人類非小細胞肺癌及其它幾種癌症的單克隆抗和抗原的製作方法

2023-12-09 03:56:16 2

專利名稱:人類非小細胞肺癌及其它幾種癌症的單克隆抗和抗原的製作方法
此項發明涉及一種新的單克隆抗體還涉及對於癌症抗原具專一性的新的單克隆抗體的生產和使用方法。更為特別的是，本項發明的單抗對於與人類非小細胞肺癌(NSCLC)及某些其它癌症包括某些乳腺癌、結腸癌等聯合的蛋白質抗原是免疫學特異的和(或)具有免疫學活性的。
此項發明的單抗能與NSCLC細胞及其它癌細胞(包括乳腺癌、結腸癌和小細胞肺癌)的糖蛋白抗原決定簇反應。本發明的單抗具有突出的特性和反應能力，這使該抗體適合於體內、體外臨床診斷之目的。此外，此單抗還適用於治療服用。例如，它可以作為許多試劑的靶向選擇載體，而這些試劑具有抗癌效應;這些試劑包括化療藥物，毒素，免疫反應效應物，以及放射性同位素但並不限於此。而且，生產這種單克隆抗體的雜交瘤可用重組DNA技術進行修飾，以使所產生的抗體能介導依賴於抗體的細胞毒性，或者，可以在補體存在下溶解癌細胞。
2.
2.1人類肺癌死於癌症的男性大部分是由於肺癌;在死於癌症的女性中肺癌正超過乳腺癌而成為最常見的死因。按組織學類型這種疾病可分為四類;(1)表皮狀或鱗裝(30%)，(2)腺癌(35%)，(3)未分化的大細胞(15%)，(4)小細胞(20%)。非小細胞肺癌(NSCLC)包括下列細胞類型;表皮樣癌細胞，腺癌細胞，大的未分化的癌細胞。
大多數肺癌不能用化療和放射法治癒。小細胞肺癌在化療和放療下可能縮小尺寸，但不能完全治好。最有效的治療可能只有手術切除瘤子。然而，不幸的是少於30%的肺癌病人的瘤子能在診斷後被完全切除。其中，在完全切除瘤子後，只有少於1/3的病人能存活五年。這種情形就要求有儘可能早期診斷肺癌的方法，確定癌症擴散程度的方法以及更有效的治療方法。
2.2單克隆抗體單克隆抗體是均一的抗體分子，它與具有特異性結合或親合常數的抗原上的單一分子位點(即表面決定簇)相結合，在現有技術中有三種製備它們的方法。
單克隆抗體可以用Kohler和Milstein設計的雜交瘤技術製備(1975，Nature 256;495;1976，Eur.J.Immunol.6;511)。通過將產生抗體細胞(脾淋巴細胞)與骨髓瘤細胞融合，Kohler和Milstein創造了雜交細胞，從這種雜交細胞得到了具有產生抗體的能力和在細胞培養基中永久生長的能力的永久細胞系。雜交瘤分泌一種單一類型的免疫球蛋白，這種免疫球蛋白的抗原特異性取決於淋巴細胞所暴露的抗原。
此外，單克隆抗體可用體外轉化哺乳類動物外圍血液B淋巴細胞而產生。例如，使用非洲淋巴瘤病毒(EBV)。該病毒使產生抗體的淋巴細胞不死。文獻中可以見到這種轉化技術(例如，見Steinmetz et al.1977，Nature 269;420;Crawford et al.，1983，The Lancet，i386)。
最後，可以使用結合了EBV-不滅技術和細胞融合或雜交技術生產單克隆抗體。科爾等人描述了將人類漿細胞瘤或淋巴細胞瘤細胞系與EBV轉化的給體淋巴細胞相融合的技術，這種給體淋巴細胞已予先建立了細胞(1985年，《單克隆抗體與癌症治療》，Alan Liss，Inc.，第77-96頁)。在這個體系中，兩個親本細胞系都不死。因此，融合的雙方必須有適當的藥物標記，以便在培養融合雜交瘤時對親本細胞進行反選擇。所得到的EBV雜交瘤將產生具有所使用的EBV-淋巴細胞系特異性的抗體。
單克隆抗體可通過體外培養特定雜交瘤或轉化的細胞系的方法大量生產。此外，將一雜交瘤細胞系植入適合的哺乳動物和小鼠的腹腔，便會產生腫瘤，該腫瘤將高濃度(1～20mg/ml)單克隆抗體分泌到腫瘤腹水液中，移出腹水，純化單克隆抗體，一隻小鼠就可以提供足夠上千次診斷檢定所需要的抗體。
2.3與肺癌有關的單克隆抗體與抗原抗人類肺癌抗原的單克隆抗體已由下列研究者描述過Si Rora及同事(1981)，Brit.J.Cancer 43;696;Cuttita及同事(1981)，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 784591;Moody及同事(1981)，Science 2141246;Minna及同事，(1981)，In Vitro 171058;Kennel及同事(1981)，Cancer Res.413465;Chem.Abst.95(15)1308502;Baylin及同事，(1982)，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA794650;Carney及同事，(1982)，Pathobiology Annual 12115;Gazdar及同事，(1983)，Seminars in Oncology 103;Hollinshead及同事，(1983)，Cancer Detect.Prevent 6185;Mulshine及同事，(1983)，J.Immunol.131497;Huang及同事(1983)，Arch.Biochem.Biophys.220318;Saji及同事(1984)，Hybridoma 3119;Bio.Abst.79005569;Bosslet及同事，Behring.Inst.Mitt.7427;Chem.Abst.Ac101(9)706680;Roset及同事(1984)，Cancer Res;442052;Bio.Ast.79023605;Princler及同事，(1982)，Cancer Res.42843;Mazauric及同事(1982)，Cancer Res.42150;Braatz及同事(1982)，Cancer Res.42849;Sobel及同事(1982)，Fed.Proc.41;409;Cole及同事(1985)，《Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy》，Alan Liss，Inc.，PP.77-96;Varki及同事(1985)，《Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy》，Alan Liss，Inc.，P.207。
1984年11月2日提交的美國專利申請第667，521號;1985年10月7日提交的785，177號;1984年11月21日申請的684，759號;1985年10月18日申請的776，321號;1985年5月28日申請的738，612號，上述文件公開了某些抗人類非小細胞肺癌的單克隆抗體。
單克隆抗體可用作儘早診斷肺癌和更好地確定癌症的擴散程度的方法，以及更有效地治療肺癌之方法。但其先決條件是找到能對付在肺癌中比在其它正常組織中表達更強烈的抗原的抗體。考慮到已知的癌細胞種群的不均一性，同一抗原分子上存在著幾個決定簇，在作為診斷標記和治療目標的穩定性方面抗原所具有的先天區別，以及對應同一抗原的不同抗體的不同生物學特性，就需要能對付眾多抗原的眾多抗體。
3.
