菲牛蛭的養殖方法及水蛭素的提取技術的製作方法
2023-12-05 01:43:41
專利名稱：菲牛蛭的養殖方法及水蛭素的提取技術的製作方法
技術領域：
本發明涉及醫用水蛭的養殖及水蛭素的提取方法，特別是菲牛蛭的養殖及水蛭素的提取方法。
背景技術：
水蛭素是從吸血水蛭(螞蟥)中提取的一種抗凝血物質。水蛭，首載於我國《神農本草經》，後在《本草綱目》和《中國動物藥》等專著中均有收載。1884年，Haycraft發現水蛭提取物有抗凝血作用，1955年，MarkwMdt指出這種抗凝血物質為蛋白質，定名為水蛭素，1986年後基因重組水蛭素問世，為水蛭素的深入研究和臨床應用開闢了廣闊前景。根據文獻記載，天然水蛭素是由65個胺基酸組成的多肽，其作用有以下幾個方面1、具有抗凝血作用。不同來源和結構的水蛭素，其抗凝血機制不盡相同。因此天然水蛭素可從多個環節影響血液凝固和血栓形成。2、抗凝血酶作用。水蛭素的抗凝血酶作用見於歐洲醫用水蛭(hiNmedic5nalis)Llj、亞洲水牛蛭(菲牛蛭)和印度水蛭等。由這些水蛭中提取的水蛭素含6個分布相似的半胱氨酸殘基，具有相似的三維結構其N端由二硫鍵形成緊密結構，且與凝血酶活性位點結合；其C端富含酸性胺基酸殘基，則與凝血酶的纖維蛋白原結合位點結合；中間區的胺基酸殘基協調作用。這種結構可以達到水蛭素與凝血酶呈1∶1的比例形成穩定的複合物，從而對凝血酶有高度特異的抑制作用，起到抑制凝血酶的抗凝血作用。3、抗血小板作用。1992年，Como等從墨西哥水蛭中提取出一種稱為菲牛蛭抗血小板蛋白質，具有特異性抑制膠原誘導血小板聚集的作用，而對其他誘導劑(如血、凝血酶等)誘導血小板聚集無抑制作用。1994年，Kmel等從北美水蛭中提取一種含39個胺基酸殘基的多肽，其三維構象與水蛭素很相似，C端的RGD序列與血小板膜GPIIb/IIIa相識別，從而抑制了纖維蛋白原介導的血小板聚集作用。4、降解纖維蛋白(原)作用。1984年，Malin-conlco等從亞馬遜巨型水蛭中提取一種稱為hementin的物質。這種物質可以降解纖維蛋白(原)的特定肋鏈，具有抗凝血酶活性並能顯著抑制ADP誘導的血小板聚集，對於預防血栓性疾病的發生有明顯的作用。
水蛭素的臨床應用，目前，由於重組水蛭素的問世，臨床上多用於治療不穩定性心絞痛(USA)、急性心肌梗死(AMI)、血管成形術、術後血栓形成、血液透析、體外循環、彌散性血管內凝血(DIC)，以及用於抗腫瘤等。
水蛭素乾燥狀態下較穩定.室溫下在水中可穩定存在6個月，80℃下加熱15分鐘不被破壞。pH值升高則穩定性下降，在0.1moL HCl或0.1mol NaOH中可穩定15min。康蛋白酶鈉和蛋白酶不破壞水蛭素的活性，而番木瓜蛋白酶胃蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶A則可使之失去活性。
