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一種可用於組織工程皮膚生物支架的脫細胞羊膜的製備方法與流程

2023-12-09 03:32:16


本發明涉及醫用材料
技術領域:
,具體涉及一種可用於組織工程皮膚生物支架的脫細胞羊膜的製備方法。
背景技術:
:皮膚作為人體最大的組織,是與外界環境接觸的屏障,當由於外界損傷或疾病等因素造成皮膚缺損時,常常造成創面水分、電解質及蛋白質的丟失。自體斷層皮片移植是公認的標準療法。但是在大面積皮膚缺損患者,仍存在著供區不足及造成機體新的損傷等缺陷。因此,尋找一種理想的皮膚代用品一直是臨床上一個急需解決的難題。隨著組織工程學的飛速發展,使在體外構建組織工程皮膚成為可能。構建組織工程皮膚所需的生物支架一直是的一個重點和熱點。理想的支架應具有以下特點:良好的生物相容性、一定的機械強度、易降解等。羊膜是胎盤上最靠近胎兒的一種薄膜狀組織,這種半透明薄膜由單層立方上皮較厚的基底膜以及一層無血管的間質組成,上皮細胞層含有羊膜上皮細胞和多種生長因子,具有促進細胞生長的作用。目前羊膜作為皮膚組織修復材料,常用的技術為新鮮羊膜或深低溫冷凍羊膜,但仍存在異體細胞引入免疫原性以及保存不便無法隨用隨取等特點。因此以脫細胞羊膜這種天然的細胞外基質皮膚修復材料作為組織工程產品已經成為重要的產品化策略之一。但是,目前現有的脫細胞羊膜製備方法普遍關注羊膜基質的完整程度,而忽略了脫細胞羊膜的細胞因子的含量,而這些細胞因子的存在能夠更好地促進上皮形成、增生,使傷口快速癒合。技術實現要素:有鑑於此,本發明的目的在於提供一種可用於組織工程皮膚生物支架的脫細胞羊膜的製備方法,使得所述製備方法能夠保證脫細胞羊膜基質的完整性以及較佳的細胞相容性,並具有較高含量的細胞因子(如egf、fgf和hgf等)。為了實現上述目的,本發明提供如下技術方案:一種可用於組織工程皮膚生物支架的脫細胞羊膜的製備方法,包括:步驟1、對羊膜進行漂洗消毒,然後浸泡於dmem和甘油中-80℃保存6個月;步驟2、將浸泡的羊膜從-80℃到37℃反覆凍融2~4次,然後將dmem和甘油洗去在trypsin-edta中過夜孵育;步驟3、用含有血清的dmem對孵育的羊膜進行終止消化,之後用pbs衝洗,凍幹後獲得脫細胞羊膜。針對現有脫細胞羊膜製備方法缺少對羊膜細胞因子考量的缺陷,本發明以dmem和甘油作為承載基質,採用反覆凍融和胰酶細胞消化液結合的方式,實現脫細胞羊膜基質的完整性、並提高了羊膜中細胞因子的含量。作為優選,步驟1所述漂洗消毒為:用pbs反覆漂洗多遍後,用抗生素溶液浸泡5分鐘,然後pbs浸泡10分鐘,如此浸泡重複3次。其中,抗生素溶液可選自青黴素溶液、鏈黴素和兩性黴素b等抗生素,在本發明具體實施過程中,所述抗生素溶液為100-200u的青黴素、鏈黴素或阿奇黴素。作為優選,步驟1所述dmem和甘油體積比為1:(1~5),在本發明具體實施過程中,dmem和甘油體積比為1:1、1:2.5或1:5。作為優選,步驟2所述trypsin-edta中胰酶質量濃度為0.1%~0.5%,在本發明具體實施過程中,所述質量濃度可以為0.1%、0.25%或0.5%。作為優選,步驟3所述血清為胎牛血清。作為優選,步驟3所述血清的體積濃度為5%。在一般的脫細胞羊膜製備中,採用胰酶細胞消化液處理的時間都較短,這是出於對羊膜基質完整性的考慮,防治其被胰酶降解,本發明出於對細胞因子含量和羊膜基質完整性綜合考量,在反覆凍融後延長胰酶消化時間(過夜孵育,一般可指代10-12小時),達到了預期的目的。此外,本發明製備方法還包括從胎盤剝離羊膜的步驟:取胎盤並經血清檢測排除病毒和細菌感染,如排除hiv,梅毒,hbv和hcv等感染,在無菌條件下從胎盤的內層剝下羊膜,放置到無菌生理鹽水中,反覆衝洗除去羊膜表面的血跡,並用鑷子鈍性去除羊膜的絨毛膜,獲得羊膜。