此項發明涉及到一類新單克隆抗體，用L20表示，其對與人類非小細胞肺癌相關的一個糖蛋白抗原分子表面的一個決定簇具有特異性。「非小細胞」包括表皮樣癌細胞，腺癌細胞和未分化癌細胞的大細胞。該決定簇也能在其它一些癌細胞抗原分子上發現，如乳腺癌、結腸癌和小細胞肺癌。因此，此項發明所生產的抗體也將結合於其它癌細胞上，可用於診斷和治療所有能表達抗體L20所識別的抗原的其它癌症。這個單克隆抗體與正常成熟細胞的結合度遠小於腫瘤細胞。「結合度極小」是說其結合幾乎檢測不出，或用免疫組織化學檢測時只有非常弱的染色。因此，該抗體對於非小細胞癌及某些其它癌症的抗原具有高度特異性。
此項發明還包括被抗體L20識別的新L20抗原以及與該抗原結合的抗體類型。這些抗體對L20抗原是免疫特異或具免疫活性的。此外還包括使用純化的或克隆化的L20抗原作為疫苗來免疫接種以使免患某些癌症的方法。
此項發明還涉及某些採用此項發明的單克隆抗體的診斷方法。例如，該抗體用來確定人類肺組織和其它組織的惡性情況。這個方法包括檢查該組織是否出現被抗體L20識別的具有110，000道爾頓分子量的糖蛋白的一個抗原。例如，將組織與抗體接觸，該抗體能確定細胞相關抗原上的一個決定簇，而此抗原具有能被抗體L20識別的那種抗原的特性。這樣就可以檢測此抗體的一個功能等效物或一個片段，以及該抗體與抗原決定簇之間的任何反應。一種辦法是確定所懷疑的樣品細胞中是否存在非小細胞肺癌細胞。將該樣品與所述單克隆抗體接觸，這樣就能從存在於樣品中的其它細胞種類中識別這種細胞。這種接觸是在抗體與癌細胞結合的條件下進行的。接觸以後就可以確定樣品中有無癌細胞與抗體結合。這種結合關係到樣品中有無非小細胞肺癌細胞存在。通常樣品與單克隆抗體的標記的特異結合配體接觸。這種標記能產生可檢測的信號。
另一種診斷方法是體內定位腫瘤，由給病人服用本發明的純化抗體或其片段，該抗體或其片段是用可給出檢測信號的試劑標記的。然後用外部的閃爍照相術，X射線斷層術或放射性核掃描技術定位癌。這種方法還能為根據病變程度將癌症患者分類、治療反應中的變化提供更好的途徑。
此項發明還可應用於治療方面，因為L20抗體及其相似抗體可以與在癌細胞表面高濃度出現的L20抗原相反應。因而，抗體可以作為多種抗癌試劑的載體。抗癌試劑包括但不限於化療藥物，毒素，免疫反應效應物和放射性同位素。
此外，L20抗體可以被修飾，這樣，它可成為能夠介導抗體依賴的細胞毒性的抗體。(「抗體依賴的細胞毒性」簡記為ADCC)也就是說，它能在人類淋巴細胞或巨噬細胞存在下殺死非小細胞肺癌細胞(即NSCLC細胞)，或者在人類補體存在下可以溶解癌細胞。這種修飾可以用最近發展起來的產生「嵌合抗體」的技術來完成。依照這一技術，將編碼L20抗體可變區的基因與人類編碼具有適當生物學活性的抗體的Fc區的基因進行拼接(所謂「適當生物學活性」例如能激活人類補體和介導ADCC)。小鼠或人的新的抗體也可以做成對於L20抗原來說具有適當生物學功能。
此項發明為一新的單克隆抗體，命名為L20，對人類非小細胞肺癌細胞及人類某些其它癌症細胞表面抗原具有免疫特異性和(或)免疫反應活性。這些癌症包括結腸癌、乳腺癌和小細胞肺癌。此項發明還包括產生這種新單克隆抗體的方法以及採用該抗體的診斷和治療方法。
此外，此項發明還與一種新的細胞表面抗原及其應用有關，該抗原具有人類非小細胞肺癌、結腸癌，乳腺癌和小細胞肺癌的抗原的特性。
4.1產生抗NSCLC單克隆抗體的方法抗人類非小細胞肺癌和其它幾種癌症的單克隆抗體可以通過雜交瘤融合技術、人類產生抗體的淋巴細胞的EBV轉化技術或結合了上述兩種技術的方法來生產。
4.1.1融合技術根據此項發明的一個具體實施方案，用雜交瘤融合技術生產抗NSCLC的單克隆抗體。例如，從胸膜滲出物中得到的人類肺癌細胞，移植的人類非小細胞肺癌的培養細胞，正常胎兒肺細胞或這些細胞的溶胞產物都可以作為免疫原。在一個說明性的實施例中，從NSCLC中移植的細胞即人類肺腺癌＃3082作為免疫原(見5.1)。將該細胞注射給小鼠，在一段足夠時間後，殺死小鼠，並得到產生抗體的淋巴體細胞。產生抗體的細胞可以從免疫好的動物的淋巴結、脾臟和外周血管得到。最好用脾細胞。小鼠的淋巴細胞與下面要敘述的小鼠的骨髓瘤細胞融合，具有高百分比的穩定的融合量。也能使用大鼠、兔子和青蛙的體細胞。通常在聚乙二醇的存在下融合，而使編碼所需要免疫球蛋白的脾細胞染色體不因脾細胞與骨髓瘤細胞融合而致死。幾種骨髓瘤細胞可用於生產融合的細胞雜種包括NSI-Ag4/1，X63-Ag8，MPC11-45.6TG1.7，X63-Ag.653，SP2/0-Ag14，Fo，S194/5 XXO.Bu.1，(以上為從小鼠系派生)，210.RCY3.Ag1.2.3，U-226AR和GM1500GTGAL(從大鼠系派生)(Hammerling及同事，1981，「單克隆抗體和T細胞雜交瘤」，見《免疫學研究專論》Vol.3，J.L.Turk，ed;Elsevier/North Holland Biomedical Press.New York).作為一個說明性的實施例中，使用NS1細胞(見5.1)，得到的細胞，包括已融合的細胞，使其在選擇性培養基如HAT-培養基中生長，用有限稀釋法使活下來的雜交瘤細胞在這種培養基上生長。該細胞在適當的容器中如微孔板內生長，從上清液中篩選具有所需特性的單克隆抗體。