在水蛭養殖方面，目前為了獲得水蛭素，各地都在養殖水蛭，水蛭的物種有多種，如寬體金線蛭、歐洲醫蛭、日本醫蛭、菲牛蛭、亞馬遜巨型水蛭等，我國養殖的物種大多為寬體金線蛭，主要是因為寬體金線蛭體形大容易飼養，經過科技文獻檢索了解到，目前我國內有不少地方辦起了水蛭養殖場，如北京、江蘇吳江、鄭州市、山東曹縣等，但他們養殖的物種大多為寬體金線蛭，飼養寬體金線蛭是以投餵活螺獅為主，輔以蚯蚓，昆蟲的幼蟲等。
菲牛蛭(金邊螞蟥)是我國華南尤其是廣西、廣東、海南等地區和一些東南亞國家特有的水蛭物種，品質最優，在廣西分布較為廣泛，該物種所含水蛭素抗凝血物質比其它品種水蛭特別是比目前文獻報導的寬體金線蛭含抗凝血物質含量高得多，藥用效果好，寬體金線蛭不含水蛭素。由於菲牛蛭在天氣寒冷的地區不容易生長，飼養也很不容易，目前未見有養殖菲牛蛭的文獻記載。
在水蛭素的提取方面，目前水蛭素有許多方法，國內的水蛭素提取，主要採用將水蛭養殖到一定程度後將其絞碎或者乾燥後用化學藥劑將其提取，這種方法浪費資源，而且提取工藝複雜。
《水生生物學報》1997年第2期報導，1955年德國的Markwardt首次從醫蛭中分離出較純的水蛭素，此後水蛭素的純化和標準化技術日趨完善。迄今已有不少有關的研究報導和專利，絕大多數工作是利用歐洲醫蛭的頭部甚至整個身體做原料，經乙醇脫水，然後加丙酮沉澱等一系列步驟而得到水蛭素粗製品的。1970年Markwardt採用乙醇分級沉澱、陽離子交換、凝膠過濾以及陰離子交換等步驟獲得了水蛭素純品。1985年WdsmaM和Marhyardt改進了純化方法，採用離子交換與親合色譜相結合而獲得了高純度的水蛭素。1986年Johmnes等人報導了一種五步純化法，其中使用了高效液相色譜新技術。
中國專利也公開了一些水蛭素的提取方法，中國專利申請號92107076發明名稱醫用天然水蛭素的提取方法，是將將水蛭洗淨去除泥土等雜質後，整體搗碎成泥漿狀，再把水蛭漿加溫至60-80℃，並維持2-3分鐘，在加溫後的水蛭漿中加入10％的冰醋酸調整PH值在4.4-4.6，隨即冷卻至25-30℃，再加10％Na2CO3調整PH值在6-7，水蛭漿經離心收集母液，殘渣加入0.9％的生理鹽水先後浸提2-3次，收集全部浸提液，然後把母液透析36小時，每隔12小時換水一次，透析液用95％以上乙醇沉澱，先加95％乙醇使其含量為61％，放置12小時，傾去上清液，再加同樣濃度的乙醇使其含量為85％，放置24小時，得到水蛭素沉澱，(7)將沉澱低溫乾燥得粗製品，(8)粗製品用適量二次蒸餾水溶解。
申請號95105650發明名稱動物血水蛭水解法及其水蛭水解血，是關於動物血的新的利用方法，使食血水蛭充分吸取動物血，數分鐘至數小時後用物理或化學方法使血液從水蛭體內流出，收集流出的橙紅色血液體，再從血中提取水蛭素。該法獲得的水蛭水解血有含中小分子量蛋白質或肽的動物血，還含有水蛭素、消化血液的纖維蛋白酶(原)、透明質酸酶及其它目前難以測定的有用的水蛭分泌物。本法能有效降解動物血並使之含有醫用價值的水蛭素、透明質酸酶等水蛭分泌物，水蛭還可多次使用，提高其利用率。
