一種快速提取土壤總dna的方法

2023-12-04 19:16:46 1

專利名稱：一種快速提取土壤總dna的方法
一種快速提取土壤總DNA的方法技術領域
本發明屬於微生物學和分子生物學技術領域，具體涉及一種快速提取土壤總DNA 的方法。
背景技術：
目前用於土壤總DNA提取方法主要有三種，直接法、間接法和試劑盒法。直接法是 直接從土壤中裂解細胞，但目前的傳統方法操作步驟太多，所以導致DNA產量低，且最後得 到的DNA量不穩定。間接法是先分離細胞再裂解，但許多微生物與土壤顆粒緊密結合，細胞 不易分離，導致最終的DNA產量低，且耗時較長。試劑盒法具有簡單、快速的優點，但價格昂 貴，對大批量樣品提取不經濟，而且有時候DNA提取不出來。
提取土壤總DNA的傳統方法包括如下步驟(JIZHONG ZHOU, et. al，DNA Recoveryfrom soils of Diverse composition,Applied and EnvironmentMicrobiology, Feb. 1996，p.316-322.)
(1)取Ig 土壤樣品，加入:3ml DNA提取緩衝液和20 μ 1蛋白酶K，37°C下225rpm 水平振蕩30min;加入300μ1 20% (質量百分含量)SDS水溶液，65°C下水浴池；室溫下 6000g離心lOmin，收集上清液；
(2)在步驟⑴剩餘的沉澱中加入Iml DNA提取緩衝液和100 μ 1 20% (質量百 分含量)SDS水溶液，振蕩IOmin ；65°C水浴IOmin ；室溫下6000g離心lOmin，收集上清液；
(3)在步驟⑵剩餘的沉澱中加入Iml DNA提取緩衝液和100 μ 1 20% (質量百 分含量)SDS水溶液，振蕩IOmin ；65°C水浴IOmin ；室溫下6000g離心lOmin，收集上清液；
(4)將步驟(1)、步驟( 和步驟( 的上清液混合，然後加入等體積苯酚/氯仿/ 異戊醇(25體積苯酚、M體積份氯仿與1體積份異戊醇混合)，12000g離心20min，收集上 清液；
(5)加入0. 6倍步驟(4)的上清液體積的異丙醇，在室溫(25°C左右)下放置Ih ； 室溫下16000g離心20min，收集沉澱(粗DNA)；
(6)加入500 μ 1 70% (體積百分含量)冰乙醇水溶液，12000g離心lOmin，收集 沉澱；加入500 μ 1 70% (體積百分含量)冰乙醇水溶液，12000g離心lOmin，收集沉澱；
(7)沉澱自然乾燥後加入去離子水。
步驟(1)、步驟⑵和步驟(3)中的DNA提取緩衝液由溶質和水組成，溶質及其濃 度如下100mM Tris-HCl (pH8. 0) ； IOOmM EDTA · 2Na (ρΗ8· 0) ； IOOmM 磷酸鈉(ρΗ8· 0) ； 1. 5Μ NaCl ；1% (質量百分含量)十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)。發明內容
本發明的目的是提供一種快速提取土壤總DNA的方法。
本發明提供的提取土壤總DNA的方法，依次由以下步驟組成
(1)採用SDS-溶菌酶法裂解土壤(樣本)，得到裂解液；
(2)沉澱裂解液中的DNA，收集沉澱；
(3)將沉澱溶解後進行瓊脂糖凝膠電泳，回收純化瓊脂糖凝膠上的DNA條帶，得到 土壤總DNA。
所述步驟O)中的沉澱裂解液中的DNA可包括如下步驟加入聚乙二醇，2V -60C 靜置20min-40min。所述步驟O)中的沉澱裂解液中的DNA優選包括如下步驟加入聚乙 二醇，4°C 靜置 30min。
所述步驟(2)中可採用20°C -30°C下 13000Xg-15000Xg 離心 10min_30min 的方 式收集所述沉澱。所述步驟O)中優選採用25°C下14000Xg離心20min的方式收集所述沉澱。
在進行所述靜置前還可加入可溶性乙酸鹽。
所述聚乙二醇可以以聚乙二醇水溶液的形式加入。
所述聚乙二醇優選為PEG8000。
所述可溶性乙酸鹽可以以乙酸鹽水溶液的形式加入。
所述可溶性乙酸鹽優選為乙酸鈉。
所述聚乙二醇水溶液具體可為40% (質量百分含量)的聚乙二醇水溶液，所述聚 乙二醇水溶液的加入體積具體可為所述裂解液體積的0. 42倍。
所述乙酸鹽水溶液具體可為3M的乙酸鹽水溶液，所述乙酸鹽水溶液的加入體積 具體可為所述裂解液的體積的0. 125倍。
