一種脂質體中磷脂含量的測定方法
2023-11-08 03:35:57 2
專利名稱：：一種脂質體中磷脂含量的測定方法
技術領域：
：本發明涉及一種藥物載體的質量控制方法，具體地說是脂質體中磷脂含量的測定方法。
背景技術：
：脂質體是由磷脂雙層構成的具有水相內核的脂質微囊。由於其具有緩釋、低毒及組織靶向性等特點，目前已應用於包載藥物、基因轉移等許多方面。磷脂是脂質體的重要組分之一。其易發生水解和氧化，水解會導致脂質體中包封藥物的滲漏，而氧化產生的氧化反應對人體有一定得毒性。因此測定磷脂含量是衡量脂質體穩定性一項重要指標。目前測定磷脂含量的方法，主要有高效液相色普法、鉬藍比色法、釩鉬酸鹽紫外分光光度法、螢光法、硫氰鐵銨顯色法。但現有文獻所公開的內容一般均是從檢測原理上進行總的論述與探討。故其所述方法專屬性差，精確度低。而在實際應用中，通常對特定磷脂的檢測需要有特定的檢測方法。CN1358997提供了一種針對血清高密度脂蛋白磷脂及低密度脂蛋白磷脂的測定方法；研究者白研提供了一種對廣東德慶何首烏中卵磷脂含量進行測定的方法(廣東藥學(2004)第14巻第5期第3頁)。李寶齊提供了一種測定脂質體凝膠劑中磷脂含量的方法(中國藥劑學雜誌(2005)第3巻第5期)，該方法是將樣品用硝酸、高氯酸消化，調pH值後，加入鉬藍法顯色劑，在830nm測定吸收度，經計算得脂質體凝膠劑中磷脂的含量。該方法雖然是針對脂質體中磷脂特別設計的檢測方法，但其顯色試劑溶液配比不合理，顯色結果差；且所用試劑種類多、操作步驟複雜。在檢測過程中還需電爐加熱，溫度不易控制，同時易產生爆沸現象。
發明內容本發明的目的就是要提供一種準確性高，且安全、簡便、易操作的針對脂質體中磷脂進行含量測定的新方法。本發明目的是這樣實現的本發明所提供的脂質體中磷脂含量的測定方法，包括以下步驟a、顯色劑的製備A顯色劑精密稱取0.22克鉬酸銨，用蒸餾水溶解後倒入100毫升的容量瓶中，然後緩慢加入4.72毫升分析純硫酸，放涼後稀釋定容至刻度，並且倒入棕色瓶中冷藏；B顯色劑精密稱取15.00克L-抗壞血酸於燒杯中，用14%Na2S03溶解並定容至100毫升容量瓶中，倒入棕色瓶中冷藏；b、磷標準儲備液的配製精確稱取乾燥的分析純磷酸二氫鉀0.4394克溶解轉移至1000毫升容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻既得100ug.mL—1濃度。c、樣品溶液配製精確吸取1.0ml被測樣品脂質體溶液於10毫升容量瓶中，加水稀釋至刻度；d、標準曲線繪製精密吸取標準儲備液O.l、0.2、0.4、0.6、0.8、l.Oml分別置於試管中，得到質量濃度分別為10、20、40、60、80、100ug.mL—1的標樣，分別加入0.4毫升ION的H2S04和0.1毫升30%H202消化，消化時將該試管放置到預先升溫17(TC並且恆定的多孔恆溫控制箱消化60分鐘；然後取出試管，冷卻後在每個試管中加入9ml蒸餾水，混勻後逐個吸取1.5ml於另一試管，再分別加4.6mlA顯色劑和0.1mlB顯色劑溶液，於IO(TC水浴加熱15分鐘；冷卻後在波長822-830nm處比色測定吸收值，以質量濃度ug.mi;工為橫坐標，吸收值A為縱坐標，繪製標準曲線；e、樣品的含量測定精密吸取製備的樣品溶液0.5ml於15X200mm試管中，依次加入0.4ml濃度為ION硫酸和30%過氧化氫溶液0.1ml消化；消化時將該試管放置到預先升溫恆定的多孔恆溫控制箱中，設定溫度17(TC，加熱時間60分鐘；然後取出試管。冷卻後在每個試管中加入9ml蒸餾水，混旋後逐個吸取1.5ml於另一試管，再分別加4.6mlA顯色劑和0.1mlB顯色劑溶液，於10(TC水浴加熱15分鐘；冷卻後在波長在822-830nm處比色測定樣品的吸收度。將所得樣品吸收度數值代入回歸曲線方程，求出樣品中磷的本發明方法檢測所依據的原理是在一定溫度下的酸性溶液中，磷酸根可與鉬酸根(Mo04)2—絡合，在還原劑作用下生成藍色絡合物(2Mo(V4McA;^H3P04，藍色強度與溶液中的磷酸根呈正比，用分光光度法在最大吸收波長處測定其吸收值，根據標準曲線計算磷含量。