技術內容本發明人在經過幾年的研究和探索，了解到菲牛蛭(金邊螞蟥)所含水蛭素抗凝血物質比其它物種水蛭特別是比目前文獻報導的寬體金線蛭含抗凝血物質含量高，藥用效果好的優點後，經歷多次試驗後，終於摸索出人工飼養菲牛蛭和從菲牛蛭中提取水蛭素的方法，取得了較好的經濟效益。
本發明的技術方案如下1、菲牛蛭的人工飼養通過引進優良種源或野外捕捉到健壯的菲牛蛭、放在水體乾淨的水池或池塘中進行人工分級分段馴化、餵養，並維持適宜的溫度，進行人工繁殖，待飼養到一定程度，即可提取水蛭素。
以上所述的人工分級分段馴化、餵養的方法是把繁育種苗和飼養小苗放在小水池中，這樣由於面積比較小，可以比較細緻的餵養和料理，可以提高繁育和生長率。等到生長比較大，菲牛蛭可以自己覓食時再放到大面積的池塘裡養殖。也可以繼續把它們分類放在小池裡，進行工廠化養殖，一般每立方米水可放成品600-1500條左右，如果要增加在飼養過程中可以採用流動的水和通過加氧措施，冬天要注意保溫。
以上所述的人工分級分段馴、餵養的方法還包括餵食，包括用0.05-0.2％鈉鹽處理得到的新鮮牛血、豬血、羊血等，所述的鈉鹽包括乙酸鈉、磷酸鈉、檸檬酸鈉、精氨酸鈉、賴氨酸鈉、抗壞血酸鈉、胱氨酸鈉，主要使血液不凝固，在餵食過程中將不凝固的血液放到盛有海棉的碟子上，然後將碟子放到浮在養殖池水中的泡沫板上，同時一邊攪動池水，讓菲牛蛭吸引過來覓食。也可將已經加有藥品的腥畜血液用牛小腸、豬小腸或人工腸衣裝好，然後用細線將小腸捆成每節2-3釐米的節狀直接防入養殖水中餵養。
以上所述的人工繁殖包括到一定時候需要加入野生的優良品種交配，使之不產生近親繁殖，規模化養殖以及水蛭素提取等步驟完成。在野外捕捉到的菲牛蛭經過鑑定後，將它放在小水池裡，使其適應新的環境，然後通過人工分級分段飼養。
2、從菲牛蛭中提取水蛭素上述提到，目前提取水蛭素的方法大多採用將水蛭整體打漿或曬乾然後用溶劑提取，雖然文獻介紹了使食血水蛭充分吸取動物血，數分鐘至數小時後用物理或化學方法使血液從水蛭體內流出，收集流出的橙紅色血液體，再從血中提取水質素，這種方法仍然複雜，成本也較高。
本發明提取水蛭素的方法包括菲牛蛭原料選擇和清洗，採用化學物質刺激鮮活菲牛蛭使其分泌出唾液，然後對其唾液過濾，再將水蛭素粗品進行深加工得到符合醫用的水蛭素。
以上所述的菲牛蛭原料選擇和清洗是從飼養池內撈出成熟、健康的菲牛蛭放到盛有清水的池子中，每隔2天換水清洗一次，不餵食，如此保持10-30天，最後用蒸餾水浸泡10-30分鐘。
以上所述的菲牛蛭餵飽誘導物質和擠壓的方法是將清洗乾淨的菲牛蛭用誘導物質充分餵飽菲牛蛭，然後對菲牛蛭進行擠壓使其分泌出唾液(水蛭素粗品)，所採用的所採用的誘導物質包括無機鹽、有機酸和濃度較低的無機酸，包括乙酸、鹽酸、磷酸、檸檬酸、精氨酸、賴氨酸、抗壞血酸、胱氨酸、氯化鈉、氯化鉀、碳酸鈉、磷酸鈉、磷酸二氫鉀的一種或兩種、兩種以上的混合物，其濃度為0.1-3％，使水溶液的PH在4.5-6.8之間。具體方法是先配置好純淨的混合水溶液，讓菲牛蛭充分吃飽，然後對其進行擠壓，使其分泌出唾液，每條鮮活菲牛蛭可以反覆提取6-7次，每次能提取水蛭素粗品6-7毫升左右。