有很多常規方法用來分離純化單克隆抗體，以便將它們與其它蛋白質和雜質和雜質分開。
4.1.2.EBV轉化技術按照此項發明的另一具體實施方案，是採用EBV轉化技術生產抗NSCLC單克隆抗體。例如，按Cole及其同事1984年在Camcer Res.442750所敘述的方法，使用EBV轉化技術使帶有NSCLC的病人的邊緣血液，腫瘤排放的淋巴結，骨髓吸取液，癌滲出液或胸膜滲出液中所取得的淋巴細胞不死。正如Cole及其同事所述，肺癌病人缺少特異於癌症抗原的B淋巴細胞。因此，通過預先篩選產生抗相關抗原抗體的淋巴細胞來增殖產生抗體的淋巴細胞數目是十分重要的。EBV轉化技術包括下列兩個步驟(1)用已知抗原(即4.2.1中所描述的L20抗原)的受體進行細胞富集;(2)用EBV感染這些細胞使它們不死。
4.1.3.EBV-雜交瘤技術根據此發明的另一實施方案，採用如Cole及同事(1985，《單克隆抗體與癌症治療》，Alan R.Liss，Inc;PP.77-96)所敘述的將EBV轉化與雜交瘤融合的技術相結合的方法製備抗NSCLC單克隆抗體。例如，將一個骨髓瘤細胞系與NSCLC病人提供的供體淋巴細胞相融合，這種淋巴細胞已進行了EBV轉化，建立了細胞系，能在培養條件下生長和繁殖。為了能夠篩選到EBV一雜交瘤融合細胞系，必須使融合雙方具有顯性選擇性藥物標記，如烏本苷或新黴素抗性，以便在培養融合的雜交瘤細胞系時親本細胞(即未融合細胞)不生長。一種合適的細胞系是由Cole及同事(上述)敘述的硫代鳥嘌呤抗性GM-150，烏本苷抗性淋巴母細胞系，KR-4。得到的雜交瘤用常規技術克隆。
4.1.4.細胞增殖及抗體產生一旦所需的融合後的細胞雜交物或轉化的細胞系已經被選擇並被克隆成為個體抗體產生細胞系，那麼每個細胞系就可採用兩種常規方法進行增殖。個體細胞系可以在體外增殖，比如在實驗室培養容器中，而含有高濃單一特異性單克隆抗體的培養基可通過傾析、過濾或離心而得到。也可以通過將雜交瘤注射入與提供原始融合所用體細胞和骨髓瘤細胞的動物具有組織相容性的動物體內而使單克隆抗體產量增加。分泌那種由融合細胞雜交瘤產生的特異性單克隆抗體的腫瘤將在被注射的動物體內生長。該動物的體液，例如腹水或血清，提供高濃度的單克隆抗體。如Cole及同事(上述)所述，當使用人的雜交瘤或EBV-雜交瘤時，必須避免給動物(比如小鼠)注射時產生異種移植排斥。可以使用免疫缺乏小鼠或裸鼠，或者首先將雜交瘤注射給照射過的裸鼠產生皮下實體瘤，這種實體瘤取出，體外培養然後腹腔注入照射過的，降植烷刺激過的裸屬，該鼠將發育成分泌大量特異性的人的單克隆抗體的腹水瘤。(見Cole及同事，上述)4.2.單克隆抗體本發明的抗體與一類新的細胞表面糖蛋白抗原(稱為L20抗原)結合，該抗原具有人類非小細胞肺癌細胞及其它幾種人類癌症細胞的特性。(見4.2.1)該糖蛋白抗原在聚丙烯醯胺凝膠電泳進行免疫沉澱反應時測得分子量為110，000道爾頓(見5.3).用聚糖酶消化L20抗原表明該抗原含有N-連接的寡糖鏈。
作為本發明的一個具體實施方案，L20抗體用5.1中敘述的L20鼠雜交瘤生產。L20抗體屬於IgG1同型，親合力約為3×108(見5.2.2)。檢測不到它與正常細胞如成纖維細胞，內皮細胞或主要器官中的表皮細胞結合。「檢測不到結合」意味著用免疫組織化學法檢測時只有很弱的染色或根本沒有染色。
本發明還包括極為有用的上述單克隆抗體的結合片段如Fab，F(ab′)2′，Fv等。抗體片段用常規技術即可得到。例如，用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶等肽酶消化抗體得到有用的結合片段。
相似抗體(包括不同的同型、不同親合力的抗體)和新的生物學功能(如在補體或如淋巴細胞、巨噬細胞等效應細胞存在下殺死癌細胞的能力)也屬於本發明範圍。上述本發明的新抗體的具體實例是指出與相關抗原上某一特定決定位點結合的來自小鼠的屬於IgG1亞類的抗體，但這並不是限制範圍。上述抗體以及與它具有功能等價的抗體，不論其源於小鼠，或包括人在內的哺乳類動物，或是其它來源，或是多種來源的綜合，都屬於本發明的範圍，其它同型的抗體也不例外。「功能等價」指該抗體能結合於上述的抗原決定簇，並能與本發明的抗體在該區域進行競爭。也就是說，當該抗體與含有該抗原決定簇的細胞或細胞片段樣品結合時，本發明的抗體與該決定簇的結合將受到阻斷。此外，由於本項發明的抗原可有多個決定簇，此發明還包括那些能識別上述單克隆抗體所識別的抗原決定簇以外的決定簇的抗體，這些抗體可用本專業領域所知的順序免疫沉澱方法檢測。
本發明還包括對抗原決定簇起反應的抗體，或L20抗體的個體基因型，因為這些抗一個體基因型抗體可以用來分析對於癌抗原的免疫應答以便於診斷，並用以誘導免疫應答以便於治療和預防癌症。(Nepom及同事，1984，Proc.Nat'l Acad.Sci.812664)。
4.2.1為單克隆抗體識別的L20抗原本發明的單克隆抗體所識別的抗原包括一類新的具有NSCLC細胞以及幾種其它癌症細胞如乳腺癌，結腸癌和小細胞肺癌的抗原特性的細胞表面糖蛋白抗原。該抗原分子量為110，000道爾頓。
