誘導龍血樹產生血竭的2株真菌的製作方法
2023-12-08 17:53:21 3
專利名稱：誘導龍血樹產生血竭的2株真菌的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物工程技術領域，具體的說是涉及2株真菌，將它們接種在龍血樹上，能夠誘導龍血樹產生血竭。
背景技術：
血竭，又叫「雲南紅藥」，在我國中醫藥學中的記載和應用已有1500餘年，歷代醫學家推崇備至。血竭原名騏鱗竭，始載於《雷公炮炙論》玉石部，《本草述均元》稱其有「奪命 之功」；《新修本草》首載其功效為「去五臟邪氣、帶下、心痛、破積血、金創生肉」;其後《海藥本草》指出血竭「主打傷折損」。我國藥學鼻祖李時珍在《本草綱目》中譽之為「活血聖藥」，更概括其功效為「散滯血諸痛」。在古代醫學文獻上血竭功效一直被認為是「化瘀止血止痛、生肌斂瘡」。由於血竭臨床效果顯著，需求量大，導致其供應緊張，價格攀升，加快生產血竭顯得非常迫切。目前,我國國產血竭的來源植物主要是劍葉龍血樹(Dracaena cochinchinensis)和小花龍血樹(Dracaena cambodiana)。龍血樹是小喬木狀植物，莖高3 7m,主要分布在北緯21. 5 23. 6°地區，以東南亞的柬埔寨、寮國、越南等國為主要產地。國內以雲南思茅、西雙版納等地為主產區，廣西、海南等地也有部分資源，主要分布在雲南南部和廣西南部海拔250 1700m的熱帶、亞熱帶石灰巖山地。由於血竭的供求矛盾突出，其基源植物劍葉龍血樹和小花龍血樹均已被列為國家三級保護的瀕危物種。在自然條件下，龍血樹生長十年甚至幾十年，有傷口和蟲蛀等現象發生的部位，才能產生血竭。血竭產生的周期長，產量低，是影響醫藥使用的主要問題。目前，血竭的生產主要以砍傷樹木獲取為主。近年來，也有一些新方法能產生血竭的報導，如，培養植物組織細胞生產血竭的方法，這一方法主要是在實驗室條件下，以龍血樹的愈傷組織生產血竭；也有報導用激素和化學物質誘導龍血樹生產血竭。目前這些方法均不夠成熟，無法實現大規模的生產應用。通過對植物與微生物相互作用的研究發現，龍血樹與某些真菌相互作用可以產生血竭。發現具有這種作用的活性菌株，並利用它們高效、快速地生產血竭，是提高國產血竭產量，滿足醫藥市場對血竭日益增長的需求的重要途徑，也是實現龍血樹野生資源保護和可持續利用的有效途徑之一。
發明內容
本發明的目的在於提供2株能夠誘導龍血樹生產血竭的真菌，將它們接種於龍血樹的樹幹或枝幹上，能夠使龍血樹產生與血竭理化性質相似的紅色物質。本發明提供的2株真菌，經鑑定分別為保藏編號為CGMCC No. 4452的赤黴(Gibberella sp.)真菌BJDC-1 和保藏編號為 CGMCC No. 4454 的暗球腔菌(Phaeosphaeriasp.)真菌BJDC-5。這2株真菌於2010年12月16日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。保藏單位地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。菌株的保藏和存活證 明見附件。2株真菌的培養特性分別為BJDC-I :在PDA培養基上，菌落白色，菌絲呈條紋輻射狀，毛狀邊緣，氣生菌絲不發達，不容易挑取菌絲，無明顯可見的分泌物存在。菌落背面乳黃色。用O. 65cm直徑的菌餅接種，生長5天，菌落直徑5. 25cm。菌絲有粗、細兩種，均有隔。細菌絲淡色，直徑大約3 μ m ;粗菌絲透明，直徑大約6 μ m。