將水蛭素粗品進行深加工包括分離和純化和陰離子交換柱層析、凝膠過濾柱層析；分離和純化的方法是將從上述菲牛蛭體內提取出的唾液腺分泌物提取液中加4倍置冰箱中預冷的含水15％的丙酮，攪拌後置冰箱中過夜，吸出上清丙酮並離心，在沉澱中加入預冷的三氯乙酸使其溶解，離心除去殘渣，待上樣進行柱層析。
陰離子交換柱層析的方法是取適量DEAE-C加蒸餾水使其膨脹，按常規方法依次用NaoH-NaCl混合液、HCl及NaOH-NaCl混合液各浸泡30分後用蒸餾水洗滌至中性。裝柱至所需高度，用檸檬酸一檸檬酸鈉緩衝液平衡，5ml的唾液腺分泌物濃縮液或上述三氯乙酸溶液上樣進行梯度洗脫並用記錄儀繪出洗脫曲線，分段收集洗脫液，經檢測，將有活力部分集中於透析袋中用甘油濃縮，再用雙縮腮法測總蛋白含量，繼續以下的柱層析。
凝膠過濾柱層析的方法是取適量的加蒸餾水浸泡2-4h，按常規方法用NaoH-NaCl混合液浸泡0.5h，抽濾除去鹼液並用蒸餾水洗滌至中性，加熱煮沸除去氣泡。裝柱至所需高度，用TRIS-HCl-NaCl緩衝液平衡，將上述有活力洗脫液的濃縮液上樣、洗脫並用記錄儀繪出洗脫曲線，分段收集洗脫液，分別檢測活力，將有活力部分集中於透析袋中用甘油濃縮。再測活力後，待用分光光度計在200nm至400nm波長範圍內掃描。
與現有的技術相比，本發明的突出實質性特點和顯著的進步是1、菲牛蛭(金邊螞蟥)含抗凝血物質比其它品種水蛭特別是比目前文獻報導的寬體金線蛭含抗凝血物質含量高，也比日本醫蛭的藥用效果好。
2、飼養技術先進，特別是採用不凝固的血液既能保證血液不腐變，又使菲牛蛭能吸到新鮮血液，保證了菲牛蛭的健康。
3、採用人工分級分段馴養、餵養的方法能保證菲牛蛭生長狀態良好不會發生小菲牛蛭無法搶食而生長緩慢的現象。
4、加入野生的優良品種交配，使之不產生近親繁殖的方法能保障菲牛蛭不發生退化。
5、最重要的一點是本發明採用廣西特有的菲牛蛭活體提取水蛭素的方法，使每條鮮活菲牛蛭可以反覆提取6-7次，每次能提取6-7毫升左右，經離心分離、離子交換等措施得到液體的水蛭素、或者經乾燥得到固體水蛭素。每周可以提取1次，這樣不但方法簡單容易操作，產品質量好，又節約資源，提高菲牛蛭利用價值。菲牛蛭養殖1年可提取，菲牛蛭的生命周期為5年左右。
具體實施例方式
一、菲牛蛭飼養實施例實施例1，野外捕捉到健壯的菲牛蛭，按大小放在小水池(一般每個4-8平方米為好)中進行細緻的餵養和料理，每立方米水可放成品600-1500條左右，在飼養過程中可以採用流動的水和通過加氧措施，餵食的食物包括加入鈉鹽的新鮮牛血、豬血、羊血等，所述的鈉鹽包括乙酸鈉、磷酸鈉、檸檬酸鈉、精氨酸鈉、賴氨酸鈉、抗壞血酸鈉、胱氨酸鈉，主要使血液不凝固，在餵食過程中將不凝固的血液放到盛有海棉的碟子上，然後將碟子放到浮在養殖池水中的泡沫板上，同時一邊攪動池水，讓菲牛蛭吸引過來覓食。在繁殖時用引進優良種源健壯的菲牛蛭與之交配。
