溶性纖維素之間化學鍵的斷裂，提高游離阿魏酸的含量，從而提高阿魏酸得率。根據微波處理的物料數量和微波發生器的功率來確定處理時間，一般微波處理的條件是時間5-20min，物料處理溫度不超過80℃。經過微波處理的原料如果不立即使用，則可以進行封閉保存，保質期為半年以上。
微波處理後的原料可以進行超細粉碎，物料目數300-500目。
經過以上工藝處理得到的原料進行擠壓膨化處理，條件是中心溫度140-230℃，主軸轉速40-100r/min，物料水分9-15％，進料速度20-60kg/h。經處理的原料，粗粉碎或切割成小顆粒。
阿魏酸的富集、分離和提取採用下列工藝路線物料浸泡→回流→過濾→減壓蒸餾濃縮→粗提物。浸提溶劑可以是甲醇、乙醇、甲烷或正己烷等有機溶劑。提取得到的粗提物-阿魏酸含量在10-80％。
微生物轉化所需的菌種經活化處理後進行培養，培養條件是時間5-50h，溫度25-35℃，攪拌轉速200-400r/min。
當微生物生長進入穩定期後，加入經過提純的阿魏酸或經過處理的麥麩進行生物轉化，其轉化條件為時間30-90h，溫度30-45℃，攪拌轉速200-700r/min。
不同阿魏酸添加量對香蘭素產量的影響無菌添加阿魏酸，使其初始濃度分別為1g/L、6g/L和8g/L，然後進行轉化試驗，結果如圖1、2和3所示。
由圖1、2和3可以看出，香蘭素的產量隨阿魏酸添加量的增大而增加，但產生香蘭素的延遲期隨阿魏酸添加量的增大而延長。當阿魏酸添加量為6g/L，並在38h補加6g/L阿魏酸時的香蘭素產量最高，達到8.59g/L。而副產物香草酸的產量一直都保持在很低水平。這是由於黴菌在以阿魏酸為底物進行代謝時，香草酸只積累到一定量，然後將香蘭素作為主要代謝產物，即在此處形成一個瓶頸，導致香蘭素的過量合成。
微生物轉化以後，過濾菌體或發酵液中的固體物質，然後分離、精製上述微生物轉化液中的香蘭素。
香蘭素的分離提取工藝路線為浸提→萃取→回流→減壓蒸餾濃縮→粗提物。
浸提溶劑可以是苯、甲醇、乙醇、甲烷、正己烷等有機物；萃取溶劑為鹼性水溶液。
香蘭素粗提物的精製採用超臨界二氧化碳萃取工藝。
超臨界二氧化碳萃取工藝的條件是溫度30-50℃；壓力15-40Pa。甲醇、乙醇或甲烷、正己烷等有機溶劑作攜帶劑。經該工藝處理得到的香蘭素製品，純度高於90％。
由於本發明的最大特點是香蘭素粗提物的精製採用超臨界二氧化碳萃取工藝。該提取工藝可以省去大量酸鹼處理過程，除降低分離成本外，還可以大大降低酸鹼溶液對環境的汙染。
四、本發明具體實施步驟1、原料的前處理技術將經過篩選以及去石、去金屬物等處理後，進行微波處理。條件是時間20分鐘，物料溫度不超過80℃。上述物料經超微粉碎處理，物料目數350目，然後進行擠壓膨化處理，條件是中心溫度180-200℃，主軸轉速75rpm，物料水分13.5％，進料速度40kg/h。經此處理工藝的原料，粗粉碎或切割成小顆粒備用。
2、香蘭素的微生物轉化技術將預處理的物料，經過浸提、回流、過濾和濃縮處理，得到阿魏酸的粗體物，阿魏酸含量10-80％，備用。
事例1經過事例2得到的阿魏酸粗提物，採用超臨界二氧化碳萃取工藝進行精製。超臨界二氧化碳萃取工藝的條件是溫度35℃；壓力25-30Pa；甲醇作攜帶劑。經該工藝處理得到的阿魏酸製品，純度高於90-99％。
事例2在斜面培養基中將出發菌株於30℃條件下培養72h，然後接入種子培養基，搖床190-230r/min，37℃振蕩培養24-28h後，以1-3％的接種量接入發酵培養基中，當生長到靜止期時加入阿魏酸，使其初始濃度分別為8g/L，並在35-45h流加阿魏酸8g/L，發酵轉化完成後測定培養基中阿魏酸、香蘭素、香草酸的含量，香蘭素產量8.6g/L。