產孢結構明顯，分生孢子梗為瓶梗狀，彎曲明顯，頂端膨大。孢子豐富，為淡色，彎曲狀，有三種形態第一種彎曲、無隔，長約8μπι;第二種略彎曲、無隔，長約20 μ m,第二種具一隔，長約20 μ m。BJDC-5 :在PDA培養基上，菌落白色，略泛土黃色，短毛緻密均勻，氈狀，氣生菌絲不發達，質地硬，不容易挑取，無明顯可見的分泌物存在。菌落背面灰黑色。用直徑為O. 65cm的菌餅接菌，生長5天，菌落直徑2. 90cm。菌絲有隔，直徑4-5 μ m，易斷裂。隔連接處兩端的菌絲多膨大，有鼓槌狀短節。隔與隔之間為淡色與透明相間。不產生分生孢子。2株真菌用蕎麥皮培養基培養。蕎麥皮培養基組成為蕎麥皮、麥麩、玉米粉、硫酸鈣和糖類成分；其中糖類成分為葡萄糖、或蔗糖、或葡萄糖和蔗糖2種糖類成分以任意比例混合的混合物。蕎麥皮培養基的配製方法為(I)硫酸鈣和糖類成分用水配成混懸液，硫酸鈣的加入量按重量百分比計算為
O.5% -I. 5%，糖類成分的加入量按重量百分比計算為O. 5% -I. 5%。硫酸鈣微溶於水，糖類成分能溶於水。由於它們在配方中的用量較少，採用混懸液的方式加入，可以保證它們在培養基中均勻分散。(2)蕎麥皮、麥麩和玉米粉三種乾料按體積比為1-5 1-3 O. 05-0. I的比例混
合均勻。(3)將含有硫酸鈣和糖類成分的混懸液攪拌均勻，加入蕎麥皮、麥麩和玉米粉混合的乾料中，攪拌，使混合均勻。乾料和混懸液的重量(g)與體積(mL)比為I : O. 8-1. 6。培養基PH自然，測量值一般在6. 5-8. O之間。試管或罐頭瓶等玻璃器皿，容器裝量20-60%，121。。滅菌 120-180 分鐘。2株真菌的培養方法將2株真菌分別自低溫保藏的斜面試管菌種活化後，轉接於PDA培養基的平皿中，恆溫25°C暗培養。培養至菌落直徑大約3cm左右時，挑取邊緣菌塊，轉接於裝有上述固體培養基的罐頭瓶中，20-28°C暗培養。待菌絲生長充滿培養基約一半時，將培養的固體菌種轉接於新的、相同的培養基中，於相同條件下培養。菌絲長滿培養基後的菌種可以用於接種龍血樹,誘導龍血樹產生血竭；也可以作為大規模培養真菌的種子菌種使用。將2株真菌的固體培養物接種於龍血樹的樹幹或枝幹上，能夠誘導龍血樹產生血竭。接種的時候，菌株可以單獨使用，也可以2株同時使用。當使用混合菌種接種時，先將單獨培養的各菌株的固體培養物以所需要的比例混合均勻，之後進行接種使用。
具體實施例方式實施例I利用真菌BJDC-I促進龍血樹生產血竭。
(I)固體培養基的製作配製蔗糖和硫酸鈣濃度均為O. 5%的混懸液；將蕎麥皮、麥麩和玉米粉這3種材料按體積比為I : I : O. 05的比例混合均勻；每公斤乾料中加入混懸液I. 2升，攪拌均勻。培養基分裝後，於121°C滅菌165分鐘。(2)菌種的準備挑取經PDA平板活化的BJDC-I菌落邊緣的菌種塊，接種到裝有上述固體基質的罐頭瓶中，於23-25°C暗培養15天。將生長旺盛的真菌菌絲塊再一次轉接到裝有蕎麥皮培養基的罐頭瓶中，於23-25°C暗培養20天，待用。(3)接種孔的準備選取樹齡10年，胸徑> IOcm的小花龍血樹，在樹幹或枝幹上按照左右間隔5cm，上下間隔8cm的距離，用電鑽或手工打孔器打孔，孔口略向上，直徑為lcm，深約3cm。如果接種前孔周圍植物組織比較乾燥，用無菌水噴灑孔壁，使其保持溼潤。(4)接菌將真菌YNDC-I的培養物用無菌鑷子或小勺接入接種孔中，接種量約為 3克，輕輕按壓，保證菌種與開孔周圍植物組織的接觸，但不要將接種物壓得過於緻密。