實施例2，引進優良種源健壯的菲牛蛭，按大小放在小水池(一般每個4-8平方米為好)中進行細緻的餵養和料理，每立方米水可放成品600-1500條左右，在飼養過程中可以採用流動的水和通過加氧措施，餵食的食物包括用0.05-0.2％鈉鹽處理得到的新鮮牛血、豬血、羊血等，所述的鈉鹽包括乙酸鈉、磷酸鈉、檸檬酸鈉、精氨酸鈉、賴氨酸鈉、抗壞血酸鈉、胱氨酸鈉，主要使血液不凝固，用牛小腸、豬小腸或人工腸衣裝好，然後用細線將小腸捆成每節2-3釐米的節狀直接防入養殖水中餵養。在繁殖時用野外捕捉到健壯的菲牛蛭與之交配。
二、菲牛蛭提取水蛭素實施例實施例1，從飼養池內撈出成熟、健康的菲牛蛭放到盛有清水的池子中，每隔2天換水清洗一次，不餵食，如此保持10-30天，最後用蒸餾水浸泡10-30分鐘，將清洗乾淨的菲牛蛭用乙酸、檸檬酸、氯化鈉、碳酸鈉混合物的水溶液，其濃度為0.1％，PH在4.5，溶解於蒸餾水後充分餵飽菲牛蛭，然後對菲牛蛭進行擠壓使其分泌出唾液(水蛭素粗品)，和加入酸的濃度使水溶液的PH在5-6.5之間。具體方法是先配置好純淨的酸溶液，讓菲牛蛭充分吃飽，然後對其進行擠壓，使其分泌出唾液得到水蛭素粗品，然後對其唾液經離心除雜，再進行分離和純化。
分離和純化唾液腺分泌物的製備是將250-300ml從上述菲牛蛭體內提取出的唾液腺分泌物提取液中加4倍置冰箱中預冷的含水15％的丙酮，攪拌後置冰箱中過夜，吸出上清丙酮並離心，在沉澱中加入預冷的三氯乙酸(約25ml)使其溶解，離心除去殘渣，待上樣進行柱層析。
陰離子交換柱層析取適量DEAE加蒸餾水使其膨脹，按常規方法依次用0.5MOL/L NaOH-NaCl混合液、0.5mol/L HCl及0.5mol/L NaOH-NaCl混合液各浸泡30分後用蒸餾水洗滌至中性。裝柱(2cm×60cm)至所需高度，用pH4.6的0.1mol/L檸檬酸一檸檬酸鈉緩衝液平衡，5ml的唾液腺分泌物濃縮液或上述三氯乙酸溶液上樣進行梯度洗脫並用記錄儀繪出洗脫曲線，分段收集洗脫液。經檢測，將有活力部分集中於透析袋中用甘油濃縮，再用雙縮腮法測總蛋白含量，繼續以下的柱層析。
陰離子交換柱層析取適量DEAE-C加蒸餾水使其膨脹，按常規方法依次用0.5MOL/LNaOH-NaCl混合液、0.5mol/L HCl及0.5mol/L NaOH-NaCl混合液各浸泡30分後用蒸餾水洗滌至中性。裝柱(2cm×60cm)至所需高度，用pH4.6的0.1mol/L檸檬酸一檸檬酸鈉緩衝液平衡，5ml的唾液腺分泌物濃縮液或上述三氯乙酸溶液上樣進行梯度洗脫並用記錄儀繪出洗脫曲線，分段收集洗脫液。經檢測，將有活力部分集中於透析袋中用甘油濃縮，再測總蛋白含量，繼續以下的柱層析。
實施例2，從飼養池內撈出成熟、健康的菲牛蛭放到盛有清水的池子中，每隔2天換水清洗一次，不餵食，如此保持10-30天，最後用蒸餾水浸泡10-30分鐘，將清洗乾淨的菲牛蛭用精氨酸、胱氨酸、磷酸鈉混合物的水溶液，其濃度為0.5％，PH在4.5-6.8之間，溶解於蒸餾水後充分餵飽菲牛蛭，然後對菲牛蛭進行擠壓使其分泌出唾液(水蛭素粗品)然後對其唾液經離心除雜，再按實施例1的方法進行分離和純化。
