一株具有廣譜抗菌活性的海洋放線菌U‑19‑3及應用的製作方法
2023-12-05 00:13:01 1
本發明涉及一株具有廣譜抗菌活性的海洋放線菌u-19-3，其屬於微生物學中放線菌領域。
背景技術：
放線菌(actinomycetes)是一類高(g+c)含量(>55％)的革蘭氏陽性細菌，因其菌落邊緣菌絲常呈放線狀而得名[1]。放線菌作為一類有價值的微生物資源，擁有合成豐富的生物活性的次級代謝產物的能力。目前在已發現的33500種天然活性產物中，40％以上在放線菌中發現[2]；生活中普遍應用的各類抗生素約70％也是由放線菌生產[3]。
海洋環境由於其特殊的極端性(高壓、低溫、高鹽、缺乏光照、營養匱乏等)，造就了海洋微生物獨特的生存方式、代謝途徑，從而具備合成新穎活性化合物的能力[4]，使得海洋微生物成為了活性天然產物的重要來源之一，也成為新藥研發的主力軍[5]。據統計，來源於放線菌的活性化合物約佔微生物天然活性產物的45％，這些結構新穎、功能多樣和具有特殊生理活性的海洋放線菌次級代謝產物的發現和其蘊含的應用價值潛力，提供了產生新穎抗生素的潛力，為海洋微生物來源的天然產物的開發奠定基礎，也為海洋微生物資源的高效利用提供科學依據。
[1]周長林，微生物學，北京：中國醫藥科技出版社，2009
[2]bérdyj.thoughtsandfactsaboutantibiotics:wherewearenowandwhereweareheading.journalofantibiotics,2012,65(8):385～395
[3]bérdyj.bioactivemicrobialmetabolites.journalofantibiotics,2005,58(1):1～26
[4]趙成英，朱統漢，朱偉明，2010～2013之海洋微生物新天然產物，有機化學2013，33(6)：1195-1234
[5]hugp,yuanj,sunl,etal.statisticalresearchonmarinenaturalproductsbasedondataobtainedbetween1985and2008.marinedrugs,2011,9(4):514～525
技術實現要素：
鑑於上述，本發明利用膠州灣海洋微生物資源，提供一株具有廣譜抗菌活性的海洋放線菌，該菌對藤黃八疊微球菌(micrococcusluteus)、大腸桿菌(escherichiacoli)和銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)、白色假絲酵母菌(candidaalbicans)均具有良好的抑菌效果，並含有pksi和pksii基因。
本發明所涉及的一株具有廣譜抗菌活性的海洋放線菌u-19-3，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，分類為小單孢菌，micromonosporasp。保藏單位地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，cgmcc號：12139，保藏日期：2016年2月18號。
本發明的海洋放線菌u-19-3；從其基因組中擴增出i型和ⅱ型聚酮合酶基因。
本發明的的海洋放線菌u-19-3；分離自取膠州灣海域觀測站位採集的表層沉積物；利用乾熱法進行預處理，重鉻酸鉀作為分離抑制劑；其基內菌絲呈橙色，氣生菌絲呈黑色。
本發明的的海洋放線菌u-19-3；具有廣譜抗菌活性，對藤黃八疊微球菌(micrococcusluteus)、大腸桿菌(escherichiacoli)和銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)、白色假絲酵母菌(candidaalbicans)具有良好的抑菌效果。
具體說明如下:
取膠州灣海域觀測站位採集的表層沉積物，用乾熱法進行預處理，稀釋成不同濃度在重鉻酸鉀篩選培養基上培養14-21天後純化。進行菌株發酵，採用牛津杯法和紙片擴散法檢測發酵液抗菌活性。觀察菌株形態特徵，進行生理生化試驗。提取菌株基因組，擴增16srdna和pksi和pksii基因，分別對這些序列進行比對分析。
u-19-3對供試藤黃八疊微球菌(micrococcusluteus)、大腸桿菌(escherichiacoli)和銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)、白色假絲酵母菌(candidaalbicans)均具有良好的抑菌效果。通過形態觀察，在生長最佳的察氏培養基上，u-19-3基內菌絲呈橙色，氣生菌絲呈黑色。通過生理生化試驗，發現u-19-3不能液化明膠，不能凝固和腖化牛奶，可以水解澱粉，不產生硫化氫；碳源試驗中，只能利用阿拉伯糖和木糖。通過對16srdna的鑑定，結合上述特徵，初步將放線菌u-19-3分類為小單孢菌，micromonosporasp。對其pksi及pksii基因的擴增揭示了其產聚酮化合物的潛力。