其中,胎盤的經過合法途徑和正規來源獲得,並經過產婦同意。按照本發明製備方法獲得的脫細胞羊膜與製備前的新鮮羊膜相比,在完全去除上皮細胞的同時,基本保留了基底膜的完整結構,基質也未受影響;egf、fgf和hgf三種細胞因子的含量也顯著高於其他對照的製備方法。同時,所製備的脫細胞羊膜無毒性,具備較佳的細胞相容性。由以上技術方案可知,本發明將反覆凍融的物理脫細胞方法和胰酶消化的化學脫細胞方法相結合,並調整各工藝步驟相適應,促使羊膜中的細胞被高效徹底地去除且避免機械性損傷,同時保留了羊膜中較多的細胞因子。附圖說明圖1所示為脫細胞羊膜前後基底膜結構的變化電鏡圖;a為未脫細胞羊膜基底膜結構;b為脫細胞羊膜基底膜結構。具體實施方式本發明公開了一種可用於組織工程皮膚生物支架的脫細胞羊膜的製備方法,本領域技術人員可以借鑑本文內容,適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是,所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的,它們都被視為包括在本發明。本發明所述製備方法已經通過較佳實施例進行了描述,相關人員明顯能在不脫離本
發明內容、精神和範圍內對本文所述的方法進行改動或適當變更與組合,來實現和應用本發明技術。以下就本發明所提供的一種可用於組織工程皮膚生物支架的脫細胞羊膜的製備方法做進一步說明。實施例1:製備脫細胞羊膜取胎盤並經血清檢測排除hiv,梅毒,hbv和hcv等感染。在無菌條件下從胎盤的內層剝下羊膜,放置到無菌生理鹽水中,反覆衝洗除去羊膜表面的血跡,並用鑷子鈍性去除羊膜的絨毛膜。將羊膜用ph=6.5-7.0的pbs反覆漂洗多遍後,用100u的青黴素浸泡5分鐘,pbs浸泡10分鐘,此浸泡過程重複3次;pbs重新衝洗後將羊膜放入含dmem:甘油=1:1的溶液中,-80℃條件下儲存6個月;檢測無病毒感染的羊膜,從-80℃到37℃反覆凍融3次,這個過程完成後,羊膜4℃在0.25%trypsin-edta中過夜孵育約12h左右;用含有5%的胎牛血清的dmem對其進行終止消化,之後用pbs衝洗三次,然後凍幹、輻照常溫保存。實施例2:製備脫細胞羊膜取胎盤並經血清檢測排除hiv,梅毒,hbv和hcv等感染。在無菌條件下從胎盤的內層剝下羊膜,放置到無菌生理鹽水中,反覆衝洗除去羊膜表面的血跡,並用鑷子鈍性去除羊膜的絨毛膜。將羊膜用ph=6.5-7.0的pbs反覆漂洗多遍後,用200u的鏈黴素浸泡5分鐘,pbs浸泡10分鐘,此浸泡過程重複3次;pbs重新衝洗後將羊膜放入含dmem:甘油=1:2.5的溶液中,-80℃條件下儲存6個月;檢測無病毒感染的羊膜,從-80℃到37℃反覆凍融2次,這個過程完成後,羊膜4℃在0.5%trypsin-edta中過夜孵育約12h左右;用含有5%的胎牛血清的dmem對其進行終止消化,之後用pbs衝洗三次,然後凍幹、輻照常溫保存。實施例3:製備脫細胞羊膜取胎盤並經血清檢測排除hiv,梅毒,hbv和hcv等感染。在無菌條件下從胎盤的內層剝下羊膜,放置到無菌生理鹽水中,反覆衝洗除去羊膜表面的血跡,並用鑷子鈍性去除羊膜的絨毛膜。將羊膜用ph=6.5-7.0的pbs反覆漂洗多遍後,用150u的阿奇黴素浸泡5分鐘,pbs浸泡10分鐘,此浸泡過程重複3次;pbs重新衝洗後將羊膜放入含dmem:甘油=1:5的溶液中,-80℃條件下儲存6個月;檢測無病毒感染的羊膜,從-80℃到37℃反覆凍融4次,這個過程完成後,羊膜4℃在0.1%trypsin-edta中過夜孵育約12h左右;用含有5%的胎牛血清的dmem對其進行終止消化,之後用pbs衝洗三次,然後凍幹、輻照常溫保存。