事例3將發酵液中的菌體離心分離後，得到1.5L發酵液，50-55℃真空濃縮後得到濃縮發酵液0.5L，然後使用有機溶劑乙醇和正己烷(1.1-1.5∶1)混合萃取3次，得到2.4L萃取液，濃縮回收後使用丙酮和正己烷(1∶1-2)混合萃取後濃縮回收，得到香蘭素含量為36％的粗體物20g。提取率為60％。
事例4將事例5所得到的香蘭素粗提物進行超臨界二氧化碳萃取，萃取工藝條件是溫度30-50℃；壓力15-40大氣壓。乙醇作攜帶劑，得到含量為91％的天然香蘭素7.5g。超臨界二氧化碳萃取提取率為94.8％。
綜合提取率為57％。
本發明所採用的方法，可以最大限度的降低酸鹼以及有機溶劑的使用和排放，減少對環境的汙染破壞。產品更加安全可靠。
五
圖1為阿魏酸添加量為1g/L時的產量曲線。圖2為阿魏酸添加量為6g/L時對產物的影響。圖3為阿魏酸添加量為8g/L時對產物的影響。
權利要求
本發明涉及以谷糠、麥麩等農副產品以及當歸、川芎等中藥原料或其提取物殘渣為原料或由此原料中富集、分離、提取得到的阿魏酸、薑黃素、以及天然(異)丁子香酚、4-甲基愈創木酚為底物，利用微生物轉化法生產天然香蘭素的工藝技術。1、一種微生物轉化法生產香蘭素的方法，其特徵在於以谷糠、麥麩、甜菜渣等富含阿魏酸的農副產品為原料，或以天然阿魏酸、薑黃素、(異)丁子香酚、4-甲基愈創木酚為原料，微生物過量轉化生產香蘭素，包括發酵工藝以及香蘭素的分離提取技術。
2.根據權利要求1所述方法，其特徵在於微生物生物轉化法生產天然香蘭素的原料可以是麥麩、谷糠、穀殼、甜菜糖提取殘渣等農副產品，也可以是富含阿魏酸的當歸、川芎等中藥原料或其提取物殘渣，也可以是純品天然阿魏酸、薑黃素、(異)丁子香酚、愈創木酚和4-甲基愈創木酚，但不局限於以上原料。
3.根據權利要求1所述方法，其特徵在於微生物轉化法生產天然香蘭素利用的微生物，可以是酵母菌，也可以是黴菌、細菌或放線菌，或是基因工程菌，但不局限於以上微生物。
4.根據權利要求1所述方法，其特徵在於微生物培養的條件是時間25-50h，溫度25-35℃，攪拌轉速200-400r/min。
5.根據權利要求1所述方法，其特徵在於微生物轉化的條件是時間30-90h，溫度30-45℃，攪拌轉速200-700r/min。
6.根據權利要求1所述方法，其特徵在於分離、精製上述微生物轉化液中的香蘭素。
7.根據權利要求6所述方法，其特徵在於香蘭素的分離提取工藝路線為浸提→萃取→回流→減壓蒸餾濃縮→粗提物。
8.根據權利要求7所述方法，其特徵在於提取溶劑可以是苯、甲醇、乙醇、甲烷、正己烷等有機物；萃取溶液為鹼性水溶液。
9.根據權利要求1所述方法，其特徵在於香蘭素粗提物的精製採用超臨界二氧化碳萃取工藝。
10.根據權利要求9所述方法，其特徵在於超臨界二氧化碳萃取工藝的條件是溫度30-50℃；壓力15-40Pa。甲醇、乙醇或甲烷、正己烷等有機溶劑作攜帶劑。
11.根據權利要求10所述方法，其特徵在於經該工藝處理得到的天然香蘭素製品，純度高於99％。
全文摘要
本發明涉及以谷糠、麥麩、甜菜渣等富含阿魏酸的農副產品為原料，或以天然阿魏酸、薑黃素、(異)丁子香酚、4－甲基愈創木酚為原料，微生物過量轉化生產香蘭素，包括發酵工藝以及香蘭素的分離提取技術。
文檔編號C12P7/24GK1629301SQ20031012367
公開日2005年6月22日 申請日期2003年12月18日 優先權日2003年12月18日
發明者周慶禮, 王昌祿, 黃豔鳳, 顧曉波, 王鴻, 張民 申請人:天津科技大學