這種新的糖蛋白抗原的氨基末端胺基酸順序為1 5 10 15L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-20T-D-A-X-L其中X代表一個尚不清楚的胺基酸，其它字母代表常規單字母縮寫胺基酸。將此序列與貯存於當今蛋白質資料庫中的那些序列比較(PIR Release 6.0，November 1985)，沒有發現任何與之具有明顯的序列同源性。
4.3.單克隆抗體與L20抗原的應用4.3.1.診斷應用本發明的單克隆抗體可用作檢測人類NSCLC和其它人類癌症分泌抗原的探針。本發明的方法之一是通過檢查人類肺組織或其它組織的具有L20抗原特性的糖蛋白抗原的有無表達情況來確定該組織中癌變惡性程度。「具有L20抗原特性」是指該抗原能與識別L20抗原的抗體進行反應。這種抗原的表達或不表達可以為臨床提供常規組織病理學技術所不能提供的可用信息。
本發明的單克隆抗體可以用來例如檢測組織樣品和細胞樣品的非小細胞肺癌。如，用5.4中敘述的免疫過氧化物酶染色技術可以使腺癌，表皮狀和小細胞肺癌的切除的組織樣品顯示強烈正染色。而正常的肺，脾臟，結腸，腎臟，肝臟，腦，心臟，皮膚，胸腺，睪丸，陰道和正常淋巴細胞則為負染色。
本發明的單克隆抗體的另一重量的體外診斷應用是對NSCLC以外的其它癌症能作出估價。該抗體已用來檢測乳腺癌，結腸癌和小細胞肺癌的表位。這些組織的正常樣品不表達該因子。因此，本發明的單克隆抗體可用來檢測這些癌細胞的抗原因子。這樣，該單克隆抗體對於乳腺癌，結腸癌和小細胞肺癌可能是一種有用的診斷試劑。
此外，免疫螢光技術可用於檢測帶有本發明單克隆抗體的人類組織樣品。典型的程序就是，將擁有恆冷箱裝置的經冷凍未固定活體組織或離體癌樣品或細胞學塗片的玻片經空氣乾燥並與該單克隆抗體室溫培養於溼度控制小室內。細胞學塗片包括剝落的細胞樣品。「剝落」一詞是指該樣品包括分離的細胞或刮洗組織表面而得到的細胞群，這些細胞可以被單獨移去，或是鱗片般地剝落，或一層一層移去。剝落細胞樣品要與離體組織(如活組織檢查時得到的樣品)區別開。這個方法在從剝落細胞樣品中檢測確定癌變情況時找到效用，這些剝落細胞來自肺部(如痰樣品)，支氣管，胃腸道(包括口咽，嘴)以及頸塗片等。
乾燥以後，載玻片上鋪一層預備好的抗該單克隆抗體的抗體，一般如果該單克隆抗體是用小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞融合而產生的，則抗體採用某種類型的抗小鼠IgG的抗體。採用常規技術將此抗小鼠IgG抗體與某種化合物如鹼性蕊香紅或螢光素異硫氰酸鹽結合，在特定波長發出螢光。樣品內部染色的圖形和強度用螢光顯微鏡檢術來確定，並可隨意照像記錄。
上面敘述指出了本發明的抗體在免疫螢光技術方面的主要應用。然而，該抗體還可應用在大多數抗原一抗體反應的檢測技術上。檢測可以是均一或非均一的。均一檢測中樣品可以是溶胞後和澄清除去碎屑的組織。免疫反應通常包括特異性抗體，標記物和要檢測的樣品。基於抗體與標記物的結合，標記物所產生的信號直接或間接地得到修飾。免疫反應及其程度檢測反應都在均一溶液中進行。所採用的免疫化學標記包括自由基，螢光染料，酶，噬菌體，輔酶等。
在非均一檢測研究中，試劑通常就是樣品，特異性抗體及產生可檢測信號的工具。該單克隆抗體通常被覆蓋於固態支持物或固相上。接著液相樣品與固相上的單克隆抗體相接觸。然後固相支持物與液相分開，採用產生可檢測信號的工具對固相或液相進行檢測。信號是與樣品中待分析物的出現相關聯的。產生可檢測信號的方法包括使用放射活性標記物，螢光物質，酶等。非均一免疫檢測的例子有放射免疫檢測，免疫螢光方法，酶聯檢測等。
有關免疫檢測技術的更為詳細的討論見《酶免疫檢測》，Edward T.Maggio，1980，CRC.Press，Ins，Boca Raton，Florida。另外還可參閱美國專利號3，690，834;3，791，932;3，817，837;3，850，578;3，853，987;3，867，517;3，901，654;3，935，074;3，984，533;3，996，345及4，098，896等，但並不局限於此。
本發明的抗體還可用於體內診斷應用。例如，抗體或由抗體製備的片段，即Fab和F(ab′)2片段可用來反映癌症現象，用與Larson及同事1983，J.Nucl.Mecl.24123及1983，J.Clin.Invest，722101所述檢測惡性黑素瘤相似的方法檢查NSCLC病人代謝排洩物。純化的抗體或抗體片段用一種給出可檢測信號的試劑標記，例如放射性同位素131I，並以適當載體(如靜脈注入)給病人。癌結合的抗體的位置可通過外部的閃爍照相、X射線斷層照相或放射核掃描(如γ射線照相)技術來檢測。
4.3.2.治療應用本發明的抗體還可用於治療。該單克隆抗體可與廣泛的藥物或細胞毒性試劑結合使用。例如，抗體可與某種毒素結合形成免疫毒素(Jansen及同事，1982，Immunol.Rev.62185)或與放射性活性物質結合如I，I等(Order，1984，Compr.Ther.109;Larson及同事，1983，J.Clin.Invest.722101;Carrasquillo及同事，1984，Cancer Treatment Reports，68317)。還可與藥物結合形成放射性藥物或普通藥物(Rowland及同事，1985，Cancer Immunol.Immunother.191)。結合的抗體給病人服用，通過化療藥物的細胞毒性作用而達到加強抗癌效應，這些化療藥物是基於與其結合的抗體對癌細胞的親合作用而釋放到該腫瘤。
