基於彈性蛋白酶螢光底物檢測乳腺癌腫瘤標誌物CA153的酶聯免疫試劑盒製備方法與流程
2023-12-09 04:48:01 1
本發明涉及疾病檢測技術領域，更具體的是涉及一種基於彈性蛋白酶螢光底物檢測乳腺癌腫瘤標誌物CA153的酶聯免疫試劑盒製備方法。
背景技術：
目前乳腺癌已成為威脅女性身心健康的常見腫瘤。全球乳腺癌發病率自20世紀70年代末開始一直呈上升趨勢。美國8名婦女一生中就會有1人患乳腺癌。據國家癌症中心和衛生部疾病預防控制局2012年公布的2009年乳腺癌發病數據顯示：全國腫瘤登記地區乳腺癌發病率位居女性惡性腫瘤的第1位，女性乳腺癌發病率(粗率)全國合計為42.55/10萬，城市為51.91/10萬，農村為23.12/10萬。乳腺癌已成為當前社會的重大公共衛生問題。自20世紀90年代全球乳腺癌死亡率呈現出下降趨勢；究其原因，一是乳腺癌篩查工作的開展，使早期病例的比例增加；二是乳腺癌綜合治療的開展，提高了療效。CA15-3是乳腺癌的最重要的特異性標誌物。30％-50％的乳腺癌患者的CA15-3明顯升高，其含量的變化與治療效果密切相關，是乳腺癌患者診斷和監測術後復發、觀察療效的最佳指標。CA15-3動態測定有助於II期和III期乳腺癌病人治療後復發的早期發現；當CA15-3大於100U/ml時，可認為有轉移性病變。
免疫螢光技術(Immunofluorescence technique)又稱螢光抗體技術，是標記免疫技術中發展最早的一種。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質結合，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內抗原物質的定位。由於抗原抗體反應具有高度的特異性，所以當抗原抗體發生反應時，只要知道其中的一個因素，就可以查出另一個因素。免疫螢光技術就是將不影響抗原抗體活性的螢光色素標記在抗體(或抗原)上，與其相應的抗原(或抗體)結合後，在螢光顯微鏡下呈現一種特異性螢光反應。
彈性蛋白酶(Elastase)螢光底物(CBZ-Ala-Ala-Ala-Ala)2-R110是一種雙醯胺衍生物的羅丹明110(Rhodamine110)分子探針，是一個敏感的和有選擇性的測定蛋白酶在溶液中或在活細胞內底物。這些螢光底物含有一種胺基酸或肽共價連接到每個Rhodamine110的氨基，酶裂解後，非螢光雙醯胺底物首先轉化為弱螢光單醯胺，然後轉化為強螢光的Rhodamine110，螢光會進一步增加。由於Rhodamine110具有較大的消光係數，所以實驗的信噪比很高。此外，相比於普通的螢光素而言，Rhodamine110的螢光在pH3-9之間會保持穩定。目前螢光檢測因具有優異的光學性質已經被廣泛應用於示蹤、成像以及標記等方面，而ELISA則因為它的靈敏度高、特異性強等優點在檢測領域處於特殊重要的地位。所以本文擬研製基於彈性蛋白酶螢光底物檢測乳腺癌腫瘤標誌物CA153的酶聯免疫試劑盒，對乳腺癌腫瘤標誌物CA153進行檢測。
技術實現要素：
鑑於蛋白標誌物在腫瘤檢測中的重要地位、螢光檢測獨特的光學性質以及酶聯免疫檢測技術的優勢。我們將結合酶聯免疫檢測和螢光檢測兩種技術，利用彈性蛋白酶和腫瘤標誌物相應抗體Ab2製得檢測探針。探針、腫瘤標誌物和包埋在酶聯免疫ELISA試劑盒的另一種腫瘤標誌物抗體Ab1通過抗體抗原之間的作用，形成一種類似夾心的結構，最後通過酶和螢光底物的作用產生螢光，對CA153這種乳腺癌相關腫瘤標誌物進行定性定量的檢測，建立蛋白標誌物檢測的新方法，極大程度提高了檢測靈敏度。