本發明的優點是：
海洋放線菌u-19-3具有廣譜抗菌活性，對供試藤黃八疊微球菌(micrococcusluteus)、大腸桿菌(escherichiacoli)和銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)、白色假絲酵母菌(candidaalbicans)具有良好的抑菌效果。從海洋放線菌u-19-3中擴增出的pksi和pksii基因揭示了其產聚酮化合物的潛力。
附圖說明
圖1：u-19-3在gau培養基生長示意圖。
具體實施方式
1.樣品的採集與預處理
樣品採集信息：在膠州灣海域9個不同觀測站位採集的表層沉積物，由中國海洋大學海洋化學理論與工程技術教育部重點實驗室提供。將採集得到的樣品保存於4℃低溫冰箱中，用無菌塑膠袋長期保存。使用時，將10ml海底沉積物樣品鋪於無菌培養皿內，80℃或120℃乾熱處理1-2h，磨細成粉末，稀釋後做分離待用。
2、海洋放線菌的分離
海洋放線菌的分離主要採取平板梯度稀釋法，具體步驟如下：
(1)均稱取乾熱處理的樣品10.0g，加入90ml無菌海水中，150r/min震蕩20min後，靜置30min取上清液，逐級稀釋至10-2、10-3、10-4，各取100微升塗布上述個選擇性平板，每個梯度設3個重複；
(2)培養基中含0.0075％的重鉻酸鉀(或選擇萘啶酮酸+制黴菌素)，以抑制細菌和真菌的生長，放入28℃的培養箱中倒置培養14d～21d；
(3)挑取不同形態的菌落到放線菌篩選培養基平板上進行培養，然後將分離的菌落在平板上反覆劃線純化，直至得到菌落形態單一的培養物命名為u-19-3。
3、抗菌活性測定
採用牛津杯(管碟法)和紙片擴散法來檢測u-19-3發酵液抗菌活性，具體步驟如下：
(1)牛津杯法
1)以無菌操作在固體培養基(細菌為lb，真菌為ypd)表面直接垂直放上4～6支牛津杯，輕輕加壓，使其與培養基接觸無空隙，
2)在杯中加入待檢測u-19-3發酵液(離心取上清)，一般可以裝200μl，勿使其外溢。
3)加滿後置37℃(細菌)或28℃(真菌)培養2～3d，觀察結果，用尺子量抑菌圈直徑。
(2)紙片擴散法
1)取較厚的平整濾紙，用打孔器製作直徑為6mm的濾紙片，將無菌濾紙片均勻放置於生物檢定平板中，每板4～8個均可。
2)取10μlu-19-3發酵液(離心取上清)置於在生物檢定平板中的濾紙片上，將生物檢定平板先置於4℃冰箱中1～2h。培養並觀察測量抑菌圈直徑。
表1u-19-3對供試菌株的抑菌直徑
4、形態學特徵觀察
u-19-3在培養基上28℃條件下培養2～3周後，通過光學顯微鏡觀察菌絲體形態。參照國際鏈黴菌規劃(internationalstreptomycesprojects，isp)的標準方法，採用的標準培養基進行，在isp2、isp3、isp4、isp5、營養瓊脂、察氏瓊脂、馬鈴薯瓊脂七種典型的放線菌培養基進行培養，觀察培養過程中菌落形態、菌絲的變化。
表2菌株u-19-3的形態特徵
5、生理生化實驗
內容包括：明膠液化、牛奶凝固與腖化、澱粉水解、硫化氫產生和碳源利用實驗，其中碳源有葡萄糖、果糖、木糖、鼠李糖、甘露醇、蔗糖、阿拉伯糖、棉子糖和肌醇。
表3u-19-3生理生化特徵
6、16srdna序列測定和系統進化樹構建
提取海洋放線菌u-19-3基因組dna，採用細菌通用引物擴增16srdna並純化測序，測序結果通過ncbi的blastn程序進行同源性比較，採用mega5.1軟體，用neighbor-joining法建立系統發育樹。通過序列分析，並結合其形態特徵和生理生化特徵,可以將菌株u-19-3初步分類為小單孢菌，micromonosporasp。7、pksi和pksii基因的擴增
利用簡併引物對pksi和pksii基因進行擴增，得到的片段純化後，進行轉化實驗並測序，測序結果通過ncbi的blastp程序進行同源性比較，採用mega5.1軟體，用neighbor-joining法建立系統發育樹。通過序列分析，發現菌株u-19-3的ⅰ型聚酮合酶序列與micromonosporasubsp.carbonacealuedemannandbrodsky1965(炭樣小單孢菌)的ⅰ型聚酮合酶序列(ncbireferencesequence:wp_043962713.1)最為接近，二者相似度高達94％。菌株u-19-3的ⅱ型聚酮合酶與frankiasp.ei5c(ncbireferencesequence:oaa20009.1)和frankiasp.dsm45899(ncbireferencesequence:cuu53565.1)的minimalpksketosynthase(ks/ksalpha)最為接近。