一種人用腮腺炎病毒組份疫苗及其製備方法和應用的製作方法
2023-12-09 03:32:26
專利名稱：一種人用腮腺炎病毒組份疫苗及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，更具體地說，本發明涉及一種人用腮腺炎病毒組份疫苗。同時，本發明還涉及所述疫苗的製備方法和應用。
背景技術：
腮腺炎疫苗是全球兒童常規接種的病毒性疫苗之一。目前，該疫苗的使用形式在各國均採用減毒活疫苗，由於其應用，已經成功地在多數國家，尤其是發達國家的許多地區控制了兒童腮腺炎的發病率。但是，隨著這一減毒活疫苗在人群中的廣泛應用和相應發病率的降低，其有可能和其它類似病毒活疫苗一樣，存在著出現毒力變化及在人群中形成一個特定亞型的可能性。另外，這類疫苗的不同毒株之間也表現有程度不一的免疫學效果的差異性，所誘導的人群的免疫學效果尚不是最佳。因此，從疫苗的發展角度看，在現有的腮腺炎減毒活疫苗的基礎上，進行相應疫苗的研究開發，將可以提升這類疫苗的有效性和安全性。從疫苗生物技術的角度看，探索具有較好免疫原性的組份疫苗或亞單位疫苗，將是下一步疫苗研製與使用的最佳形式。
目前，使用亞單位形式的病毒疫苗僅為B型肝炎病毒表面抗原疫苗，而作為病毒性組份疫苗，僅有裂解流感病毒疫苗作為一種初步的組份疫苗形式應用。因此，進一步研究多種病毒性疾病的組份或亞單位形式疫苗，具有重要的技術意義。而利用腮腺炎病毒來首先作為這項工作的對象，由於該病毒的結構特點及生物學特性，因此具有較為可行的技術意義。
腮腺炎病毒屬於副粘病毒，其基因組為負鏈單股RNA，由15500個核苷酸組成，其編碼7個蛋白，它們分別是NP、P、M、F、SH、HN及L蛋白，其中的HN和NP蛋白在病毒的特異性免疫原性方面具有重要意義，二者均能夠誘導機體的體液免疫及細胞免疫反應，尤其是HN可誘導機體產生中和性抗體，以及血凝抑制中和抗體。其中NP為70KD大小，HN為77KD大小，並具有血凝活性。另外，由於腮腺炎病毒能夠生長於多種組織培養細胞，如Vero細胞，因而有利於大規模培養製備。
發明內容
本發明的目的在於針對現有技術的不足及現實狀況的迫切需要，利用生物技術手段，提供一種人用腮腺炎病毒組份疫苗。同時，本發明還提供一種所述組份疫苗的製備方法。該方法所建立的Vero細胞組織培養、病毒裂解及組份分離方法，可用於製備數種副粘病毒的組份疫苗。
本發明的目的通過下述技術方案予以實現。
本發明提供了一種人用腮腺炎病毒組份疫苗，該疫苗是採用下述方法製備獲得採用常規方法從腮腺炎流行的人體內分離到一株腮腺炎病毒；該病毒經適應於Vero細胞培養後，可在該細胞內穩定生長，並達到105.0CCID50/ml產量，血凝滴度可達1∶8，病變周期為5～6天；然後製備單層靜止或旋轉Vero細胞培養物；經病毒的滅活與裂解及純化分離，獲得相應的病毒蛋白組份，據其分子量大小，可判定為HN和NP兩個抗原成分；該抗原組份在測定蛋白質含量後作為半成品疫苗；根據半成品疫苗蛋白濃度，以生理鹽水稀釋至100μl/ml，同時配製10.87mg/ml濃度的Al(OH)3，二者以對倍(V/V)混合，製成實驗性組份疫苗，並對其進行檢測其半成品蛋白含量＞2000μg/ml，成品蛋白含量為100μg/ml，無菌試驗為(一)，甲醛殘餘量＜0.5mg/ml；該疫苗即為所需的腮腺炎病毒組份疫苗。