本發明製備的基於彈性蛋白酶螢光底物檢測乳腺癌腫瘤標誌物CA153的酶聯免疫試劑盒，其特徵是選用彈性蛋白酶螢光底物(CBZ-Ala-Ala-Ala-Ala)2-R110特異性降解產生的螢光對乳腺癌腫瘤標誌物CA153進行定量檢測，其結構式如下：
本發明的技術方案如下：
一種基於彈性蛋白酶螢光底物檢測乳腺癌腫瘤標誌物CA153的酶聯免疫試劑盒；其步驟如下：
1)將新配製的高碘酸鈉NalO4溶液加入到彈性蛋白酶Elastase溶液中，室溫下避光攪拌後，用醋酸鹽緩衝液透析過夜處理，通過加入碳酸鹽緩衝液使體系pH達到9.0～9.3，立即加入CA153標記抗體Ab2，室溫下避光攪拌後加入少量硼氫化鈉NaBH4充分反應後用PBS緩衝液透析過夜，得到酶聯檢測探針Elastase-Ab2；
2)將CA153包被抗體Ab1加入96孔酶標板，靜置過夜處理後用洗滌緩衝液衝洗96孔酶標板，加入BSA封閉處理後再次用洗滌緩衝液衝洗96孔酶標板，之後加入標準CA153抗原或病人樣本緩慢搖晃孵育，用洗滌緩衝液衝洗96孔酶標板，加入上述酶聯檢測探針Elastase-Ab1，用洗滌緩衝液衝洗96孔酶標板，最後加入胰蛋白酶螢光底物(CBZ-Ala-Ala-Ala-Ala)2-R110，用螢光酶標儀讀取96孔酶標板螢光強度值。
所述醋酸鹽緩衝液是0.01M pH4.4的緩衝液；碳酸鹽緩衝液是0.2M pH9.5的緩衝液；PBS緩衝液是0.15M pH7.4的緩衝液。
所述彈性蛋白酶：高碘酸鈉質量比為1:0.8～1.2；彈性蛋白酶：CA153標記抗體質量比為1:1～5；彈性蛋白酶：硼氫化鈉質量比為15:1。
所述CA153包被抗體Ab1濃度為10～50μg/mL。
所述洗滌緩衝液是含有0.05～0.5％Tween-20的0.01M pH7.4的PBS緩衝液。
所述檢測原理是根據胰蛋白酶螢光底物(CBZ-Ala-Ala-Ala-Ala)2-R110降解產生的螢光強度值和CA153標準抗原濃度之間的關係建立標準曲線，定性定量檢測卵巢癌腫瘤標誌物CA125。
通過高碘酸鈉NalO4作用將CA153記抗體Ab2和彈性蛋白酶Elastase連接，得到酶聯檢測探針Elastase-Ab2。將CA153包被抗體Ab1加入96孔酶標板，4℃過夜後用洗滌緩衝液洗滌96孔酶標板，加入BSA 37℃封閉處理後用洗滌緩衝液洗滌96孔酶標板，在96孔酶標板加入待檢樣品37℃下反應後用洗滌緩衝液洗滌96孔酶標板，加入上述Elastase-Ab2檢測探針37℃下反應後用洗滌緩衝液洗滌96孔酶標板，加入彈性蛋白酶螢光底物(CBZ-Ala-Ala-Ala-Ala)2-R110，最後用螢光酶標儀讀數。如果檢測樣品有CA153抗原Ag存在，探針Elastase-Ab2、CA153抗原Ag和包埋在96孔酶標板上的CA153包被抗體Ab1通過抗體抗原之間的作用，形成一種類似夾心的結構Elastase-Ab2-Ag-Ab1，此時彈性蛋白酶螢光底物(CBZ-Ala-Ala-Ala-Ala)2-R110在酶的作用下降解產生螢光；如果檢測樣品沒有CA153抗原Ag存在，則96孔酶標板的檢測探針Elastase-Ab2將被洗滌緩衝液清洗，此時彈性蛋白酶螢光底物(CBZ-Ala-Ala-Ala-Ala)2-R110不會降解，沒有螢光出現。在96孔酶標板上加入不同濃度的標準CA153抗原，建立標準曲線，定性定量檢測乳腺癌腫瘤標誌物CA153。
本發明製備的基於彈性蛋白酶螢光底物檢測乳腺癌腫瘤標誌物CA153的酶聯免疫試劑盒優勢在於：
