一種添加蛋白酶抑制劑提高過氧化氫酶產量的方法
2023-12-09 11:18:56
專利名稱：一種添加蛋白酶抑制劑提高過氧化氫酶產量的方法
技術領域：
一種添加蛋白酶抑制劑提高過氧化氫酶產量的方法，屬於發酵工程技術領域。
背景技術：
過氧化氫酶(Catalase，簡稱CAT)，能夠催化H2A分解為H2O和02，被廣泛用於食品消毒、臨床分析、醫學診斷以及紡織、造紙、製漿等工業。CAT在棉織物前處理過程中的主要作用是去除織物漂白廢液中殘餘的H2O2，以消除對後續染色工序的影響。大多數過氧化氫酶由4個相同的亞單位組成，分子量在MO kDa左右。近年來隨著過氧化氫酶在紡織、造紙、製漿等行業的普遍應用，市場對過氧化氫酶的需求大幅增長。過氧化氫酶產量的提高，對酶的生產和應用非常重要，可以降低生產的成本，獲得較高的經濟效益，滿足工業應用的需求，服務國計民生。六偏磷酸鈉是一種無機鹽，它可以抑制蛋白酶，保護過氧化氫酶不被分解，是一種價格低廉的保護劑，通過添加六偏磷酸鈉，提高過氧化氫酶的產量，尚未見文獻報導。
發明內容
本發明的目的是提供一種提高過氧化氫酶產量的方法。為解決上述技術問題，提供如下技術方案在過氧化氫酶發酵生產30-40小時添加1-10 g/L蛋白酶抑制劑。所述過氧化氫酶生產菌株優選枯草芽孢桿菌feciBm sp. WSHDZ-01，中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC N0:M206062，詳見中國專利一種鹼性過氧化氫酶高產菌及用該菌株發酵法生產鹼性過氧化氫酶，專利號200610040898. 0。所述蛋白酶抑制劑優選六偏磷酸鈉。培養基
斜面培養基6°麥芽汁，瓊脂1. 5%-2· 0 %，pH 7. 5。液體種子培養基6°麥芽汁，PH 7.5。基本發酵培養基
葡萄糖 10 g/L, NaNO3 5 g/L, MgSO4 · 7H20 0. 5 g/L, Na2HPO4 9. 52 g/L, KH2PO4 0. 6 g/L, FeSO4 · 7H20 0. 0025 g/L, pH 7. 0-7. 5。培養方法
斜面培養接種後的斜面置於37° C的恆溫培養箱中培養10-20 h，4° C下冷藏保藏，定期轉接。液體種子培養方法取一環斜面菌體接種至裝有50 ml種子培養基的250 ml三角瓶中培養，HYG- II型迴轉式恆溫調速搖瓶櫃的轉速為200 r/min溫度設為37 °C，培養 12-14 ho基礎搖瓶發酵培養按照6 %(體積比)的接種量將培養12-14 h的種子培養液， 接種至裝有80 ml基礎發酵培養基的500 ml三角瓶中進行發酵培養，發酵時間為36-40 h，溫度為37° C，搖床轉速為200 r/min。發酵罐培養電腦在線控制檢測發酵罐KFT-3 L中，裝發酵培養基1.8 L，接種量為5%的體積比，攪拌轉速為400 rpm，溫度採用分階段控制策略，(TlO h 37 °C，1廣20 h 35 °C，21h 發酵結束32 °C。通氣量為1.0 vvm，發酵周期為48-53小時。過氧化氫酶活力的測定方法
採用分光光度法在37 ！下測定。反應總體積為3 mL，含0. 1 mL酶液樣品和2. 9 mL 含 10 mmol/L 的 50 mmol/L KH2PO4-K2HPO4 緩衝液(pH 7. 0),H202 的分解速率用 UV-2450 型紫外可見光分光光度計在MO nm下測定。酶活定義為在37 ！下，分解H2A 1 Mmol/min 所需的酶量為一個酶活單位。本發明的有益效果
1)在不改變現有工藝的條件下，過氧化氫酶產量大幅提高；