實施例3，從飼養池內撈出成熟、健康的菲牛蛭放到盛有清水的池子中，每隔2天換水清洗一次，不餵食，如此保持10-30天，最後用蒸餾水浸泡10-30分鐘，將清洗乾淨的菲牛蛭用鹽酸、碳酸鈉、磷酸二氫鉀混合物的水溶液，其濃度為3％，PH在6，溶解於蒸餾水後充分餵飽菲牛蛭，然後對菲牛蛭進行擠壓使其分泌出唾液(水蛭素粗品)，將這些水蛭素粗品再按常規方法提純。
實施例4，從飼養池內撈出成熟、健康的菲牛蛭放到盛有清水的池子中，每隔2天換水清洗一次，不餵食，如此保持10-30天，最後用蒸餾水浸泡10-30分鐘，將清洗乾淨的菲牛蛭用抗壞血酸、胱氨酸、氯化鈉混合物的水溶液，其濃度為0.5％，PH在5.5之間，溶解於蒸餾水後充分餵飽菲牛蛭，然後對菲牛蛭進行擠壓使其分泌出唾液(水蛭素粗品)，然後對其唾液經離心除雜，再按實施例1的方法進行分離和純化。
實施例5，從飼養池內撈出成熟、健康的菲牛蛭放到盛有清水的池子中，每隔2天換水清洗一次，不餵食，如此保持10-30天，最後用蒸餾水浸泡10-30分鐘，將清洗乾淨的菲牛蛭用磷酸、賴氨酸、碳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀混合物的水溶液，其濃度為1.5％，PH在5.0之間，溶解於蒸餾水後充分餵飽菲牛蛭，然後對菲牛蛭進行擠壓使其分泌出唾液(水蛭素粗品)，然後對其唾液經離心除雜，再按實施例1的方法進行分離和純化。
權利要求
1.一種菲牛蛭的養殖方法及水蛭素的提取技術，其特徵在於通過引進優良種源或野外捕捉到健壯的菲牛蛭、放在水體乾淨的水池或池塘，人工分級分段馴化、餵養、維持適宜的溫度，進行人工繁殖，待飼養到一定程度，採用誘導物質刺激鮮活菲牛蛭使其分泌出唾液，然後對其唾液經過進一步的純化分離便可以得到天然水蛭素，再將水蛭素粗品進行深加工得到符合醫用的水蛭素。
2.根據權利要求1所述的菲牛蛭的養殖方法及水蛭素的提取方法，其特徵在於菲牛蛭的養殖方法是人工分級分段馴化、餵養的方法是把繁育種苗和飼養小苗放在小水池中，餵食，所餵食的食物包括用0.05-0.2％鈉鹽處理得到的新鮮牛血、豬血、羊血等，使血液不凝固，在餵食過程中將不凝固的血液放到盛有海棉的碟子上，然後將碟子放到浮在養殖池水中的泡沫板上，同時一邊攪動池水，讓菲牛蛭吸引過來覓食，或者將已經加有藥品的腥畜血液用牛小腸、豬小腸或人工腸衣裝好，然後用細線將小腸捆成每節2-3釐米的節狀直接防入養殖水中餵養。
3.根據權利要求1所述的菲牛蛭的養殖方法及水蛭素的提取方法，其特徵在於所述的人工繁殖包括到一定時候在野外捕捉到的菲牛蛭經過鑑定後，將它放在小水池裡，使其適應新的環境，然後通過人工分級分段飼養，再進行育種和繁殖。
4.根據權利要求1和2所述的菲牛蛭的養殖方法及水蛭素的提取方法，其特徵在於使血液不凝固的處理新鮮牛血、豬血、羊血0.05-0.2％鈉鹽包括乙酸鈉、磷酸鈉、檸檬酸鈉、精氨酸鈉、賴氨酸鈉、抗壞血酸鈉、胱氨酸鈉。