1.採用彈性蛋白酶螢光底物(CBZ-Ala-Ala-Ala-Ala)2-R110這種具有優異的光學性質的雙醯胺衍生物的羅丹明110(R110)分子探針，由於Rhodamine110具有較大的消光係數，所以實驗的信噪比很高。此外，相比於普通的螢光素而言，Rhodamine110的螢光在pH3-9之間會保持穩定。
2.採用酶聯免疫檢測ELISA這種具有靈敏度高、特異性強等優點的傳統檢測技術，有利於提高檢測效率。
3.採用高碘酸鈉NalO4作用將CA153記抗體Ab2和彈性蛋白酶Elastase連接得到酶聯檢測探針Elastase-Ab2，夾心結構降解螢光底物產生的螢光強度，定性定量檢測乳腺癌腫瘤標誌物CA153，有效地降低了檢測螢光背景。
如圖1所示，彈性蛋白酶螢光底物(CBZ-Ala-Ala-Ala-Ala)2-R110酶裂解後，非螢光雙醯胺底物率先轉化為一對弱螢光的單醯胺，然後轉化為強螢光的Rhodamine110，螢光進一步增加，實現超靈敏檢測。如圖2所示，根據加入不同濃度標準CA153抗原所得螢光強度，建立標準曲線可知本發明製備的彈性蛋白酶螢光底物檢測乳腺癌腫瘤標誌物CA153的酶聯免疫試劑盒檢測靈敏度較高，達到1*10-10U/mL；圖3根據加入不同抗原，可知本發明製備的彈性蛋白酶螢光底物檢測乳腺癌腫瘤標誌物CA153的酶聯免疫試劑盒特異性很好。
附圖說明
圖1本發明製備的基於彈性蛋白酶螢光底物檢測乳腺癌腫瘤標誌物CA153的酶聯免疫試劑盒底物降解示意圖。
圖2本發明製備的基於彈性蛋白酶螢光底物檢測乳腺癌腫瘤標誌物CA153的酶聯免疫試劑盒標準曲線及紫外照片。
圖3本發明製備的基於彈性蛋白酶螢光底物檢測乳腺癌腫瘤標誌物CA153的酶聯免疫試劑盒特異性曲線及紫外照片。
具體實施方式
下面的實施案例中將對本發明作進一步的闡述，但本發明不限於此。
實施案例1：
1)將新配製的0.2mL高碘酸鈉NalO4溶液(21.39mg/mL)加入到1mL彈性蛋白酶Elastase溶液(5mg/mL)中，室溫下避光攪拌20min後，用1mM PH4.4醋酸鹽緩衝液透析過夜處理，通過加入20μL 0.2M PH9.5碳酸鹽緩衝液使體系pH達到9.0～9.3，立即加入10mg CA153標記抗體Ab2，室溫下避光攪拌2h後加入0.1mL硼氫化鈉NaBH4(4mg/mL)充分反應後用0.15M PH7.4PBS緩衝液透析過夜，得到酶聯檢測探針Elastase-Ab2；
2)將100μL CA153包被抗體Ab1(24μg/mL)加入96孔酶標板，4℃靜置過夜處理後用洗滌緩衝液衝洗96孔酶標板，加入300μL BSA(10mg/mL)37℃封閉1h處理後再次用洗滌緩衝液衝洗96孔酶標板，之後加入100μL CA153標準抗原緩慢搖晃孵育，用洗滌緩衝液衝洗96孔酶標板，加入100μL上述酶聯檢測探針Elastase-Ab2稀釋液，用洗滌緩衝液衝洗96孔酶標板，最後加入100μL彈性蛋白酶螢光底物(CBZ-Ala-Ala-Ala-Ala)2-R110，用螢光酶標儀讀取96孔酶標板螢光強度值。
實施案例2：
2)將新配製的0.2mL高碘酸鈉NalO4溶液(20mg/mL)加入到1mL彈性蛋白酶Elastase溶液(5mg/mL)中，室溫下避光攪拌20min後，用1mM PH4.4醋酸鹽緩衝液透析過夜處理，通過加入20μL 0.2M PH9.5碳酸鹽緩衝液使體系pH達到9.0～9.3，立即加入10mg CA153標記抗體Ab2，室溫下避光攪拌2h後加入0.1mL硼氫化鈉NaBH4(4mg/mL)充分反應後用0.15M PH7.4PBS緩衝液透析過夜，得到酶聯檢測探針Elastase-Ab2；