所述步驟(3)中的所述瓊脂糖凝膠電泳的參數可為0.7% -1% (質量百分含 量)瓊脂糖凝膠電泳；50V-80V電壓；先垂向電泳15min-25min，然後將凝膠旋轉後橫向電 泳5min-15min。所述步驟(3)中的所述瓊脂糖凝膠電泳的參數優選為0. 8% (質量百分 含量)瓊脂糖凝膠電泳；65V電壓；先垂向電泳20min，然後將凝膠旋轉後橫向電泳lOmin。
所述步驟(3)中，可用TE緩衝液溶解所述沉澱。
所述TE緩衝液具體如下pH為8. 0，由水和溶質組成，所述溶質及其在所述TE緩 衝液中的濃度如下10mM Tris-HCl, ImM EDTA。
所述步驟(1)中的SDS-溶菌酶法可包括如下步驟用DNA提取緩衝液重懸土 壤，加入蛋白酶K和溶菌酶，混勻後36°C -38°C反應15min-25min ；加入SDS，60°C _70°C水 浴 20min-40min,20°C -30°CT 9000Xg_11000Xg 離心 5min_15min，得到的上清液即為裂 解液。所述步驟(1)中的SDS-溶菌酶法優選包括如下步驟用所述DNA提取緩衝液重懸 土壤，加入蛋白酶K和溶菌酶，混勻後37°C反應20min ；加入SDS，65°C水浴30min，25°C下 10000 X g離心lOmin，得到的上清液即為裂解液。
所述DNA提取緩衝液具體如下由水和溶質組成；所述溶質及其在所述DNA提取 緩衝液中的濃度如下IOOmM Tris-HCl (ρΗ8. 0)，IOOmM EDTA · 2Na(pH8. 0)，IOOmM 磷酸鈉 (ρΗ8· 0)，1· 5Μ NaCl。
所述蛋白酶K可以以蛋白酶K溶液的方式加入。
所述溶菌酶可以以溶菌酶溶液的方式加入。
所述SDS可以以SDS水溶液的形式加入。
所述蛋白酶K溶液具體可為20mg/ml的蛋白酶K溶液；所述溶菌酶溶液具體可為 50mg/ml的溶菌酶溶液；所述SDS水溶液具體可為20% (質量百分含量)的SDS水溶液；所述土壤、所述DNA提取緩衝液、所述蛋白酶K溶液、所述溶菌酶溶液的配比具體可為0. 5g 土壤1ml DNA提取緩衝液10 μ 1蛋白酶K溶液50 μ 1溶菌酶溶液；所述SDS水溶液的加 入體積具體可為所述DNA提取緩衝液、所述蛋白酶K溶液和所述溶菌酶溶液的體積總和的 十分之一。
本發明提供的方法以粘性土壤、亞粘土、亞沙土為材料，採取SDS和溶菌酶結合的 方法裂解細胞釋放DNA，用PEG進行沉澱DNA，然後將得到的粗DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，再 進行切膠純化。該方法操作步驟簡單，在操作中損失的DNA比較少，得到的DNA量穩定。並 且在提取過程中不使用酚、氯仿，減少了對實驗人員的身體傷害。採用本發明的方法提取得 到的DNA的純度和產量均可以用於PCR實驗。


圖1為通過電泳鑑定土壤總DNA的提取效果的電泳圖；A 採用步驟一的方法提取 土壤總DNA ；B 採用步驟二的方法提取土壤總DNA。
圖2為通過PCR鑑定步驟一的方法提取土壤總DNA的提取效果的電泳圖。
具體實施方式
以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重複實驗，結果取平 均值。SDS即十二烷基硫酸鈉。
實施例1、相關試劑的配製
DNA提取緩衝液由水和溶質組成；所述溶質及其在所述DNA提取緩衝液中的 濃度如下IOOmM Tris-HCl (ρΗ8· 0)，IOOmM EDTA · 2Na (ρΗ8· 0)，IOOmM 磷酸鈉(ρΗ8· 0)， 1.5MNaCl。
TE緩衝液由水和溶質組成；所述溶質及其在所述TE緩衝液中的濃度如下 IOmMTris-HCl, ImM EDTA, pH8. 0 ；121°C 滅菌 30min。
實施例2、土壤總DNA的提取
採集花壇中的新鮮土壤，立即分別採用本發明的方法和背景技術中的傳統方法進 行總DNA的提取。
一、採用本發明的方法進行總DNA的提取
(1)在2ml的EP管中加入土壤樣品0. 5g，加入Iml DNA提取緩衝液，漩渦混勻；再 加入10 μ 1 20mg/ml蛋白酶K溶液和50 μ 1 50mg/ml溶菌酶溶液，混勻；37°C (36_38°C均 可)搖床200rpm震蕩20min(15-25min均可)(震蕩是為了反應充分，增加DNA提取效率)； 加入20% (質量百分含量)SDS水溶液(加入體積為DNA提取緩衝液、蛋白酶K溶液和溶菌 酶溶液的混合液的體積的十分之一)，65°C (60-70°C均可)水浴30min(20-40min均可)， 每IOmin上下顛倒混勻一次；25°C (20_30°C均可)下10000Xg(9000-11000Xg均可)離 心IOmin (5-15min均可)，收集上清液(裂解液)；
