一種蝴蝶蘭組培苗快速繁育的方法及真菌誘導子的製作方法

2023-12-08 17:44:36 2

一種蝴蝶蘭組培苗快速繁育的方法及真菌誘導子的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種用於蝴蝶蘭組培苗快速繁育的方法及真菌誘導子，其通過保藏編號CGMCC?No.8018的絲核菌製備而成。採用本發明的真菌誘導子處理蝴蝶蘭組培苗，無須添加任何人工激素，其鮮重增長量即可達到對照的4倍左右，如果將其按適當的濃度添加到該組培苗的生產中，將大大縮短其生產周期，節約大量的成本，應用前景十分廣闊。
【專利說明】一種蝴蝶蘭組培苗快速繁育的方法及真菌誘導子
【技術領域】
[0001]本發明涉及植物和微生物領域，具體的涉及一種能夠用於蝴蝶蘭組培苗快速繁育的方法及真菌誘導子。
【背景技術】
[0002]組織培養技術已普及，它給生產者帶來了最大的生產量和資源集約化，但是在繼代培養中往往會由於激素累積過量和繼代培養係數過高等原因造成了組培苗變異、玻璃化等現象的發生，這不僅使種苗不能保持克隆體的優良特性還造成了生產的浪費。真菌誘導子(Fungalelicitor)是來源於真菌細胞提取物或分泌物的一種特定的化學信號,在植物與真菌的相互作用中，能快速、高度專一和選擇性的誘導植物特定基因的表達，進而活化特定次生代謝途徑，積累特定目的的次生代謝產物。因其含有大量的幾丁質、多糖、寡糖、多肽、脂肪酸、蛋白質、糖蛋白和糖脂等物質，可提高植物的生物量、次生代謝產物、多糖含量、酶活性等有效成分。迄今為止，已有許多證據表明，真菌對植物次生代謝的誘導屬於防禦反應的範疇。但並不是所有的真菌誘導子對某一次生代謝產物都會產生促進作用，有的甚至是抑制作用，誘導子種類、誘導子濃度、誘導子加入時間以及誘導的時間長短等多種因素都會密切地影響到誘導子的作用效果。隨著蘭科共生真菌為人們所認知，將真菌誘導子利用到組織培養中的優勢也體現了出來。於是將真菌誘導子應用到蘭科植物組織培養和細胞懸浮液培養中，以高效率地獲得組培物和次生代謝產物，已成為學者們竟先開展的研究，這方面成功實例也很多。
[0003]蝴蝶蘭Pha laenopsis在當今花卉市場中扮演著重要的角色，每年種苗的生產和銷售十分樂觀。然而，目前生產上常利用添加激素來提高蝴蝶蘭組培苗的生長速率，但同時容易出現變異和玻璃化等現象，因此，如何獲得一種能夠有效促進蝴蝶蘭組培苗生長的真菌誘導子是本領域的技術人員亟待解決的技術問題。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供一種絲核菌，其特徵在於所述的絲核菌菌株保藏編號CGMCCN0.8018，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
[0005]本發明另一方面還涉及一種用於蝴蝶蘭組培苗促生的真菌誘導子，其特徵在於所述的真菌誘導子由上述絲核菌製備而成，優選的，所述的真菌誘導子製備方法包括如下步驟:所述絲核菌在PDA平板培養基上培養7d後用打孔器打孔，並將菌餅接種到預先分裝、滅菌好的PDA液體培養基中，100-150r/min搖床震蕩培養7d,待菌絲體充分生長後收穫，用果汁機將菌絲體打碎後與菌液混合，滅菌後得。
[0006]本發明另一方面還涉及一種蝴蝶蘭組培苗培養基，其特徵在於所述的培養基中含有70-90ml/l上述真菌誘導子以及1/2MS培養基+2-4%蔗糖+0.4-0.8%瓊脂。
[0007]採用本發明的真菌誘導子處理蝴蝶蘭組培苗，無須添加任何人工激素，其鮮重增長量即可達到對照的4倍左右，如果將其按適當的濃度添加到該組培苗的生產中，將大大縮短其生產周期，節約大量的成本，應用前景十分廣闊。
[0008]微生物信息
[0009]本發明所篩選的Y03絲核菌(Rhizoctoniasp.)真菌已經保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCCN0.8018，保藏地址為:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏日期為2013年08月12日。
【具體實施方式】
[0010]實施例1
[0011]I材料與方法
[0012]1.1 材料
[0013]選取具有I~2條根、4~5片葉、生長狀況一致的蝴蝶蘭Phalaenopsis組培苗。
[0014]1.2 方法 [0015]1.2.1真菌誘導子的配製
[0016]將從野生蘭分離得到6個菌根真菌YOl~Y06在PDA平板培養基上培養7d後用直徑為0.5cm的打孔器打孔，並將菌餅接種到預先分裝、滅菌好的PDA液體培養基中，250ml每瓶，每瓶接種I個菌餅，120r/pm搖床震蕩培養7d，待菌絲體充分生長後收穫。用果汁機將菌絲體打碎後與菌液混合，121°C滅菌20min後備用。
[0017]1.2.2誘導子培養基的配製