2)將100μL CA153包被抗體Ab1(24μg/mL)加入96孔酶標板，4℃靜置過夜處理後用洗滌緩衝液衝洗96孔酶標板，加入300μL BSA(10mg/mL)37℃封閉1h處理後再次用洗滌緩衝液衝洗96孔酶標板，之後加入100μL CA153標準抗原緩慢搖晃孵育，用洗滌緩衝液衝洗96孔酶標板，加入100μL上述酶聯檢測探針Elastase-Ab2稀釋液，用洗滌緩衝液衝洗96孔酶標板，最後加入100μL彈性蛋白酶螢光底物(CBZ-Ala-Ala-Ala-Ala)2-R110，用螢光酶標儀讀取96孔酶標板螢光強度值。
實施案例3：
3)將新配製的0.2mL高碘酸鈉NalO4溶液(30mg/mL)加入到1mL彈性蛋白酶Elastase溶液(5mg/mL)中，室溫下避光攪拌20min後，用1mM PH4.4醋酸鹽緩衝液透析過夜處理，通過加入20μL 0.2M PH9.5碳酸鹽緩衝液使體系pH達到9.0～9.3，立即加入10mg CA153標記抗體Ab2，室溫下避光攪拌2h後加入0.1mL硼氫化鈉NaBH4(4mg/mL)充分反應後用0.15M PH7.4PBS緩衝液透析過夜，得到酶聯檢測探針Elastase-Ab2；
2)將100μL CA153包被抗體Ab1(24μg/mL)加入96孔酶標板，4℃靜置過夜處理後用洗滌緩衝液衝洗96孔酶標板，加入300μL BSA(10mg/mL)37℃封閉1h處理後再次用洗滌緩衝液衝洗96孔酶標板，之後加入100μL CA153標準抗原緩慢搖晃孵育，用洗滌緩衝液衝洗96孔酶標板，加入100μL上述酶聯檢測探針Elastase-Ab2稀釋液，用洗滌緩衝液衝洗96孔酶標板，最後加入100μL彈性蛋白酶螢光底物(CBZ-Ala-Ala-Ala-Ala)2-R110，用螢光酶標儀讀取96孔酶標板螢光強度值。
實施案例4：
4)將新配製的0.2mL高碘酸鈉NalO4溶液(21.39mg/mL)加入到1mL彈性蛋白酶Elastase溶液(5mg/mL)中，室溫下避光攪拌20min後，用1mM PH4.4醋酸鹽緩衝液透析過夜處理，通過加入20μL 0.2M PH9.5碳酸鹽緩衝液使體系pH達到9.0～9.3，立即加入5mg CA153標記抗體Ab2，室溫下避光攪拌2h後加入0.1mL硼氫化鈉NaBH4(4mg/mL)充分反應後用0.15M PH7.4PBS緩衝液透析過夜，得到酶聯檢測探針Elastase-Ab2；
2)將100μL CA153包被抗體Ab1(10μg/mL)加入96孔酶標板，4℃靜置過夜處理後用洗滌緩衝液衝洗96孔酶標板，加入300μL BSA(10mg/mL)37℃封閉1h處理後再次用洗滌緩衝液衝洗96孔酶標板，之後加入100μL CA153標準抗原緩慢搖晃孵育，用洗滌緩衝液衝洗96孔酶標板，加入100μL上述酶聯檢測探針Elastase-Ab2稀釋液，用洗滌緩衝液衝洗96孔酶標板，最後加入100μL彈性蛋白酶螢光底物(CBZ-Ala-Ala-Ala-Ala)2-R110，用螢光酶標儀讀取96孔酶標板螢光強度值。
實施案例5：
5)將新配製的0.2mL高碘酸鈉NalO4溶液(21.39mg/mL)加入到1mL彈性蛋白酶Elastase溶液(5mg/mL)中，室溫下避光攪拌20min後，用1mM PH4.4醋酸鹽緩衝液透析過夜處理，通過加入20μL 0.2M PH9.5碳酸鹽緩衝液使體系pH達到9.0～9.3，立即加入25mg CA153標記抗體Ab2，室溫下避光攪拌2h後加入0.1mL硼氫化鈉NaBH4(4mg/mL)充分反應後用0.15M PH7.4PBS緩衝液透析過夜，得到酶聯檢測探針Elastase-Ab2；