本發明同時提供了所述的人用腮腺炎病毒組份疫苗的製備方法，該方法採用下列順序的步驟(1)腮腺炎病毒的分離從感染腮腺炎病毒的人體內分離到一株腮腺炎病毒，發病1～4天的患者的口漱液轉入滅菌小平碟內，加入相當於口漱液量50％的Hanks液混合均勻，低速離心10分鐘，取上清液，加入青黴素及鏈黴素，放置冰箱2小時後接種長成單層的Vero細胞，後置37℃培養。每天觀察有無細胞病變，培養6天後，出現細胞病變，後經血凝試驗證實確有病毒感染；並用商品化的腮腺炎病毒抗體進行中和試驗，明確所分離到的毒株即為腮腺炎病毒。
所分離腮腺炎病毒為SH基因及其旁側序列，根據基因分型，確定其屬於F基因型；該病毒經適應於Vero細胞培養後，可在該細胞內穩定生長，並達到105.0CCID50/ml產量，血凝滴度可達1∶8，病變周期為5～6天。
(2)製備單層靜止或旋轉Vero細胞培養物採用0.25％胰酶-0.01％EDTA消化已形成單層的Vero細胞，室溫靜置10min，棄去胰酶，再置室溫10-15min，待細胞消化形成單個後，以DMEM-8％BCS重懸細胞，稀釋至105.0細胞/ml，按106.0細胞/瓶接種羅氏瓶靜止培養；按4×106.0細胞/瓶，接種轉瓶旋轉培養；37℃培養2天，按0.01-0.05moi接種病毒，同時更換DMEM-1％BCS培養液，37℃繼續培養5～6天，待細胞出現病變時收穫病毒，取樣測定滴度；其滴度應為105.0CCID50/ml。
(3)病毒的滅活與裂解及純化分離收穫病毒液經滴度測定及無菌檢測後，按1∶2000(V/V)加入福馬林原液，37℃滅活7天，第一天內每隔2小時取樣，第二天開始每天取樣，測定病毒滅活曲線(見圖-1)；7天後，滅活病毒經過濾濃縮，在原體積基礎上濃縮100倍，按2％TritonX-100，11％SDS的比例，加入滅活病毒液，室溫作用2小時。處理後滅活病毒液由Sapharose4B柱過濾，其病毒裂解產物分離結果見圖-2，經血凝實驗分析結果見圖-3，確定取分離樣品，經PAGE-SDS(12％)電泳分析，及Western blot(圖-5)綜合血凝實驗分析，確定該分離組份包括兩個主要抗原成分，據其分子量大小，可判定為HN和NP兩個抗原成分；該抗原組份在測定蛋白質含量後作為半成品疫苗。
(4)腮腺炎病毒實驗性疫苗的製備根據半成品疫苗蛋白濃度，以生理鹽水稀釋至100μl/ml，同時配製10.87mg/ml濃度的Al(OH)3，二者以對倍(V/V)混合，製成實驗性組份疫苗，即為所需的人用腮腺炎病毒組份疫苗。
本發明對所述的人用腮腺炎病毒組份疫苗進行蛋白含量、無菌、甲醛殘餘量的檢測，檢測結果如下半成品蛋白含量＞2000μg/ml；成品蛋白含量 100μg/ml無菌試驗 (-)甲醛殘餘量檢測＜0.5mg/ml與現有技術相比，本發明具有以下突出的優點(1)品質優良本發明所研製的腮腺炎病毒組份疫苗，僅含有HN、NP兩個免疫原性強的蛋白亞單位；(2)有效性高；將本發明所研製的腮腺炎病毒組份疫苗及商品化的腮腺炎病毒減毒活疫苗分別免疫小鼠，ELISA結果檢測顯示本組份疫苗所產生抗體效價明顯高於商品化減毒活疫苗的抗體效價；充分說明本組份疫苗由於僅含免疫原性強的蛋白亞單位，因此能誘導機體產生更高的免疫應答效果；(3)安全性好；本發明所研製的腮腺炎病毒組份疫苗相對於滅活全病毒而言，由於病毒經過裂解劑處理之後，相對分子質量變小，並且只保留了具有抗原性的蛋白亞單位；因此，副反應大大降低，具有更好的安全性。