[0018]以1/2MS培養基+3%蔗糖+0.6%瓊脂為基礎培養基，分別將Y01-06號真菌誘導子按40、60、80ml/l三個梯度分別添加到基礎培養基中，不加真菌誘導子的基礎培養基作為對照。
[0019]1.2.3測定項目和方法
[0020]接種前，在超淨工作檯上用萬分之一電子天平精確稱取組培苗的質量，然後接種到含不同濃度誘導子的培養基中，置於30001ux、12h/d的條件下培養，25°C、相對溼度70%-75%，每個處理接種30株，每瓶5株，共6瓶。90d後收穫組培物，清水洗淨根部的培養基後自然風乾，然後用萬分之一電子天平稱取組培苗的鮮重，隨後取樣測定葉綠素a、葉綠素b和葉綠素(a+b)含量。
[0021]稱取0.5000g左右的健康葉片，切碎，用25ml丙酮一乙醇溶液(V8cw _: V95still =1:1)避光浸提24h，u-2910型紫外可見分光光度計測量上清液在645、663nm波長下的吸光度A645、A663,以下列公式計算出葉綠素a、葉綠素b及葉綠素(a+b)的總含量。
[0022]Ca(mg/g) = (12.7IA663 — 2.59A645) V/1000w ；
[0023]Cb(mg/g) = (22.88A645 — 4.67A663) V/lOOOw ；
[0024]Ca+b (mg/g) = (8.04A663 + 20.29A645) V/lOOOw ;計算出葉綠素 a、葉綠素 b 及葉綠素(a+b)的總含量。
[0025]2結果:真菌誘導子對蝴蝶蘭組培苗鮮重以及葉綠素含量的影響
[0026]真菌誘導子處理蝴蝶蘭組培苗90d後，稱取組培苗的鮮重。處理1、處理2等13個處理均能極顯著地促進蝴蝶蘭組培苗的生長，其中處理6、處理13、處理16和處理18的處理效果最佳，以處理6增長量最大，其鮮重增長量為0.2379g，接下來依次是處理16的鮮重增長量為0.2369g、處理18的鮮重增長量為0.2241g和處理13的鮮重增長量為0.2123(表I)。三個不同濃度的Y01、05和Y06均有利於組培苗鮮重的積累，並且最佳的處理濃度為40ml/l。處理10的鮮重增長量雖然低於CK，但與CK之間差異不顯著。蝴蝶蘭組培苗鮮重增長量的大小依次為:處理6>處理16>處理18>處理13>處理2>處理9>處理4>處理15>處理1>處理17>處理3>處理8>處理14>處理7>處理12>處理5>處理11，添加80ml/l的Y02、40ml/1或80ml/lY06、40ml/l的Y05最有利蝴蝶蘭組培苗生物量的積累。
[0027]葉綠素含量是植物生長狀態的一個反映，葉綠素含量a和葉綠素b含量的測定對植物的光合生理和逆境生理具有重要意義，測量葉綠素含量對了解真菌誘導子對植物體作用十分必要。經方差分析和多重比較(表2)，處理9、處理13的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b的含量極顯著高於CK，其中處理13最明顯，葉綠素a+b含量為0.2016mg/g,其次是處理9的葉綠素a+b含量為0.1922mg/g,處理10的葉綠素a、葉綠素a+b含量極顯著於對照，而對葉綠素b無顯著影響。處理16、處理18等的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b含量CK差異不顯著。可見，處理13即添加量為40ml/l的Y05更利於蝴蝶蘭組培苗光合能力的提高。光、溫度、營養元素、氧、水等都會影響葉綠素的合成，添加真菌誘導子為組培苗提供了營養元素。
[0028]表1真菌 誘導子對蝴蝶蘭組培苗鮮重增量影響的顯著性分析
【權利要求】
1.一種絲核菌，其特徵在於所述的絲核菌菌株保藏編號CGMCCN0.8018，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
2.一種用於蝴蝶蘭組培苗促生的真菌誘導子，其特徵在於所述的真菌誘導子由權利要求I所述絲核菌製備而成，優選的，所述的真菌誘導子製備方法包括如下步驟:所述絲核菌在PDA平板培養基上培養7d後用打孔器打孔，並將菌餅接種到預先分裝、滅菌好的PDA液體培養基中，100-150r/min搖床震蕩培養7d,待菌絲體充分生長後收穫，用果汁機將菌絲體打碎後與菌液混合，滅菌後獲得。
3.—種蝴蝶蘭組培苗培養基，其特徵在於所述的培養基中含有70-90ml/l權利要求2所述的真菌誘導子以及1/2MS培養基 +2-4%蔗糖+0.4-0.8%瓊脂。
【文檔編號】C12N1/14GK103642696SQ201310525288
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年10月30日 優先權日:2013年10月30日
【發明者】陳金花, 尹俊梅, 楊光穗, 宋希強 申請人:中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所