Rna合成－用於反向合成rna的亞磷醯胺，以及在3』-末端合成rna的配體、發色團和修飾物...的製作方法
2023-11-08 02:24:32
專利名稱：Rna合成－用於反向合成rna的亞磷醯胺，以及在3』-末端合成rna的配體、發色團和修飾物 ...的製作方法
技術領域：
本發明涉及新RNA單體亞磷醯胺的合成，以及相應的適用於RNA寡核苷酸在 5』一 3』反向上合成的新方法的固體載體。本方法導致非常清潔的寡核苷酸的合成，並使得能在3』 -末端清潔地且有效地引入不同的修飾，從而產生高純度治療級的RNA寡核苷酸。
背景技術：
確定序列的RNA在3』 一 5』方向上的合成現在是成熟的，並當前用於多種治療級 RNA適體、tRNA、siRNA和生物上有活性的RNA的合成和開發中。本方法使用具有合適的 N-保護基的核苷一般是5』 -保護基，最常見的是二甲氧基三苯基，即DMT基團；2』 -保護基，其中最常見的是叔丁基二甲基甲矽烷基醚；以及，3』 -亞磷醯胺，其中最常見的是氰乙基二異丙基(組分1)。隨後將該組分與帶有適當的N-保護基的核苷，結合到固體載體上的核苷的2』或3』琥珀酸酯偶聯(組分2)。在活化劑的存在下，在溶液相中也實現了組分 1和5』-OH-正-保護的-2』，3』 -保護的-核苷(組分3)的偶聯，所述活化劑導致二聚和寡聚核苷酸的形成，隨後氧化(3』 一 5』方向的合成)，也導致了具有3』 -5』 -核苷酸間連接體的保護二聚核苷的形成，Ogilvie, K. K.，Can. J. Chem.，58，2686，1980 (方案 1)。然而，據我們所知，尚未實現在反向(5』 -3』方向)上的RNA合成。已經廣泛地開發了組分1的2』 -甲矽烷基醚，並且發現其具有不同尋常的穩定性。廣泛地研究了甲矽烷基醚的溶劑分解作用，並已知大(bulky)的烷基甲矽烷基醚具有高度的穩定性；Bazani, B 禾口 Chvalowski, V Chemistry of Organosilicon compounds, 第1卷，Academic Press, New York, 1965。隨後，Ogilvie及其同事關於將2，-羥基保護基用於寡核苷酸的合成完成了大量的研究工作(Ogilvie，K. K.，Sadana, K. L，Thompson, Ε. Α. ， Quilliam, Μ. Α. ， and Westmore, J. B TetrahedronLe Letters,15，2861-2864,1974 ； Ogilvie, K. K. , Beaucage, S. L, Entwistle, D. W. , Thompson, Ε. Α. , Quilliam, Μ. Α. , and Westmore, J. B. J. Carbohydrate Nucleosides Nucleotides,3,197-227,1976 ；Ogilvie, K. K. Proceedings of the 5th International Round Table on Nucleosides,Nucleotides and Their Biological Applications,Rideout,J. L. , Henry,D. W.,禾口 Beacham L. Μ. ,Ill, eds.，Academic, London，第 209—256 頁，1983)。這些研究隨後導致對於溶液相和固相的寡核苷酸合成都適用的方法，以及對具有tRNA的尺寸和性質的RNA分子的首次化學合成的持續發展(Usman，N.，Ogilvie, K. K.， Jiang, Μ. -Y. ，and Cedergren, R. J. J. Am. Chem. Soc. 109,7845-7854,1987 ；Ogilvie, K. K.， Usman, N. , Nicoghosian, K,and Cedergren,R. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,85, 5764-5768, 1988 ；Bratty, J. , Wu, Τ. , Nicoghosian, K. , Ogilvie, K. K. , Perrault, J. -P. , Keith,G. and Cedergren，R.，FEBS Lett. 269,60-64,1990) 在隨後的優秀出版物中對本文獻進行綜述:Gait, Μ. J. , Pritchard, C. and Slim, G. , Oligonucleotide and Their Analogs A Practical Approach(Gait, M. J. ,ed. ), Oxford University Press Oxford,England,第 25-48頁，1991。最近在RNA合成中採用的保護基為雙O-乙醯氧乙基-氧)甲基(ACE)， Scaringe, S. A. , Wincott, F. E. , Caruthers, M. H. , J. Am. Chem. Soc. , 120 :11820-11821, 1998 ；三異丙基甲矽燒基氧甲基(TOM)Pitsch, S.，Weiss, P. Α.，Jenny, L.，Stutz, Α.， ffu, X.，Helv. Chim. Acta. 84，3773-3795，2001 以及叔丁基二硫代甲基(DTM)(結構 1)， Semenyuk,A. ,Foldesi,A. , Johansson,Τ. ,Estmer—Nilsson, C. , Blomgren, P. , Brannval1, Μ.，Kirsebom，L. Α.，Kwiatkowski，Μ. , J. Am. Che m. Soc.，128 12356-12357，2006，以上都已被引入。然而，這些方法中沒有一個可以從反向(5』 一3』方向)進行RNA的合成；因此它們缺少在RNA分子的3』 -末端方便且充分地引入多種配體和發色團的能力，這些通過反向合成都可以實現。為了體現siRNA的活性，將阿拉伯糖、2』 -脫氧_2』 -氟-β _D_阿拉伯糖核酸 (FANA ；結構2))和2』 -脫氧-4』 -硫-2，-氟-β _D_阿拉伯糖核酸(4』 -硫-FANA ；結構 3) RNA, Dowler, Τ. ，Bergeron, D. ，Tedeschi，Anna-Lisa, Paquet, L. , Ferrari, N. , Damha, Μ. J. , Nucl. Acids Res. , 34，1669—1675，2006。 ￠/1 禾中己經開發了其化學性質的新的2』 -保護基中，2』 -保護的-2-氰乙氧基甲基(CEM)(結構4) 顯示出用於製備非常長的RNA，然而其也是以傳統的即3』 一 5』方向進行RNA合成。並且， 通過這些方法產生的RNA的質量仍待考察。
權利要求
1.一種式(1)的亞磷醯胺，
2.一種式(1)的亞磷醯胺
3.—種通過在5 』 -至3 』 -方向上成鍵來製備寡核苷酸的方法，所述方法用於合成選自以下結構式的RNA寡聚物
全文摘要
本發明涉及新型的亞磷醯胺，製備了HPLC純度大於98％以及31PNMR純度大於99％的A-n-bz、C-n-bz、C-n-ac、G-n-ac和U。開發並公開了新的反向5』→3』合成RNA寡聚物的方法。使用該方法顯示出高質量的RNA合成，偶合效率接近99％。
文檔編號C07H21/02GK102439025SQ200980144136
公開日2012年5月2日 申請日期2009年9月8日 優先權日2008年9月6日
發明者D·潘迪, N·P·斯裡瓦斯塔瓦, S·C·斯裡瓦斯塔瓦, S·P·巴傑帕伊 申請人:坎姆根公司