本發明的抗體的所謂「嵌合抗體」分子可被製備成含有與人類抗體不變區相結合的小鼠抗原一結合區(Morrison及同事，1984，Proc.Nat'l Acad.Sci.U.S.A.816851;Takeda及同事，1985，Nature，314452)，這項研究可用於構建新的抗體分子，它具有合乎需要的效應基因的功能，如能激活人類補體並介導ADCC(Neuberger及同事，1984，Nature 312604)。
該單克隆抗體另一治療上的應用是採用L20抗體作為免疫原製備抗個體型抗體。(如見Nepom及同事，1984，Proc.Nat'l Acad.Sci.U.S.A.812864;Lee及同事，1985，Proc.Nat'l Acad.Sci.826286)。
本項發明的吸引人的方面便是該抗體能將別的抗體結合到NSCLC或其它腫瘤上，如在美國專利申請號667，521，1984年11月2日申請;684，759，1984年12月21日申請及738，612，1985年5月28日申請文件中所公布的那些抗體。這種結合對於檢測上面提到的非小細胞肺癌的類型，即大細胞未分化肺癌，腺癌和表皮樣肺癌是有效的。
本發明的單克隆抗體還確定與其它癌症如乳腺癌，結腸癌和小細胞肺癌相關的抗原的決定簇。(見第5節表1)。因此，該抗體可對於指向這些癌症的治療方法及治療產物方面找到用途。
本發明的新抗原，稱為L20的抗原也可用於治療。該抗原可從癌中純化，或通過重組DNA技術產生(Brown及同事，Copending U.S.Patent Application Serial№827313，Attorney Docket №5624-008，1986年2月7日申請，包含於本文參考文獻中。)編碼L20抗原的基因可通過首先富集L20抗原的mRNA而克隆。通過這樣的方法，多核糖體(包括mRNA，核糖體和新生多肽鏈)可以通過與識別新生肽鏈上L20抗原決定簇的抗體進行免疫親和層析而純化。mRNA通過與例如L20抗體進行免疫沉澱反應而分離，而cDNA則克隆到一適宜的表達載體中。此外，L20抗體或抗L20抗原的抗血清可用來採用一種表達載體篩選cDNA庫。純化的或克隆化的L20抗原可以單獨作為免疫原或與合適的免疫佐劑一起施用。此外，編碼該抗原的基因可以插入一種病毒的基因中，如牛痘病毒，來產生作為免疫原的重組DNA產物。(Brown及同事，Copending U.S.Patent Application Serial №827313，Attorney Docket №5624-008 1986年2月7日申請)。
4.4診斷試劑盒本發明還包括採用上述所揭示並實現的方法做成的診斷試劑盒。在一個實施方案中，該診斷試劑盒包括(a)以上更為詳細限定的單克隆抗體，(b)為該單克隆抗體所結合的一個特異性配偶體與能產生可檢測信號的一種標記物的結合物。
試劑還包括一些輔助試劑如緩衝劑、蛋白質穩定劑，例如多糖等。需要時診斷試劑盒還包括信號產生系統的其它組分，如消減背景幹擾的試劑，對照試劑，完成一次檢測所需的設備等。在另一具體實施方案中，診斷試劑盒包括本發明的單克隆抗體與一能產生可檢測信號物質的結合物。上面提到的輔助試劑也包括於其中。
5.實例本發明由下列並非限定的實例詳細說明。
5.1單克隆抗體的製備單克隆抗體用Yeh及同事1979，Int.J.Cancer 29299先前敘述的雜交瘤融合技術產生。用從人類肺腺癌中移植的培養細胞作為免疫原(稱為3082)，免疫一隻三月令的Balb/c小鼠。小鼠接受四次約107(細胞量的腹腔注射。最後一次免疫後三天，取出其脾臟，懸浮於培養基中，並與NS1小鼠骨髓瘤細胞融合(Kohler及Milstein，上述)。接種該混合物以形成來源於單個融合細胞(克隆)的低密度培養物。
用ELISA方法或自動射線照相間接125I標記蛋白質A方法篩選雜種細胞上清液，獲得對肺癌細胞系直接親合能力。(Brown及同事1979，J.Immunol.Meth.，31201)。用Colcher及同事1981，Cancer Res.421451;Yeh及同事上述所述的修改的程序，製備用於免疫反應的癌細胞膜提取物。用PBS液衝洗組織，將從完整癌組織得來的細胞壓過不鏽鋼篩而製得其懸浮液。此後加入含1mM苯甲基磺醯氟(Calbiochem-Behring Corp.，San Diego，CA)的1mM Na HCO3溶液，該物質在冰上用Dounce勻漿器勻漿，B研杆研磨50次。以27，000xg離心15分鐘後，移去上清，片狀沉澱物於PBS中懸浮，超聲1分鐘，貯於-70℃。
生產與細胞膜提取物結合的抗體的雜交瘤在體外克隆、增殖，並進一步檢測抗體特異性。那些產生對人類肺癌具有明顯特異性的抗體的雜交瘤再克隆。增殖並注射入降植烷激發的三月令的BALB/c小鼠，在那裡，它們生長成腹水瘤。
在這程序之後，可得到雜交瘤細胞系L20，克隆，並注射到小鼠以產生腹水瘤。分泌入腹水的抗體於蛋白質A-瓊脂糖上純化(Ey及同事，1978，Immunochemistry，15429)或於Sephaeryl S-300上進行凝膠過濾而純化。鑑定純化抗體之特性。