本發明的創新之處在於，採用的顯色劑其顯色反應顏色穩定、顯示效果好；所用試劑種類少、方法簡便、易操作，大大提高了測定結果的準確度，也提高了測定結果的精密度；在消化時將試管放置到預先升溫17(TC並且恆定的多孔恆溫控制箱內進行，由此可有效控制溶液的反應溫度，克服了現有方法中易發生的爆沸、蒸乾等現象，同時提高了實驗操作的安全性，減少環境汙染。本發明將測定波長選擇在822nm，進一步提高了該方法檢測的精確度。圖1是文獻方法實驗結果圖圖2是本發明方法試驗結果圖本發明的有益效果通過以下實驗得到了證明精密度試驗試驗方法精密吸取三個不同體積的磷標準儲備液分別置於試管中，得到到一定的質量濃度的標樣，依次加入0.4ml濃度為10N硫酸和30X過氧化氫溶液0.1ml;將該試管放置到預先升溫17(TC並且恆定的多孔恆溫控制箱消化60分鐘；然後取出試管，冷卻後在每個試管中加入9ml蒸餾水，混旋後逐個吸取1.5ml於另一試管，再分別加4.6mlA顯色劑和0.1mlB顯色劑溶液，於IO(TC水浴加熱15分鐘；冷卻後在波長822nm處比色測定吸收值，同時製備5個平行樣品，一個空白對照品，於822nm處同法測定，計算該精密度試驗方法的RSD值為1.08。4具體實驗數據見表1表1精密度實驗結果tableseeoriginaldocumentpage5回收率試驗取三組試驗，分別配製低、中、高三種濃度磷標準儲備液，操作條件與精密度試驗方法相同，於822nm處測定吸收度；如法重複3次取平均值。具體實驗數據見表2表2回收率實驗結果tableseeoriginaldocumentpage5三組試驗回收率為95.1103.2%穩定性試驗試驗操作條件與精密度試驗方法相同，經過在100分鐘內多次測定吸收值，結果基本無變化，說明該方法在加入顯色劑反應生成的絡合物穩定性良好。具體實驗數據見表3表3穩定性實驗結果tableseeoriginaldocumentpage5對比試驗(本發明方法與現有技術對比試驗)現有技術(按照《廣東藥學》廣東德慶何首烏中卵磷值含量測定)重複性測定吸光度值(以標準磷30ppm含量為例)。具體實驗數據見表4、圖l。表4現有技術實驗結果tableseeoriginaldocumentpage6上述表4、圖1可以看出，現有技術測定數據波動性大，數值離散不穩定'本發明方法重複性測定吸光度值(以標準磷30ppm含量為例)。具體實驗數據見表5、圖2。表5本發明方法試驗結果tableseeoriginaldocumentpage6上述表5、圖2可以看出，本發明方法測定數據穩定，數值波動性小，同時計算其標準偏差和變異係數均好於現有技術。由此進一步了證明本發明方法的優越性。具體實施方式實施例採用本發明方法對市售的注射用兩性黴素B脂質體進行脂質體含量測定(l)被測樣品注射用兩性黴素B脂質體(安浮特克)50mg:Uml生產廠家Benvenuelaboratorics.Inc.USA生產批號141087E,141088E,141089E[OO52](2)測定方法a、顯色劑的製備A顯色劑精密稱取0.22克鉬酸銨，用蒸餾水溶解後倒入100毫升的容量瓶中，然後緩慢加入4.72毫升分析純硫酸，放涼後稀釋定容至刻度，並且倒入棕色瓶中冰箱保存；B顯色劑精密稱取15.00克L-抗壞血酸於燒杯中，用14%Na2S03溶解並定容至100毫升容量瓶中，倒入棕色瓶中冰箱保存；b、磷標準儲備液的配製精確稱取經烘箱乾燥的分析純磷酸二氫鉀0.4394克溶解轉移至1000毫升容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻既得lOOug.mL—1濃度。c、樣品溶液配製精確吸取1.0ml被測樣品脂質體溶液於10毫升容量瓶中，加水稀釋至刻度；d、標準曲線繪製精密吸取標準儲備液O.l、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml分別置於試管中，得到質量濃度分別為IO、20、40、60、80、lOOug.mL—1的標樣，分別加入0.4毫升10N的H2SO4和0.1毫升30%H202，將該試管放置到預先升溫17(TC並且恆定的多孔恆溫控制箱消化60分鐘；然後取出試管，冷卻後在每個試管中加入9ml蒸餾水，混旋後逐個吸取1.5ml於另一試管，再分別加4.6mlA顯色劑和0.1mlB顯色劑溶液，於IO(TC水浴加熱15分鐘；冷卻後在波長822nm處比色測定吸收值，以質量濃度ug.mL—1為橫坐標，吸收值A為縱坐標，繪製標準曲線。