2)將100μL CA153包被抗體Ab1(50μg/mL)加入96孔酶標板，4℃靜置過夜處理後用洗滌緩衝液衝洗96孔酶標板，加入300μL BSA(10mg/mL)37℃封閉1h處理後再次用洗滌緩衝液衝洗96孔酶標板，之後加入100μL CA153標準抗原緩慢搖晃孵育，用洗滌緩衝液衝洗96孔酶標板，加入100μL上述酶聯檢測探針Elastase-Ab2稀釋液，用洗滌緩衝液衝洗96孔酶標板，最後加入100μL彈性蛋白酶螢光底物(CBZ-Ala-Ala-Ala-Ala)2-R110，用螢光酶標儀讀取96孔酶標板螢光強度值。
實施案例6：
1)將新配製的0.2mL高碘酸鈉NalO4溶液(20mg/mL)加入到1mL彈性蛋白酶Elastase溶液(5mg/mL)中，室溫下避光攪拌20min後，用1mM PH4.4醋酸鹽緩衝液透析過夜處理，通過加入20μL 0.2M PH9.5碳酸鹽緩衝液使體系pH達到9.0～9.3，立即加入10mg CA153標記抗體Ab2，室溫下避光攪拌2h後加入0.1mL硼氫化鈉NaBH4(4mg/mL)充分反應後用0.15M PH7.4PBS緩衝液透析過夜，得到酶聯檢測探針Elastase-Ab2；
2)將100μL CA153包被抗體Ab1(24μg/mL)加入96孔酶標板，4℃靜置過夜處理後用洗滌緩衝液衝洗96孔酶標板，加入300μL BSA(10mg/mL)37℃封閉1h處理後再次用洗滌緩衝液衝洗96孔酶標板，之後每孔加入100μL CA153標準抗原的濃度分別為100U/mL、10U/mL、1U/mL、0.1U/mL、0.01U/mL、0.001U/mL、0.0001U/mL、0U/mL，緩慢搖晃孵育，用洗滌緩衝液衝洗96孔酶標板，加入100μL上述酶聯檢測探針Elastase-Ab2稀釋液，用洗滌緩衝液衝洗96孔酶標板，最後加入100μL彈性蛋白酶螢光底物(CBZ-Ala-Ala-Ala-Ala)2-R110，用螢光酶標儀讀取96孔酶標板螢光強度值。建立標準曲線。
實施案例7：
1)將新配製的0.2mL高碘酸鈉NalO4溶液(20mg/mL)加入到1mL彈性蛋白酶Elastase溶液(5mg/mL)中，室溫下避光攪拌20min後，用1mM PH4.4醋酸鹽緩衝液透析過夜處理，通過加入20μL 0.2M PH9.5碳酸鹽緩衝液使體系pH達到9.0～9.3，立即加入10mg CA153標記抗體Ab2，室溫下避光攪拌2h後加入0.1mL硼氫化鈉NaBH4(4mg/mL)充分反應後用0.15M PH7.4PBS緩衝液透析過夜，得到酶聯檢測探針Elastase-Ab2；
2)將100μL CA153包被抗體Ab1(24μg/mL)加入96孔酶標板，4℃靜置過夜處理後用洗滌緩衝液衝洗96孔酶標板，加入300μL BSA(10mg/mL)37℃封閉1h處理後再次用洗滌緩衝液衝洗96孔酶標板，之後每孔分別加入100μL HCG、BSA、PBS、CEA、CA125、AFP、PSA、CA153抗原，緩慢搖晃孵育，用洗滌緩衝液衝洗96孔酶標板，加入100μL上述酶聯檢測探針Elastase-Ab2稀釋液，用洗滌緩衝液衝洗96孔酶標板，最後加入100μL彈性蛋白酶螢光底物(CBZ-Ala-Ala-Ala-Ala)2-R110，用螢光酶標儀讀取96孔酶標板螢光強度值。建立非特異性吸附曲線。