實施例4:脫細胞羊膜與製備前新鮮羊膜的結構對比將實施例1中用於製備的新鮮羊膜和製備後的脫細胞羊膜在電鏡下觀察拍照。見圖1。完整羊膜上皮細胞的基底面通過大量的半橋粒結構緊密連接在基底膜表面。圖1中用於製備的新鮮羊膜基質的結構完整性並未受影響,間質網狀膠原纖維緻密,排列整齊;脫細胞羊膜在完全去除上皮細胞的同時,基本保留了基底膜的完整結構,基質也未受影響。此外,實施例2和實施例3的對比結果也顯示,本發明製備的脫細胞羊膜基本保留了基底膜的完整結構,基質也未受影響。實施例5:不同工藝的脫細胞羊膜的細胞因子含量對比實驗組1-3為本發明實施例1-3製備的脫細胞羊膜,實驗組4為0.25%胰酶+0.2%edta處理羊膜,實驗組5為0.25%胰酶處理的羊膜,實驗組6為0.2%edta處理的羊膜,實驗組7為-80℃到37℃反覆凍融處理的羊膜,實驗組8為羊膜經0.25%trypsin-edta處理,然後-80℃到37℃反覆凍融;實驗組4-8其他操作均參照實施例1製備方法。將各組處理的羊膜,放於細胞培養皿中,加入適量的無血清培養基,在細胞培養相中靜置7d,收集浸提培養液並用0.22μm濾器過濾消毒。用elisa試劑盒檢測egf、fgf、hgf含量。結果見表1。表1羊膜脫細胞後細胞生長因子含量的檢測從表1可以看出,實驗組1-3中的羊膜所含有的細胞因子egf、fgf、hgf含量均高於實驗組4-8(p<0.05),說明本發明製備方法獲得的脫細胞羊膜能夠保留更多的細胞因子。實施例6:脫細胞羊膜細胞毒性和細胞相容性檢測1、脫細胞羊膜的毒性檢測1)將實施例1-3脫細胞羊膜(實驗組1-3),置含血清的培養基中,37℃下靜置24h集浸提培養液並用0.22μm濾器過濾消毒。2)將小鼠成纖維細胞以1×104cells/孔的濃度種植到96孔板中,待細胞完全貼壁後換成浸提培養液培養48h。3)陽性對照組為5g/l的苯酚,陰性對照組為高濃度的聚乙烯瓶;兩組的處理同實驗組。4)cck-8檢測法測定96孔板中成纖維細胞的活性,並用分光光度計讀取450nm的吸光度(od450nm)。5)結果見表2。表2脫細胞羊膜的細胞毒性檢測組別od值rgr(%)細胞毒性計分陰性對照組0.894897.20陽性對照組0.0191.33脫細胞羊膜浸提液組10.867696.540脫細胞羊膜浸提液組20.855895.770脫細胞羊膜浸提液組30.824592.560從表2中可以看出實驗組處理的羊膜無毒性,可以初步判定可以用於組織工程支架材料。2、脫細胞羊膜的細胞相容性檢測將實施例1-3脫細胞羊膜(實驗組1-3),製成與96孔板大小,至於96孔板中使其緊貼底部,加入5×104cells/孔的表皮細胞血液。以只培養表皮細胞為對照組,分別培養2、4、6、8天。用cck-8劑盒檢測吸光度,測得的值與細胞增殖率呈正比例關係。結果見表3。表3脫細胞羊膜的細胞相容性檢測組別2d4d6d8d對照組0.1880.3850.4570.568實驗組10.1880.4020.4680.584實驗組20.1850.4040.4600.578實驗組30.1790.4110.4670.582從表3中可以看出實驗組中表皮細胞的增殖率與對照組相比無明顯差異,說明本發明製備的脫細胞羊膜適於皮膚種子細胞表皮細胞的生長而且還具有一定的促進作用。以上所述僅是本發明的優選實施方式,應當指出,對於本
技術領域:
的普通技術人員來說,在不脫離本發明原理的前提下,還可以做出若干改進和潤飾,這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。當前第1頁12

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