e、測定方法精密分別吸取上述被測樣品溶液0.5ml於15X200mm試管中，依次加入0.4ml濃度為ION硫酸和30%過氧化氫溶液O.lml;將該試管放置到預先升溫恆定的多孔恆溫控制箱中，設定溫度17(TC，加熱時間60分鐘；然後取出試管。冷卻後在每個試管中加入9ml蒸餾水，混旋後逐個吸取1.5ml於另一試管，再分別加4.6mlA顯色劑和0.1mlB顯色劑溶液，於IO(TC水浴加熱15分鐘；冷卻後在波長在822nm處比色測定樣品的吸收度。將所得樣品吸收度數值代入回歸曲線方程，求出樣品中磷的含量。(3)測定結果tableseeoriginaldocumentpage7權利要求一種脂質體中磷脂含量的測定方法，其特徵在於它包括以下步驟a、顯色劑的製備A顯色劑精密稱取0.22克鉬酸銨，用蒸餾水溶解後倒入100毫升的容量瓶中，然後緩慢加入4.72毫升分析純硫酸，放涼後稀釋定容至刻度，並且倒入棕色瓶中冷藏；B顯色劑精密稱取15.00克L-抗壞血酸於燒杯中，用14％Na2SO3溶解並定容至100毫升容量瓶中，倒入棕色瓶中冷藏；b、磷標準儲備液的配製精確稱取經烘箱乾燥的分析純磷酸二氫鉀0.4394克溶解轉移至1000毫升容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻既得100ug.mL-1濃度；c、樣品溶液配製精確吸取1.0ml被測樣品脂質體溶液於10毫升容量瓶中，加水稀釋至刻度；d、標準曲線繪製精密吸取磷標準儲備液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml分別置於試管中，得到質量濃度分別為10、20、40、60、80、100ug.mL-1的樣品，分別加入0.4毫升10N的H2SO4和0.1毫升30％H2O2消化，將該試管在170℃恆溫60分鐘；冷卻後在每個試管中加入9ml蒸餾水，混勻後逐個吸取1.5ml於另一試管，再分別加4.6mlA顯色劑和0.1mlB顯色劑溶液，於100℃水浴加熱15-20分鐘；冷卻後在波長822-830nm處比色測定吸收值，以質量濃度ug.mL-1為橫坐標，吸收值A為縱坐標，繪製標準曲線；e、樣品的含量測定精密吸取製備的樣品溶液0.5ml於15×200mm試管中，依次加入0.4ml濃度為10N硫酸和30％過氧化氫溶液0.1ml消化；溫度170℃恆溫加熱60分鐘；冷卻後，在每個試管中加入9ml蒸餾水，混勻吸取1.5ml於另一試管，再分別加4.6ml顯色A和0.1ml顯色B溶液，於100℃水浴加熱15分鐘；冷卻後在波長在822-830nm處比色測定吸收度；將所得樣品吸收度數值代入回歸曲線方程，求出樣品中磷的含量。2.根據權利要求1所述的脂質體中磷脂含量的測定方法，其特徵在於所說的消化時將試管放置到預先升溫17(TC並且恆定的多孔恆溫控制箱內進行。3.根據權利要求1或2所述的脂質體中磷脂含量的測定方法，其特徵在於所說的測定吸收度的波長在822nm。全文摘要本發明公開了一種脂質體中磷脂含量的測定方法，它包括以下步驟製備A顯色劑、B顯色劑；配製標準儲備液；配製樣品溶液；繪製標準曲線；進行樣品的含量測定精密吸取製備的脂質體樣品溶液0.5ml於15×200mm試管中，依次加入0.4ml濃度為10N硫酸和30％過氧化氫溶液0.1ml；溫度170℃恆溫加熱60分鐘；冷卻後，在每個試管中加入9ml蒸餾水，混勻吸取1.5ml於另一試管，再分別加4.6ml顯色A和0.1ml顯色B溶液，於100℃水浴加熱15分鐘；冷卻後在波長在822nm處比色測定吸收度；將所得樣品吸收度數值代入回歸曲線方程，求出樣品中磷的含量。本發明方法簡便、易操作，大大提高了測定結果的準確度，也提高了測定結果精密度。文檔編號G01N1/28GK101692038SQ20091007569公開日2010年4月7日申請日期2009年10月14日優先權日2009年10月14日發明者劉浩,劉英華,張永祥,張莉,王永維,陳劍琴,韓新峰申請人:華北製藥凱瑞特藥業有限公司