用少量無菌棉覆蓋接種孔口，再用麻繩纏繞固定。以上處理重複3次。結果2個月之後觀察，在接種部位及其周圍有深紅色物質形成，表面閃光，粘性。真菌BJDC-I誘導小花龍血樹樹幹或枝幹變色，形成深紅色物質的範圍(左右寬度，上下寬度)數據見表I。從以上處理的接種部位取下木材，放入75%以上濃度的酒精中，可以使酒精溶液變成鮮紅色。將顏色變化部位取出，陰乾，稱重，數據見表I。實施例2利用BJDC-5號真菌促進龍血樹生產血竭。(I)固體培養基的製作配製葡萄糖濃度I. 5 %，硫酸鈣濃度I %的混懸液；將蕎麥皮、麥麩和玉米粉這3種材料按體積比為5 3 O. I的比例混合均勻；每公斤乾料中加入混懸液I. 6升，攪拌均勻。培養基分裝後，於121°C滅菌180分鐘。(2)菌種的準備挑取經PDA平板活化的BJDC-5菌落邊緣的菌種塊，接種到裝有上述固體基質的罐頭瓶中，於20-23°C暗培養15天。將生長旺盛的真菌菌絲塊再一次轉接到裝有蕎麥皮培養基的罐頭瓶中，於20-23°C暗培養40天，待用。(3)接種孔的準備選取樹齡10年，胸徑> IOcm的劍葉龍血樹，在樹幹或枝幹上按照左右間隔8cm，上下間隔15cm的距離，用電鑽或手工打孔器打孔，孔口略向上，直徑為I. 5cm,深約5cm。如果接種前孔周圍植物組織比較乾燥，用無菌水噴灑孔壁，使其保持溼潤。(4)接菌將真菌BJDC-5的培養物用無菌鑷子或小勺接入接種孔中，接種量約為5克，輕輕按壓，保證菌種與開孔周圍植物組織的接觸，但不要將接種物壓得過於緻密。用少量無菌棉覆蓋接種孔口，再用麻繩纏繞固定。以上處理重複3次。結果2個月之後觀察，在接種部位及其周圍有深紅色物質形成，表面閃光，粘性。真菌BJDC-5誘導劍葉龍血樹樹幹或枝幹變色，形成深紅色物質的範圍(左右寬度，上下寬度)數據見表I。從以上處理的接種部位周圍取下木材放入75%以上濃度的酒精中，可以使酒精溶液變成鮮紅色。將顏色變化部位取出，陰乾，稱重，數據見表I。比較例I(I)固體培養基的製作配製葡萄糖和蔗糖濃度均為O. 6%，硫酸鈣濃度為I. 5%的混懸液；將蕎麥皮、麥麩和玉米粉這3種材料按體積比為3 3 O. I的比例混合均勻；每公斤乾料中加入混懸液I. O升，攪拌均勻。培養基分裝後，於121°C滅菌120分鐘。(2)接種孔的準備選取樹齡8年以上，胸徑彡IOcm的小花龍血樹，在樹幹或枝幹上按照左右間隔5cm，上下間隔8cm的距離，用電鑽或手工打孔器打孔，孔口略向上，直徑為I. 2cm,深約4cm。如果接種前孔周圍植物組織比較乾燥，用無菌水噴灑孔壁，使其保持溼潤。(3)空白處理用少量無菌棉覆蓋接種孔口，再用麻繩纏繞固定。以上處理重複3次。(4)陰性對照處理將滅菌後的蕎麥皮培養基用無菌鑷子或小勺接入接種孔中，接種量約為3克，輕輕按壓，保證培養基與開孔周圍植物組織的接觸，但不要將接種物壓得過於緻密。用少量無菌棉覆蓋接種孔口，再用麻繩纏繞固定。以上處理重複3次。結果2個月之後觀察，空白處理的接種孔周圍變化很小，僅有很小範圍的顏色變化，與周圍組織顏色相比，呈淺紅色；陰性對照處理的接種孔周圍變化也很小，僅有很小範圍的顏色變化，顏色為淺紅。從以上2種處理的接種部位周圍取下木材放入75%以上濃度的酒精中，可以使酒精溶液變成淺紅色。真菌誘導擴散的範圍(左右和上下寬度)數據見表I。將顏色變化部位取出，陰乾，稱重，數據見表I。比較例2(I)固體培養基的製作配製葡萄糖濃度為O. 5%、蔗糖濃度為1%，硫酸鈣濃度為I. 