5.根據權利要求1所述的菲牛蛭的養殖方法及水蛭素的提取方法，其特徵在於提取水蛭素的方法包括菲牛蛭原料選擇和清洗，採用化學物質刺激鮮活菲牛蛭使其分泌出唾液，然後對其唾液過濾，再將水蛭素粗品進行深加工得到符合醫用的水蛭素。
6.根據權利要求1和5所述的菲牛蛭原料選擇和清洗是從飼養池內撈出成熟、健康的菲牛蛭放到盛有清水的池子中，每隔2天換水清洗一次，不餵食，如此保持10-30天，最後用蒸餾水浸泡10-30分鐘。
7.根據權利要求1和5所述的菲牛蛭的養殖方法及水蛭素的提取方法，其特徵在於所述的刺激鮮活菲牛蛭使其分泌出唾液的化學物質包括無機鹽、有機酸和濃度較低的無機酸乙酸、鹽酸、磷酸、檸檬酸、精氨酸、賴氨酸、抗壞血酸、胱氨酸、氯化鈉、氯化鉀、碳酸鈉、磷酸鈉、磷酸二氫鉀的其中一種或兩種、兩種以上的混合物，其水溶液濃度為0.1-3％，PH在4.5-6.8之間。
8.根據權利要求1和5所述的菲牛蛭的養殖方法及水蛭素的提取方法，其特徵在於將水蛭素粗品進行深加工包括分離和純化和陰離子交換柱層析、凝膠過濾柱層析；分離和純化的方法是將從上述菲牛蛭體內提取出的唾液腺分泌物提取液中加4倍置冰箱中預冷的含水15％的丙酮，攪拌後置冰箱中過夜，吸出上清丙酮並離心，在沉澱中加入預冷的三氯乙酸使其溶解，離心除去殘渣，待上樣進行柱層析。陰離子交換柱層析的方法是取適量DEAE加蒸餾水使其膨脹，按常規方法依次用NaOH-NaCl混合液、HCl及NaoH-NaCl混合液各浸泡30分後用蒸餾水洗滌至中性，裝柱至所需高度，用檸檬酸一檸檬酸鈉緩衝液平衡，5ml的唾液腺分泌物濃縮液或上述三氯乙酸溶液上樣進行梯度洗脫並用記錄儀繪出洗脫曲線，分段收集洗脫液，經檢測，將有活力部分集中於透析袋中用甘油濃縮，再測總蛋白含量，繼續以下的柱層析。凝膠過濾柱層析的方法是取適量的加蒸餾水浸泡2-4h，按常規方法用NaOH-NaCl混合液浸泡0.5h，抽濾除去鹼液並用蒸餾水洗滌至中性，加熱煮沸除去氣泡。裝柱至所需高度，用TRIS-HCl-NaCl緩衝液平衡，將上述有活力洗脫液的濃縮液上樣、洗脫並用記錄儀繪出洗脫曲線，分段收集洗脫液，分別檢測活力，將有活力部分集中於透析袋中用甘油濃縮，再測活力後，待用分光光度計在波長範圍內掃描。
全文摘要
本發明提供了一種菲牛蛭的養殖方法及水蛭素的提取方法，是通過引進優良種源或野外捕捉到健壯的菲牛蛭，進行人工分級分段馴、餵養，進行人工繁殖，待飼養到一定程度，採用化學物質刺激鮮活菲牛蛭使其分泌出唾液，然後對其唾液進一步分離過濾得到水蛭素粗品，再將水蛭素粗品進行深加工得到符合醫用的水蛭素，該菲牛蛭含抗凝血物質比其它品種菲牛蛭含量高，藥用效果好，提取水蛭素方法簡單，提取水蛭素後將菲牛蛭放回水池養殖，相隔一周或10天又可以再提取，每條鮮活菲牛蛭可以反覆提取6－7次，每次能提取水蛭素粗品6－7毫升左右，產品質量好，又節約資源，提高了菲牛蛭的利用價值。
文檔編號A01K67/00GK1423929SQ0311356
公開日2003年6月18日 申請日期2003年1月15日 優先權日2003年1月15日
發明者周維海 申請人:周維海