(2)加入0. 125倍裂解液體積的3M乙酸鈉水溶液，混勻後再加入0. 42倍裂解液 體積的40% (質量百分含量)PEG8000水溶液，4°C均可)靜置30min(20_40min均可)；25°C (20-30°C均可)下 14000Xg(13000-15000Xg 均可)離心 20min(10_30min 均 可)，收集沉澱(粗DNA)。
(3)將沉澱用70% (體積百分含量)冰乙醇水溶液洗滌1-2次，每次500ul ；37°C 晾乾，加50 μ 1 TE緩衝液溶解，得到的溶液為DNA溶液甲。
(4)將DNA溶液甲進行0.8% (0. 7% _1 %均可)(質量百分含量)瓊脂糖凝膠電 泳，電泳參數為65V (50 80V均可)電壓；先垂向電泳20min(15-25min均可)，然後將凝 膠旋轉90度，橫向電泳IOmin (5-15min均可)。
(5)用膠回收試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司的多功能DNA純化回收試劑 盒(離心柱型)目錄號DP1502)將瓊脂糖凝膠上的DNA回收，得到土壤總DNA，-20°C保存。
二、採用背景技術中的傳統方法進行總DNA的提取
土壤樣品 0.5g。
三、總DNA提取量的鑑定
重複進行兩次步驟一的總DNA提取，獲得的總DNA質量分別為1876. 5ng和 1902ng。重複進行兩次步驟二的總DNA提取，獲得的總DNA質量分別為1017. 4ng和 1769.4ng。
結果表明，採用本發明的方法進行土壤總DNA提取，穩定性好，產量高。
四、通過電泳鑑定土壤總DNA的提取效果
分別將步驟一得到的土壤總DNA和步驟二得到的土壤總DNA進行0. 8% (質量百 分含量)瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖1。圖IA中，M marker ;1和2為同一土壤樣品，重複進 行兩次步驟一的操作提取的土壤DNA ；圖IB中，M :marker ；1和2為同一土壤樣品，重複進 行兩次步驟二的操作提取的土壤DNA。結果表明，本發明的方法從同一土壤中提取的總DNA 的穩定性好，產量高。
五、通過PCR鑑定土壤總DNA的提取效果
分別將步驟一得到的土壤總DNA和步驟二得到的土壤總DNA作為模板，以 16S-1507R和16S-27F組成的引物對(16s rDNA引物對是針對土壤所有細菌16s rDNA基因 保守區的引物)擴增土壤微生物的16S rDNA。
16S-1507R 5' -ACG GTT ACC TTG TTA CGA CTT-3，(序列表的序列 1)；
16S-27F :5，-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3，(序列表的序列 2)。
PCR程序見表1。
表1 PCR 程序
權利要求
1.提取土壤總DNA的方法，依次由以下步驟組成(1)採用SDS-溶菌酶法裂解土壤樣本，得到裂解液；(2)沉澱裂解液中的DNA，收集沉澱；(3)將沉澱溶解後進行瓊脂糖凝膠電泳，回收純化瓊脂糖凝膠上的DNA條帶，得到土壤 總 DNA。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述步驟O)中的沉澱裂解液中的DNA包 括如下步驟加入聚乙二醇，2°C _6°C靜置20min-40min ；所述步驟O)中採用20°C -30°C 下13000Xg-15000Xg離心10min-30min的方式收集所述沉澱；所述步驟O)中的沉澱裂 解液中的DNA優選包括如下步驟加入聚乙二醇，4°C靜置30min ；所述步驟( 中優選採用 25°C下14000 Xg離心20min的方式收集所述沉澱。
3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於在進行所述靜置前還加入可溶性乙酸鹽。