5.2 L20單克隆抗體的特性5.2.1. L20與培養細胞檢測與結合測定抗體在非離子型去汙劑滲透前或滲透後與細胞的結合來確定抗原的亞細胞位置。用125I標記抗體的直接結合實驗(Brown及同事，1981，Proc.Nat'l Acad.Sci.U.S.A.，78539)或用螢光激活細胞分類儀(FACS)Ⅱ螢光檢測方法來識別與完整培養細胞的細胞表面結合的抗體。與細胞內抗原位置結合的抗體用下列技術確定125I標記的抗體與細胞直接結合;用多聚甲醛固定;用非離子型去汙劑NP-40滲透。
為用放射標記的抗體做結合實驗(Brown及同事，上述)，將所培養細胞(106)與106cpm的125I標記的抗體於100μl結合緩衝液中冰浴培養30分子。懸浮液按層取成0.2ml dinonylph alatedibutylph alate(11v/v)，並離心。以125I對片狀測定物及水相計數。為測量非特異性結合，未標記抗體作為競爭試劑進行平行培養。(Brown及同事，上述)表Ⅰ 放射性碘標記L20抗體與培養細胞的結合細胞 特異性結合Calu-1肺腺癌 45，400H3082肺腺癌 50，100H2981肺腺癌 64，100H2984肺腺癌 119，300MCF7乳腺癌 78，8003017黑素瘤 2，200正常T細胞 200Jurkat T白血病 200Daudi B淋巴瘤 2005.2.2. L20抗體同型確定採用下述技術確定L20雜交瘤細胞系所產生免疫球蛋白類型(a)Ouchterlony免疫擴散特定的雜交瘤細胞上清液的等分試樣被加入到25%瓊脂糖凝膠板中心孔。其它孔中加入單一特異性兔抗小鼠Ig同型抗體(Southern Biotechnology，Birmingham，AL)，該板室溫培養2小時4℃過夜。
(b)ELISA同型Dynatech Immuolon 96孔板孔用抗血清濃度1μg/ml的PBS溶液50μl覆蓋，留有覆蓋的4℃過夜。該板用PBS/吐溫20，0.05%衝洗，室溫下每孔加100μl培養基予以封閉(1小時)。衝洗完畢，將L20雜交瘤上清液加入孔中，室溫培養1小時。用PBS衝洗後，牛血清清蛋白板與過氧化物酶偶聯的單一特異性兔抗鼠Ig同型抗體在37℃下溫浴2小時。衝洗後，板與含1mg/ml鄰苯二胺及0.03%H2O2的pH4.5的0.1M檸檬酸緩衝液培育。630nm處光密度可在Dynatec ELISA酶標板讀出器上確定。
L20單克隆抗體屬於IgG1同型。
5.3. L20抗體所識別的抗原為了鑑定蛋白質抗原，肺癌細胞可進行細胞表面放射性碘標記或用S-蛋氨酸進行代謝標記。將溶胞產物與單克隆抗體培養，加入山羊抗小鼠IgG，吸附於金黃葡萄球菌，從中即可分離抗原。衝洗免疫沉澱物，進行十二烷基磺酸鈉聚丙烯醯胺電泳(SDS-PAGE)，凝膠濃度10～20%。電泳後凝膠用考馬斯亮藍染色(重量百分比0.5%～10%乙酸和30%異丙醇)，於乙酸(5%，v/v)和甲醇(17%，v/v)溶液中脫色。染過的L20抗原條帶用剃刀片切下，迅速用電洗脫機/濃縮機ECU-040進行電洗脫(C.B.S.Scientific Co.，San Diego，CA)，方法如Hunkapiller及同事，1983，Methods in Enzymol.91227-236所述。
用約23皮摩爾L20抗原(取決於已鑑定的L-1的產量)於一氣相序列儀(470A型，Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)上進行自動Edman降解。乙內醯苯硫脲胺基酸衍生物用反相高解析度液相色譜(HPLC)技術分析，所用為120A型HPLC單元(Applied Biosystems，Inc.)及PTH-C18柱(2.1×220mm，Applied Biosystems，Inc.)，用醋酸鈉/四氫呋喃/乙腈梯度洗脫。
氨基末端胺基酸順序如下1 5 10 15L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-
20T-D-A-X-L其中X代表一個尚未鑑定出來的胺基酸。
與已貯存於蛋白質資料庫中的順序相比，(PIR Release 6.0，Nov.1985)，沒有揭示出與其它任何已知序列有任何明顯的同源性。
被L20抗體識別的抗原是一分子量為110，000道爾頓的糖蛋白分子。
5.4體外免疫組織化學應用用Garrigues及同事，1982，Int.J.Cancer 29511修改過的Sternberger，1979，Immunochemistry，John wiley Sons，New York，PP104-169所敘述的未標抗體技術已用於對冰凍切片進行免疫組織化學研究。手術得到用於這些試驗的靶向組織，轉移到預冷在液氮中的異戊烷中冰凍4小時。然後組織被貯存於液氮中或零下70℃直到用時。兔抗鼠IgG使用時稀釋至1/50。(Sternberger-Meyer Immunochemicals，Inc.，Jarettsville，MD)。含有2mg/ml經純化的PAP小鼠過氧化物酶-抗過氧化物酶複合物(PAP，Sternberger-Meyer Immunochemicals，Inc.)用時稀釋至1/80。冰凍切片製備，乾燥，用丙酮處理，並乾燥(Garrigues及同事，上述)。用於組織學評價的切片用蘇木精染色。為降低非特異性背景，切片預先與稀釋至1/5的正常人血清培養(Garrigues及同事，上述)。小鼠抗體，山羊抗小鼠IgG，以及小鼠PAP均於10%正常人血清和3%兔血清溶液中稀釋。