5%的混懸液；將蕎麥皮、麥麩和玉米粉這3種材料按體積比為3 2 O. I的比例混合均勻；每公斤乾料中加入混懸液O. 8升，攪拌均勻。培養基分裝後，於121°C滅菌150分鐘。(2)菌種的準備分別挑取經PDA平板活化的真菌BJDC-I和BJDC-5的菌落邊緣的菌種塊，接種到裝有上述固體基質的罐頭瓶中，於26-28°C暗培養至菌絲生長充滿培養基質的2/3-5/4，待用。(3)接種孔的準備選取樹齡8年以上，胸徑彡IOcm的劍葉龍血樹，在樹幹或枝幹上按照左右間隔8cm，上下間隔IOcm的距離，用電鑽或手工打孔器打孔，孔口略向上，直徑為I. 5cm，深約5cm。如果接種前孔周圍植物組織比較乾燥，用無菌水噴灑孔壁，使其保持溼潤。(4)接菌將真菌BJDC-I和BJDC-5的培養物按體積比約為O. 5 : I的比例混合均勻；用無菌鑷子或小勺將上述混合菌種接入接種孔中，接種量約為3-4克，輕輕按壓，保證菌種與開孔周圍植物組織的接觸，但不要將接種物壓得過於緻密。用少量無菌棉覆蓋接種孔口，再用麻繩纏繞固定。重複3次。結果2個月之後觀察，在接種部位及 其周圍有深紅色物質形成，表面閃光，粘性。2種真菌混合物誘導龍血樹樹幹或枝幹變色，形成深紅色物質的範圍(左右寬度，上下寬度)數據見表I。從以上處理的接種部位周圍取下木材放入75%以上濃度的酒精中，可以使酒精溶液變成鮮紅色。將顏色變化部位取出，陰乾，稱重，數據見表I。表2.龍血樹接種2種真菌後顏色變化範圍及變化範圍木材的採收重量
權利要求
1.誘導龍血樹產生血竭的2株真菌，它們分別是保藏編號為CGMCCNo. 4452的赤黴(Gibberella sp.)真菌 BJDC-1 和保藏編號為 CGMCC No. 4454 的暗球腔菌(Phaeosphaeriasp.)真菌 BJDC-5。
2.如權利要求I所述的真菌，其特徵在於2株真菌的固體培養，其培養基組成為蕎麥皮、麥麩、玉米粉、硫酸鈣和糖類成分；其中糖類成分為葡萄糖、或蔗糖、或葡萄糖和蔗糖2種糖類成分以任意比例混合的混合物； 固體培養基配製方法為 (1)硫酸鈣和糖類成分用水配成混懸液，硫酸鈣的加入量按重量百分比計算為0. 5% -I. 5%，糖類成分的加入量按重量百分比計算為0. 5% -I. 5% ; (2)蕎麥皮、麥麩和玉米粉三種乾料按體積比為1-5 1-3 0.05-0. I的比例混合均勻； (3)將含有硫酸鈣和糖類成分的混懸液加入蕎麥皮、麥麩和玉米粉混合的乾料中，攪拌，使混合均勻；乾料和混懸液的重量與體積比為I : 0. 8-1.6。
3.如權利要求I所述的真菌，其特徵在於2株真菌的用途是能夠接種在百合科龍血樹屬植物劍葉龍血樹和小花龍血樹的樹幹或枝幹上，誘導植物產生血竭。
4.如權利要求I所述的真菌，其特徵在於2株真菌單獨使用，或以任意比例混合使用，都能夠誘導劍葉龍血樹和小花龍血樹產生血竭。
全文摘要
本發明公開了2株真菌，它們分別是保藏編號為CGMCC No.4452的赤黴屬(Gibberellasp.)真菌BJDC-1和保藏編號為CGMCC No.4454的暗球腔菌屬(Phaeosphaeria sp.)真菌BJDC-5。將它們接種到龍血樹的樹幹或枝幹上，能誘導龍血樹產生血竭，在提高中藥血竭產量，保護龍血樹野生資源方面有廣闊的應用前景。
文檔編號C12R1/645GK102649938SQ201110044300
公開日2012年8月29日 申請日期2011年2月24日 優先權日2011年2月24日
發明者孟志霞, 崔晉龍, 王春蘭, 郭順星, 陳曉梅 申請人:中國醫學科學院藥用植物研究所