4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於所述聚乙二醇是以聚乙二醇水溶液的 形式加入的；所述可溶性乙酸鹽是以乙酸鹽水溶液的形式加入的；所述聚乙二醇優選為 PEG8000 ；所述可溶性乙酸鹽優選為乙酸鈉。
5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於所述聚乙二醇水溶液為40%(質量百分含 量)的聚乙二醇水溶液，所述聚乙二醇水溶液的加入體積為所述裂解液體積的0. 42倍；所 述乙酸鹽水溶液為3M的乙酸鹽水溶液，所述乙酸鹽水溶液的加入體積為所述裂解液的體 積的0. 125倍。
6.如權利要求1至5任一所述的方法，其特徵在於所述步驟(3)中的所述瓊脂糖凝 膠電泳的參數為0. 7%-1% (質量百分含量)瓊脂糖凝膠電泳；50V-80V電壓；先垂向電泳 15min-25min，然後將凝膠旋轉後橫向電泳5min-15min ；所述步驟(；3)中的所述瓊脂糖凝膠 電泳的參數優選為0. 8% (質量百分含量)瓊脂糖凝膠電泳；65V電壓；先垂向電泳20min， 然後將凝膠旋轉後橫向電泳lOmin。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於所述步驟(3)中，用TE緩衝液溶解所述沉 澱；所述TE緩衝液的pH為8. 0，由水和溶質組成，所述溶質及其在所述TE緩衝液中的濃度 如下10mM Tris-HCl, ImM EDTA。
8.如權利要求1至7中任一所述的方法，其特徵在於所述步驟(1)中的SDS-溶 菌酶法包括如下步驟用DNA提取緩衝液重懸土壤，加入蛋白酶K和溶菌酶，混勻後 36 "C -38 °C 反應 15min-25min ；加入 SDS，60 "C -70 "C 水浴 20min-40min, 20 "C -30 "C 下 9000 Xg-11000 Xg離心5min-15min，得到的上清液即為裂解液；所述步驟(1)中的SDS-溶菌酶法優選包括如下步驟用所述DNA提取緩衝液重懸 土壤，加入蛋白酶K和溶菌酶，混勻後37°C反應20min ；加入SDS，65°C水浴30min，25°C下 IOOOOXg離心lOmin，得到的上清液即為裂解液；所述DNA提取緩衝液的pH為8. 0，由水和溶質組成；所述溶質及其在所述DNA提取緩 衝液中的濃度如下100mM Tris-HCl, IOOmM EDTA · 2Na, IOOmM 磷酸鈉，1. 5M NaCl。
9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於所述蛋白酶K是以蛋白酶K溶液的方式加 入的；所述溶菌酶是以溶菌酶溶液的方式加入的；所述SDS是以SDS水溶液的形式加入的。
10.如權利要求9所述的方法，其特徵在於所述蛋白酶K溶液為20mg/ml的蛋白酶K 溶液；所述溶菌酶溶液為50mg/ml的溶菌酶溶液；所述SDS水溶液為20% (質量百分含量)的SDS水溶液；所述土壤、所述DNA提取緩衝液、所述蛋白酶K溶液、所述溶菌酶溶液的配比 為0. 5g 土壤1ml DNA提取緩衝液10 μ 1蛋白酶K溶液50 μ 1溶菌酶溶液；所述SDS水 溶液的加入體積為所述DNA提取緩衝液、所述蛋白酶K溶液和所述溶菌酶溶液的體積總和 的十分之一。
全文摘要
本發明公開了一種快速提取土壤總DNA的方法。本發明提供的方法，依次由以下步驟組成(1)採用SDS-溶菌酶法裂解土壤樣本，得到裂解液；(2)沉澱裂解液中的DNA，收集沉澱；(3)將沉澱溶解後進行瓊脂糖凝膠電泳，回收純化瓊脂糖凝膠上的DNA條帶，得到土壤總DNA。本發明以粘性土壤、亞粘土、亞沙土為材料，採取SDS和溶菌酶結合的方法裂解細胞釋放DNA，用PEG進行沉澱DNA，然後將得到的粗DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，再進行切膠純化。該方法操作步驟簡單，在操作中損失的DNA比較少，得到的DNA量穩定。並且在提取過程中不使用酚、氯仿，減少了對實驗人員的身體傷害。採用本發明的方法提取得到的DNA的純度和產量均可以滿足PCR實驗。
文檔編號C12N15/10GK102031252SQ201010536640
公開日2011年4月27日 申請日期2010年11月9日 優先權日2010年11月9日
發明者李雪, 梅海, 郝純, 陳功 申請人:盎億泰地質微生物技術(北京)有限公司