2)發酵液的儲藏穩定性提高，降低了分離純化過程中酶活的損失；
3)原料價格低廉、方法操作簡單，易於工業化生產中應用。
具體實施例方式對照實施例
本發明所用的菌種為枯草芽孢桿菌(Mcillus sp. WSHDZ-Ol )，從斜面挑一環菌種接入種子培養基中(50 mL/250 mL搖瓶)，37°C，200 rpm培養12-14 h。將種子液按接種量為 5%的體積比，接入發酵罐KFT-3 L中，裝發酵培養基1.8 L，攪拌轉速為400 rpm，通氣量為 1.0 vvm，採用分階段溫度控制策略，(TlO h 37 °C，
1廣20 h 35 °C，21tT發酵結束32 °C。發酵周期為52小時左右，正常發酵，不添加六偏磷酸鈉，胞外過氧化氫酶的產量為13500 U/mL。實施例1
在正常發酵的發酵罐KFT-3 L中，在發酵到36 h時，添加3 g/L的六偏磷酸鈉，其餘條件同對照實施例，發酵周期不變，胞外過氧化氫酶的產量達到18600 U/mL。實施例2 在正常發酵的發酵罐KFT-3 L中，在發酵到36 h時，添加5 g/L的六偏磷酸鈉，其餘條件同對照實施例，發酵周期不變，胞外過氧化氫酶的產量達到19200 U/mL，過氧化氫酶的產量提高了 42. 2%。實施例3:
在正常發酵的發酵罐KFT-3 L中，在發酵到36 h時，添加7 g/L的六偏磷酸鈉，其餘條件同對照實施例，發酵周期不變，胞外過氧化氫酶的產量達到19700 U/mL，過氧化氫酶的產量提高了 45. 9%。實施例4
在正常發酵的發酵罐KFT-3 L中，在發酵到30h時，添加lg/L的六偏磷酸鈉，其餘條件同對照實施例，發酵周期不變，胞外過氧化氫酶的產量達到15700 U/mL，過氧化氫酶的產量提高了 16. 3%ο實施例5
在正常發酵的發酵罐KFT-3 L中，在發酵到40h時，添加10g/L的六偏磷酸鈉，在發酵
4到30h時，添加lg/L的六偏磷酸鈉，其餘條件同對照實施例，發酵周期不變，胞外過氧化氫酶的產量達到16900 U/mL，過氧化氫酶的產量提高了 25. 11
實施例6
在正常發酵的發酵罐KFT-3 L中，在發酵到36 h時，添加5 g/L的六偏磷酸鈉，其餘條件同對照實施例，發酵周期不變，發酵結束得到發酵液，25°C放置12h殘留酶活率為 84. 4%，對照為56. 1%，儲藏穩定性提高了 28. 3%。
權利要求
1.一種添加蛋白酶抑制劑提高過氧化氫酶產量的方法，其特徵在於，發酵生產過氧化氫酶的30-40小時添加1-10 g/L蛋白酶抑制劑。
2.權利要求1所述方法，其特徵在於，所述蛋白酶抑制劑為六偏磷酸鈉。
3.權利要求1所述方法，其特徵在於，過氧化氫酶發酵生產菌株為枯草芽孢桿菌。
4.權利要求3所述方法，其特徵在於，所述枯草芽孢桿菌保藏於中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC NO :M206062。
5.權利要求1所述方法，其特徵在於，枯草芽孢桿菌發酵生產過氧化氫酶的30-40小時添加1-10 g/L六偏磷酸鈉。
全文摘要
一種添加蛋白酶抑制劑提高過氧化氫酶產量的方法，屬於發酵工程技術領域。在過氧化氫酶發酵生產30-40小時添加1-10g/L蛋白酶抑制劑。在不改變現有工藝的條件下提供了一種大幅提高過氧化氫酶產量的方法，操作簡單易於在工業生產中使用。
文檔編號C12N9/08GK102250849SQ20111018790
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月6日 優先權日2011年7月6日
發明者馮卓林, 劉龍, 堵國成, 李江華, 陳堅 申請人:江南大學