染色程序包括用特異的或對照抗體處理序列切片2.5小時，與稀釋至1/50的兔抗小鼠IgG培養30分鐘，暴露於稀釋至1/80的小鼠PAP複合物30分鐘。每次用抗體處理後，載玻片用PBS洗兩次。用新鮮製備的0.5%3，3′-二氨基聯苯胺四鹽酸鹽(該藥品為Sigma，St.Louis，Mo)和含0.01%H2O2的0.05M Tris緩衝液pH7.6開始免疫組織化學反應8分鐘。於1%O3O4蒸餾水溶液浸泡20分鐘可以加強染色。切片浸入水，用乙醇脫水，用二甲苯洗淨，固定載玻片上。
載玻片在編號情況下，對每個均檢查確定，編有號碼的樣品由單獨的研究者檢驗。典型的載玻片用幹涉反差顯微鏡照相(Zeiss-Nomarski)。抗體染色程度記作0(無活性)，+(有幾個弱陽性細胞)，++(至少有1/3細胞為陽性)，+++(大多數細胞陽性)，++++幾乎所有細胞顯示很強陽性)。因為+和0之間差別比+和++染色差別顯得更不清楚，所以具有++或高於++的級別就認為是「陽性」。贅生細胞和基質細胞均可在癌樣品中觀察到。而記錄下的染色是癌細胞的，因為基質細胞幾乎不被染色，或染色程度比癌細胞弱得多。
表Ⅱ.癌細胞和正常組織樣品與L20單克隆抗體進行免疫過氧化物酶染色組織類型 陽性數/試驗數肺癌腺癌 18/20表皮樣癌 3/3支氣管 0/1小細胞 4/4肺癌細胞系 3/3乳腺癌 4/7結腸癌 5/8黑素瘤 5/8腎癌 1/1脂肉瘤 0/1正常肺 3個樣品中有1個弱染色正常脾 陰性正常乳腺 陰性正常結腸 陰性正常腎 陰性正常肝 陰性正常腦 陰性正常心臟 陰性正常皮膚 陰性正常胸腺 陰性正常睪丸 陰性正常陰道 陰性正常淋巴球 陰性所有檢查的樣品均為手術得到的組織冰凍切片。免疫組織學方法的詳細說明見正文。兩個+號染色(代表至少1/3細胞陽性)就認為為是陽性。
顯然，如上述所闡明的那樣，對於本發明作多處修正和改變將不會超出本發明的基本思想和範圍。僅以實例給出了特別的具體描述，本發明僅限於由附加權限條款所限定的那些。
這裡所描述的L20細胞系已存入American Type Tissue Culture Collection，Rockville，Maryland，登記號為ATCC NoHB8913。此處描述和要求的發明並不限於所存入的細胞系，因為所存入的具體實例僅為本發明一個方面的描述，而任何能產生功能等價單克隆抗體的等價活細胞都在本發明範圍之內。事實上，除了這裡描述的以外的對於本發明的各種修改顯然將屬於前文所述的範圍。這些修改都在所要求權項範圍之內。
權利要求
1.一種生產與人的非小細胞肺癌細胞的細胞表面糖蛋白抗原上的決定簇位點結合的單克隆抗體的方法，包括a)增殖具有A.T.C.C.
H B8913性狀的雜交瘤，通過使(i)來自用胸膜滲出液免疫的動物脾的抗體產生細胞，即人工培養細胞，或非小細胞肺癌患者的肺組織與(ii)骨髓瘤細胞融合得到雜交瘤；和b)收集由雜交瘤細胞產生的單克隆抗體。
2.按照權利要求
1的方法，其中雜交瘤在活體內增殖。
3.按照權利要求
2的方法，其中通過給BALB/C鼠注射準備好的姥鮫烷並使腹水腫瘤生長來增殖雜交瘤，分泌到腹水中的單克隆抗體通過在蛋白A瓊脂糖上的吸附或凝膠過濾得到純化。
4.按照權利要求
1的方法，其中產生的單克隆抗體與人的非小細胞肺癌細胞的細胞表面糖蛋白抗原上的決定簇位點結合，通過聚丙烯醯胺凝膠電泳測得抗原的分子量約為110，000道爾頓並且具有下列氨基末端的胺基酸順序1 5 10 15L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-20T-D-A-X-L其中X代表未鑑定出的胺基酸。
5.按照權利要求
4的方法，其中雜交瘤包括雜交瘤細胞株L20，A.T.C.C.HB8913號。
6.按照權利要求
5的方法，其中產生的單克隆抗體屬於IgG類。
7.按照權利要求
6的方法，其中產生的單克隆抗體屬於IgG1亞類。
8.一種生產與人的非小細胞肺癌細胞的細胞表面糖蛋白抗原上的決定簇位點結合的單克隆抗體的方法，包括a)增殖通過使得自非小細胞肺癌患者的抗體產生細胞不滅而獲得的轉化B細胞系;和b)收集由轉化B細胞系產生的單克隆抗體。
9.按照權利要求
8的方法，其中通過愛潑斯坦-巴氏病毒(EBV)感染使抗體產生細胞不滅。
10.一種生產與人的非小細胞肺癌細胞的細胞表面糖蛋白抗原上的決定簇位點結合的單克隆抗體的方法，包括a)增殖通過使(ⅰ)轉化的B細胞株與(ⅱ)骨髓瘤細胞融合而獲得的雜交瘤，轉化的B細胞株是通過使得自非小細胞肺癌患者的抗體產生細胞不滅而獲得的;和b)收集由雜交瘤細胞產生的單克隆抗體。
11.按照權利要求
10的方法，其中通過EBV感染使抗體產生細胞不滅。
12.按照權利要求
8的方法，其中產生的單克隆抗體與人的非小細胞肺癌細胞的細胞表面糖蛋白抗原上的決定簇位點結合，通過聚丙烯醯胺凝膠電泳測得抗原的分子量約為110，000道爾頓並且氨基末端的胺基酸順序如下1 5 10 15L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-20T-D-A-X-L其中X代表未鑑定出的胺基酸。