圖1是病毒滅活曲線；圖中病毒滅活前以0點表示，感染性滴度為105.0CCID50/ml，滅活8小時後感染性滴度降為0，已徹底滅活。
圖2是第二峰14～23管的的PAGE-SDS(12％)電泳圖譜、17管的Western blot圖譜。
圖3是17、18管的電泳結果，可見出現兩條帶，大小均為70KD。
圖4是17管的Western blot結果，採用腮腺炎病毒抗血清作為一抗，可見出現兩條特異性條帶，綜合血凝及電泳中條帶位置的分子量大小，可明確為HN及NP蛋白。
具體實施例方式
下面結合具體的實施例對本發明作進一步的說明，但這並不是對本發明內容的限定。
除非另有說明，本發明中所採用的百分數均為重量百分數。
實施例1——病毒的滅活與裂解及純化分離收穫病毒液經滴度測定及無菌檢測後，按1∶2000(V/V)加入福馬林原液，37℃滅活7天，第一天內每隔2小時取樣，第二天開始每天取樣，測定病毒滅活曲線，如圖1所示。7天後，滅活病毒經過濾濃縮，在原體積基礎上濃縮100倍，按TritonX-100 2％，SDS1％的比例，加入滅活病毒液，室溫作用2小時。處理後滅活病毒液由Sapharose4B柱過濾，其病毒裂解產物分離結果見表1，經血凝實驗分析結果見表2，確定取分離樣品，經PAGE-SDS(12％)電泳分析，及Western blot(見圖2～圖4)綜合血凝實驗分析，確定該分離組份包括兩個主要抗原成分，據其分子量大小，可判定為HN和NP兩個抗原成分；該抗原組份在測定蛋白質含量後作為半成品疫苗。
表1.病毒裂解產物分離結果
如表1所示處理後滅活病毒液經由Sapharose4B柱過濾後，採用試管共收集到兩個峰。
實施例2——腮腺炎病毒實驗性疫苗的製備根據半成品疫苗蛋白濃度，以生理鹽水稀釋至100μl/ml，同時配製10.87mg/ml濃度的Al(OH)3，二者以對倍(V/V)混合，製成實驗性組份疫苗，所製成的即為本發明所研製的腮腺炎病毒組份疫苗。
試驗例1——對所述的組份疫苗的免疫原性分析取PSF小鼠若干只，以20隻為一組，分別設定50μg/只劑量組，100μg/只劑量組，150μg/只劑量組，在小鼠後右肢皮下注射，4周後取血，分離血清，檢測抗病毒抗原抗體的滴度，其結果見表2。檢測結果表明100μg/只劑量組100％地出現了抗腮腺炎病毒抗體的陽轉。使用這些抗體的中和試驗表明，該腮腺炎病毒實驗性疫苗誘導的抗體對腮腺炎病毒具有中和效力。採用ELISA試劑盒檢測抗病毒抗原抗體的滴度，結果可見免疫後100μg/只劑量組100％地出現了抗相應病毒抗原抗體的陽轉。
表2.免疫後病毒抗體陽轉結果
試驗例2——組份疫苗的安全性分析對使用該組份疫苗的小鼠進行全面系統的病理學分析表明，該實驗性疫苗不會引起任何器官產生可見的病理學變化。
小鼠病理報告結果心、肝、脾、肺、腎、腮腺、腦各臟器均未見異常。
試驗例3——血凝實驗分析結果表3.
表3所示為每一管樣品的血凝結果，血凝程度以++++、+++、++、+、±、-表示。結果為第二峰全部管數的樣品均出現血凝++++，而第一峰及平臺期各管血凝結果均為-。由此可初步判定第二峰為樣品分離組份，並且含HA蛋白。再將第二峰各管樣品作倍比稀釋。
表4.血凝效價結果
表4以+作為結果判定標準，並且各管血凝效價均高於原病毒血凝效價(1∶8)，因此更進一步確定第二峰為樣品分離組份。
權利要求
1.一種人用腮腺炎病毒組份疫苗，該疫苗是採用下述方法製備獲得採用常規方法從感染腮腺炎病毒的人體內分離到一株腮腺炎病毒；該病毒經適應於Vero細胞培養後，可在該細胞內穩定生長，並達到105.0CCID50/ml產量，血凝滴度可達1∶8，病變周期為5～6天；然後製備單層靜止或旋轉Vero細胞培養物；經病毒的滅活與裂解及純化分離，據其分子量大小，可判定為HN和NP兩個抗原成分；該抗原組份在測定蛋白質含量後作為半成品疫苗；根據半成品疫苗蛋白濃度，以生理鹽水稀釋至100μl/ml，同時配製10.87mg/ml濃度的Al(OH)3，二者以對倍(V/V)混合，製成實驗性組份疫苗，並對其進行檢測其半成品蛋白含量＞2000μg/ml，成品蛋白含量為100μg/ml，無菌試驗為(-)，甲醛殘餘量＜0.5mg/ml；該疫苗即為所需的腮腺炎病毒組份疫苗。
2.一種人用腮腺炎病毒組份疫苗的製備方法，該方法採用下述順序的步驟(1)腮腺炎病毒的分離從感染腮腺炎病毒的人體內分離到一株腮腺炎病毒，將發病1～4天的患者的口漱液轉入滅菌小平碟內，加入相當於口漱液量50％的Hanks液混合均勻，低速離心10分鐘，取上清液，加入青黴素及鏈黴素，放置冰箱2小時後接種長成單層的Vero細胞，後置37℃培養。每天觀察有無細胞病變，培養6天後，出現細胞病變，後經血凝試驗證實確有病毒感染；並用商品化的腮腺炎病毒抗體進行中和試驗，明確所分離到的毒株即為腮腺炎病毒；(2)製備單層靜止或旋轉Vero細胞培養物採用0.25％胰酶-0.01％EDTA消化已形成單層的Vero細胞，室溫靜置10min，棄去胰酶，再置室溫10-15min，待細胞消化形成單個後，以DMEM-8％BCS重懸細胞，稀釋至105.0細胞/ml，按106.0細胞/瓶接種羅氏瓶靜止培養；按4×106.0細胞/瓶，接種轉瓶旋轉培養；37℃培養2天，按0.01-0.05moi接種病毒，同時更換DMEM-1％BCS培養液，37℃繼續培養5～6天，待細胞出現病變時收穫病毒，取樣測定滴度；其滴度應為105.0CCID50/ml；(3)病毒的滅活與裂解及純化分離收穫病毒液經滴度測定及無菌檢測後，按1∶2000(V/V)加入福馬林原液，37℃滅活7天，第一天內每隔2小時取樣，第二天開始每天取樣，測定病毒滅活曲線；7天後，滅活病毒經過濾濃縮，在原體積基礎上濃縮100倍，按TritonX-100 2％，SDS1％的比例，加入滅活病毒液，室溫作用2小時；處理後滅活病毒液由Sapharose4B柱過濾，其病毒裂解產物分離，經血凝實驗分析，確定取分離樣品，經PAGE-SDS(12％)電泳分析，及Western blot，綜合血凝實驗分析，確定該分離組份包括兩個主要抗原成分，據其分子量大小，可判定為HN和NP兩個抗原成分；該抗原組份在測定蛋白質含量後作為半成品疫苗；(4)腮腺炎病毒實驗性疫苗的製備根據半成品疫苗蛋白濃度，以生理鹽水稀釋至100μl/ml，同時配製10.87mg/ml濃度的Al(OH)3，二者以對倍(V/V)混合，製成實驗性組份疫苗，即為所需的人用腮腺炎病毒組份疫苗。
3.權利要求2所述的人用腮腺炎病毒組份疫苗的製備方法在製備副粘病毒組份疫苗中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種人用腮腺炎病毒組份疫苗及其製備方法和應用。該疫苗採用常規方法從感染腮腺炎病毒的人體內分離到一株腮腺炎病毒；該病毒經適應於Vero細胞培養後，可在該細胞內穩定生長，並達到10
文檔編號A61P31/00GK1843507SQ20061001068
公開日2006年10月11日 申請日期2006年2月14日 優先權日2006年2月14日
發明者李琦涵, 馬紹輝, 劉龍丁, 梁燕, 王麗春, 董承紅, 姜莉, 施海晶, 趙紅玲, 王晶晶, 廖芸, 納銳雄 申請人:中國醫學科學院醫學生物學研究所