13.按照權利要求
10的方法，其中產生的單克隆抗體與人的非小細胞肺癌細胞的細胞表面糖蛋白抗原上的決定簇位點結合，通過聚丙烯醯胺凝膠電泳測得抗原的分子量約為110，000道爾頓並且氨基末端的胺基酸順序如下1 5 10 15L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-20T-D-A-X-L其中X代表未鑑定出的胺基酸。
14.按照權利要求
4的方法，其中產生的單克隆抗體屬於IgG類。
15.按照權利要求
12的方法，其中產生的單克隆抗體屬於IgG類。
16.按照權利要求
13的方法，其中產生的單克隆抗體屬於IgG類。
17.按照權利要求
14，15或16的方法，其中產生的單克隆抗體屬於IgG1亞類。
18.一種生產與人的非小細胞肺癌細胞的細胞表面糖蛋白抗原上的決定簇位點結合的單克隆抗體的方法，通過聚丙烯醯胺凝膠電泳測得抗原的分子量約為110，000道爾頓並且氨基末端的順序如下1 5 10 15L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-20T-D-A-X-L其中X代表未鑑定出的胺基酸，該方法包括a)增殖雜交瘤細胞株L20，A.T.C.C.HB8913號，該雜交瘤細胞株是通過使(ⅰ)得自用人的肺癌3082細胞免疫的BALB/C鼠的脾臟的抗體產生細胞與(ⅱ)NS1鼠骨髓瘤細胞融合而獲得的;和b)收集由雜交瘤產生的單克隆抗體。
19.按照權利要求
1，8或10的方法，其中單克隆抗體與人的乳癌細胞的細胞表面糖蛋白抗原上的決定簇位點結合。
20.按照權利要求
1，8或10的方法，其中單克隆抗體與人的結腸癌細胞的細胞表面糖蛋白抗原上的決定簇位點結合。
21.一種生產與人的胸癌細胞的細胞表面糖蛋白抗原上的決定簇位點結合的單克隆抗體的方法，包括a)增殖具有A.T.C.C.HB8913號性狀的雜交瘤，該雜交瘤是通過使(ⅰ)來自用胸膜滲出液免疫的動物脾的抗體產生細胞，即人工培養細胞，或非小細胞肺癌患者的肺組織與(ⅱ)骨髓瘤細胞融合而獲得的;和b)收集由雜交瘤產生的單克隆抗體。
22.一種生產與人的結腸癌細胞的細胞表面糖蛋白抗原上的決定簇位點結合的單克隆抗體的方法，包括a)增殖具有A.T.C.C.HB8913號性狀的雜交瘤，該雜交瘤是通過使(ⅰ)來自用胸膜滲出液免疫的動物脾的抗體產生細胞，即人工培養細胞，或非小細胞肺癌患者的肺組織與(ⅱ)骨髓瘤細胞融合而獲得的;和b)收集由雜交瘤產生的單克隆抗體。
23.一種檢測可能含有惡性細胞的樣品中的惡性細胞的方法，包括a)在使單克隆抗體與決定簇位點結合的反應條件下使樣品與按照權利要求
1，4，5，8或10的方法生產的單克隆抗體接觸;b)從樣品中除去未結合的單克隆抗體分子;和c)檢驗樣品中結合的單克隆抗體的存在，其中單克隆抗體的結合表明樣品中惡性細胞的存在。
24.按照權利要求
23的方法，其中惡性細胞包括非小細胞肺癌細胞。
25.按照權利要求
24的方法，其中樣品包括肺組織。
26.按照權利要求
23的方法，其中惡性細胞包括胸癌細胞。
27.按照權利要求
23的方法，其中惡性細胞包括結腸癌細胞。
28.按照權利要求
23或24的方法，其中通過免疫組織學染色檢測結合。
29.一種在活體內確定人的非小細胞肺癌的位置的方法，包括a)提純按照權利要求
1，4，5，8或10的方法生產的單克隆抗體;b)放射標記單克隆抗體;c)用合適的載體供給患者這種單克隆抗體;和d)通過外閃爍法，放射X線斷層術或放射性核掃描確定單克隆抗體的位置。
30.非小細胞癌的免疫治療方法，包括a)提純按照權利要求
1，4，5，8或10的方法生產的單克隆抗體;b)使單克隆抗體與細胞毒素劑，即一種毒素，或放射性藥物結合;和c)用合適的載體供給肺癌患者這種結合的單克隆抗體。
31.一種治療表達由L20抗體所限定的抗原的腫瘤的免疫治療方法，包括a)提純按照權利要求
1，4，5，8或10的方法生產的單克隆抗體;b)製備對單克隆抗體的抗個體基團型抗體;和c)用合適的載體供給肺癌患者這種抗個體基因型抗體。
專利摘要
本項發明涉及一類新的單克窿抗體，其能與某種蛋白質抗原強烈結合，該抗原與人類非小細胞肺癌(「NSCLC」)，小細胞肺癌及包括結腸癌、乳腺癌在內的其它癌症相關聯。該抗體在諸如檢測與NSCLC結合的惡性細胞的診斷方法方面以及在治療帶有NSCLC及其它幾種癌症的治療方面找到了用途。還公布了在人類非小細胞肺癌細胞表面及其它幾種癌症細胞表面發現了分子量為110,000道爾頓的一種新的糖蛋白抗原。該抗原氨基末端胺基酸順序為
1
5
10
15
L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-
20
T-D-A-X-L 其中X代表一未確定的胺基酸。
文檔編號C12N5/00GK87100927SQ87100927
公開日1988年10月5日 申請日期1987年3月14日
發明者卡爾·埃裡克·赫爾斯特羅姆, 約瑟夫·P·布朗, 英吉格·赫爾斯特羅姆 申請人:昂科金公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan