免疫刺激劑的製作方法

2023-12-05 09:04:36 1

專利名稱：免疫刺激劑的製作方法
技術領域：
本發明屬於免疫刺激劑(Immunostimulant也稱為免疫賦予劑或免疫促進劑等)的技術領域，尤其是關於提供由免疫性寡核苷酸和新的轉染試劑複合化得到的安全、藥效高的免疫刺激劑。
背景技術：
具有刺激免疫應答的活性的寡核苷酸(以下，有時表述為免疫刺激性寡核苷酸、免疫刺激性核酸或免疫刺激性DNA)，是1984年由Tokunaga等人在檢索BCG的抗腫瘤成分的過程中發現的。於是清楚了，其活化作用起因於含有胞嘧啶·鳥嘌呤二核苷酸(5』-CpG-3』所稱CpG序列)的特定鹼基序列(Tokunaga，T.，et al.，J.Natl.Cancer Inst.，72，955(1984)(非專利文獻1)；Tokunaga，T.，et al.，J.Natl.Cancer Res.，79，682(1988)(非專利文獻2))。
已證實脊椎動物或植物以外的帶有CpG序列的基因組DNA也具有同樣的活性。認為CpG核心前後的序列對免疫刺激活性也是重要的，尤其是具有未被甲基化的CpG、其前後排列有取代嘌呤(Pu)和取代嘧啶(Py)的5』-PuPuCpGPyPy-3』，作為代表性非甲基化CpG模體得到共有序列(Krieg，A.，et al.，Nature，374，576(1995)(非專利文獻3))。此處，所稱非甲基化CpG模體是指，如常被人所知的，含有至少一個胞嘧啶(C)-鳥嘌呤(G)序列的短核苷酸序列(一般來說是由4-10個核苷酸構成的序列)，並且該胞嘧啶-鳥嘌呤序列中胞嘧啶的5位未被甲基化。在以下說明中，所稱CpG只要沒有特別說明，就是指非甲基化CpG。
下面記載的是有用的CpG模體(六聚體)的例子(其中，A腺嘌呤、G鳥嘌呤、C胞嘧啶、T胸腺嘧啶、U尿嘧啶)。
AACGTT、AGCGTT、GACGTT、GGCGTT、AACGTC、AGCGTC、GACGTC、GGCGTC、AACGCC、AGCGCC、GACGCC、GGCGCC、AACGCT、AGCGCT、GACGCT及GGCGCT
包含這些序列的由8-100個左右構成的寡核苷酸具有免疫刺激活性(特表2001-503254(專利文獻1))。
以下序列是報導過對NK細胞活化有效的包含CpG模體的免疫刺激性寡核苷酸的例子(下劃線部分表示CpG模體，此外，大寫字母表示巰基化DNA)(伊保澄子，山本三郎，Annual Review免疫2001，137-146(2002)非專利文獻4))。
accgataccggtgccggtgacggcaccacgaccgatagcgctgccggtgacggcaccacgaccgatgacgtcgccggtgacggcaccacgaccgattcgcgagccggtgacggcaccacgggggggggggggcgatcggggggggggggggggggggggggacgatcgtcggggggggggggggggggggggaacgttggggggggggggGAGAACGCTCGACCTTCGATTCCATGACGTTCCTGATGCTTCTCCCAGCGTGCGCCATGGggtcaacgttgaGGGGGg除CpG模體以外，還知道一些免疫刺激性核酸序列。舉例來說，如5』TTTT3』等富含胸腺嘧啶的Trich核酸，如5』GGGG3』等富含鳥嘌呤的Grich核酸，富含胸腺嘧啶和鳥嘌呤兩者的TG rich核酸，富含胞嘧啶的C rich核酸等作為非CpG免疫刺激性核酸，最近備受矚目(特表平08-500738(專利文獻2)；特表2002-512599(專利文獻3)；特表2003-510282(專利文獻4)；特表2003-510290(專利文獻5))。
這些免疫刺激性核酸對免疫細胞的效果的重要特徵在於活化抗原呈遞細胞。直接作用於小鼠、人的單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞等，使其產生IL-6、TNF-α、IL-12、IFNα/β、IL-18、一氧化氮等具有免疫增強作用的細胞因子。
涉及用於免疫性疾病治療的核酸以及DNA疫苗組合物的專利申請，最近不斷增加，例如，the University of Iowa Research Foundation提出的申請中，為了用於治療因病毒、細菌、真菌或寄生物感染引起的免疫缺陷，患癌症的人或動物，因曝露於脂多糖、內毒素而發生急性呼吸減少的待檢體，以及用作佐劑，提出了多個CpG模體序列(特表平10-506265(專利文獻6)；特表2001-503267(專利文獻7)；特表2001-513776(專利文獻8))。
在將CpG模體用於DNA疫苗的專利申請中，也確認了針對魚貝類的序列(特開平9-285291(專利文獻9))。
同樣，也有旨在用於預防動物細小病毒(parvovirus)感染的序列(特表2000-509976(專利文獻10))。
此外，專利文獻1、11以及12等中，也記載了多個具有免疫刺激活性的類似序列(特表2002-517156(專利文獻11)；特表2002-526425(專利文獻12))。
和使用反義DNA進行基因治療的情形一樣，免疫刺激性寡核苷酸的磷酸骨架，為了耐受核酸酶，磷酸二酯鍵部分被修飾成硫代磷酸酯的例子很多。此外，出於增加免疫刺激性寡核苷酸和細胞的親和性的目的，和脂質體、陽離子脂質、膽固醇等轉染試劑並用的例子也很多。
作為基因治療時反義DNA的轉染試劑，起初，逆轉錄病毒、腺病毒在體外產生了非常值得期待的效果，然而，由於這些天然來源的病毒具有炎症性、免疫原性、並有突變誘發和重組入細胞基因組中的危險，它們在體內的使用受到限制(Mulligan，Science，260，926-932(1993)(非專利文獻5)；Miller，Nature，357，455-460(1992)(非專利文獻6)；Crystal，Science，270，404-410(1995)(非專利文獻7))。
作為天然來源的基因的轉染試劑的替代物，已有提示使用人工材料的非病毒類載體，不但其操作比病毒類簡便，而且確實能夠以良好的效率將DNA集聚於細胞(Tomlinson and Rolland，J.Contr.Rel.，39，357-372(1996)(非專利文獻8))。
目前作為非病毒性人工載體研究的比較多的是聚乙烯亞胺(PEI)。在多個不同的貼壁細胞及懸浮細胞系中，具有三維分支結構的陽離子聚合物PEI，在某些場合產生了轉染率大於等於平均數以上的效果(Boussif et al.，GeneTherapy，3，1074-1080(1996)(非專利文獻9))。
此外，和PEI同樣用含氮取代基修飾的各種陽離子聚合物、陽離子性脂質等，以基因載體、轉染試劑、藥物載體等稱謂最近提出了多個專利申請。
但是，現狀是如PEI之類的陽離子聚合物的安全性都沒有得到確認。通常，氨基的存在對於賦予陽離子性是不可或缺的，然而鑑於具有氨基的物質的生理活性高，因此要考慮體內毒性等危險性。事實上，至今探討過的所有陽離子聚合物也仍未得到實際應用，在醫藥品添加物辭典等中也未記載(醫藥品添加物辭典(非專利文獻10)；日本醫藥品添加劑協會編集，藥事日報社(非專利文獻11))。
另一方面，在作為肌肉內注射製劑的臨床藥物實際使用的多糖類物質中，有β-1，3-葡聚糖。很早就已知道該多糖在天然狀態下具有三重螺旋結構(Theresa M.McIntire and David A.Brant，J.Am.Chem.Soc.，120，6909(1998)(非專利文獻12))。
進而，該多糖在生物體內的安全性已被證實，其作為針對婦科癌症的免疫增強法的肌肉內注射藥實際已有20年以上的使用業績(清水、陳、荷見、增淵，Biotherapy，4，1390(1990)(非專利文獻13)；長谷川，Oncology andChemotherapy，8，225(1992)(非專利文獻14))。
已知將這種β-1，3-葡聚糖和DNA等生物材料連接，可用作基因載體。該在先技術中描述了，直接使用天然的β-1，3-葡聚糖，即具有三重螺旋結構的β-1，3-葡聚糖，通過共價鍵用該葡聚糖和具有生化活性的材料製造β-1，3-葡聚糖/生物材料結合物的方法(PCT/US95/14800)(專利文獻13)。
此外，最近，本發明人發現以β-1，3-糖苷鍵作為主鏈的多糖類物質通過進行人工處理，可以和各種核酸形成新型複合物(PCT/JP00/07875(專利文獻14)；PCT/JP02/02228(專利文獻14)；櫻井、新海，J.Am.Chem.Soc.，122，4520(2000)(非專利文獻15)；木村、甲元、櫻井、新海，Chem.Lett.，1242(2000)(非專利文獻16))。
本發明目的在於，將免疫刺激性寡核苷酸和安全、轉染效果好的新型載體形成複合體，作為免疫刺激劑提供。

發明內容
本發明人通過將帶有β-1，3-糖苷鍵的多糖類物質作為載體(轉染試劑)使用，發現能夠增強免疫刺激性寡核苷酸的作用，得到免疫力增強優異且安全的免疫刺激劑。
因此，依據本發明，可提供包括免疫刺激性寡核苷酸和具有β-1，3-糖苷鍵的多糖類物質的複合體的免疫刺激劑。


圖1表示的是以導入陽離子性官能團的情形為例，本發明使用的修飾多糖的合成方案的例子。
圖2表示的是本發明使用的肽R8和RGD的胺基酸序列。
圖3表示的是本發明使用的肽修飾裂褶菌多糖(R8_SPG及RGD-SPG)的合成方案的例子。
圖4表示的是顯示依據本發明的免疫刺激劑的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，該免疫刺激劑是由裂褶菌多糖、氨基修飾裂褶菌多糖、精氨酸修飾裂褶菌多糖、膽固醇修飾裂褶菌多糖、R8修飾裂褶菌多糖、RGD修飾裂褶菌多糖和CpGDNA複合體化形成。
圖5表示的是依據本發明的免疫刺激劑，即，和裂褶菌多糖、化學修飾裂褶菌多糖形成複合體的CpG DNA的刺激所致的來自小鼠來源腹腔內巨噬細胞的細胞因子IL-12產生量的增強效果的結果。
圖6顯示的是依據本發明的免疫刺激劑，即，和裂褶菌多糖、化學修飾裂褶菌多糖形成複合體的non-CpG DNA(不包含CpG模體的寡核苷酸)所致的來自小鼠來源腹腔內巨噬細胞的IL-12的產生效果的結果。
圖7顯示的是依據本發明的免疫刺激劑，即和裂褶菌多糖、化學修飾裂褶菌多糖形成複合體的CpG DNA的刺激所致的來自小鼠來源巨噬細胞樣細胞J774.A1的細胞因子IL-12產生量的增強效果的結果。
圖8顯示的是依據本發明的免疫刺激劑，即和裂褶菌多糖、化學修飾裂褶菌多糖形成複合體的CpG DNA的刺激所致的來自小鼠來源脾細胞的細胞因子IL-6產生量的增強效果的結果。
圖9顯示的是依據本發明的免疫刺激劑，即和裂褶菌多糖、化學修飾裂褶菌多糖形成複合體的CpG DNA的刺激所致的來自小鼠來源脾細胞的細胞因子IL-12產生量的增強效果的結果。
圖10顯示的是依據本發明的免疫刺激劑，即和裂褶菌多糖、化學修飾裂褶菌多糖形成複合體的non-CpG DNA所致的來自小鼠來源脾細胞的IL-6的產生效果的結果。
圖11顯示的是依據本發明的免疫刺激劑，即和裂褶菌多糖、化學修飾裂褶菌多糖形成複合體的non-CpG DNA所致的來自小鼠來源脾細胞的IL-12的產生效果的結果。
圖12顯示的是依據本發明的免疫刺激劑，即和裂褶菌多糖、化學修飾裂褶菌多糖形成複合體的CpG DNA(PO)(帶有磷酸二酯鍵的CpG DNA)的刺激所致的來自小鼠來源脾細胞的細胞因子IL-6產生量的增強效果的結果。
圖13顯示的是依據本發明的免疫刺激劑，即和裂褶菌多糖、化學修飾裂褶菌多糖形成複合體的CpG DNA(PO)的刺激所致的來自小鼠來源脾細胞的細胞因子IL-12產生量的增強效果的結果。
圖14顯示的是依據本發明的免疫刺激劑，即和裂褶菌多糖、化學修飾裂褶菌多糖形成複合體的non-CpG DNA(PO)(帶有磷酸二酯鍵、不含有CpG模體的寡核苷酸)所致的來自小鼠來源脾細胞的細胞因子IL-6的產生效果的結果。
圖15顯示的是依據本發明的免疫刺激劑，即和裂褶菌多糖、化學修飾裂褶菌多糖形成複合體的non-CpG DNA(PO)所致的來自小鼠來源脾細胞的細胞因子IL-12的產生效果的結果。
圖16顯示的是依據本發明的免疫刺激劑，即和裂褶菌多糖、化學修飾裂褶菌多糖形成複合體的CpG DNA所致的來自小鼠來源脾細胞的細胞因子IL-4的產生效果的結果。
圖17顯示的是依據本發明的免疫刺激劑，即和裂褶菌多糖、化學修飾裂褶菌多糖形成複合體的CpG DNA(PO)所致的來自小鼠來源脾細胞的細胞因子IL-4的產生效果的結果。
圖18顯示的是依據本發明的免疫刺激劑，即和裂褶菌多糖、化學修飾裂褶菌多糖形成複合體的non-CpG DNA所致的來自小鼠來源脾細胞的細胞因子IL-4的產生效果的結果。
圖19顯示的是依據本發明的免疫刺激劑，即和裂褶菌多糖、化學修飾裂褶菌多糖形成複合體的non-CpG DNA(PO)所致的來自小鼠來源脾細胞的細胞因子IL-4的產生效果的結果。
具體實施例方式
本發明中，使用免疫刺激性寡核苷酸作為主要藥物。此處，用於本發明的免疫刺激性寡核苷酸是指具有刺激免疫應答、增強免疫力活性的寡核苷酸，可以舉出前述文獻中記載的各種寡核苷酸，但並不限於這些。本發明中，作為對象的免疫刺激性寡核苷酸，優選使用如前述文獻中記載的各種包含非甲基化CpG模體的免疫刺激性寡核苷酸。此外，也可以使用同樣例示的非CpG免疫刺激性寡核苷酸(非甲基化CpG模體以外的免疫刺激性寡核苷酸)。非CpG免疫刺激性寡核苷酸可以單獨或和CpG模體組合使用。給予的這些寡核苷酸作用於巨噬細胞等免疫細胞，經由細胞因子等介導而產生增強免疫力的效果。
本發明中使用的寡核苷酸的磷酸骨架，為了增強核酸酶耐性，通常使用主鏈的磷酸二酯鍵部分經過硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯修飾的寡核苷酸，但磷酸二酯鍵部分或全部保留的寡核苷酸也可以使用。
本發明的免疫刺激劑是由如上述那樣的免疫刺激性寡核苷酸和具有β-1，3-糖苷鍵的多糖類物質的複合體形成，此時該多糖成為轉染試劑。這裡，用在本發明的具有β-1，3-糖苷鍵的多糖類物質優選β-1，3-葡聚糖或β-1，3-木聚糖。其中，從裂褶菌多糖、香菇多糖、小核菌葡聚糖、熱凝多糖、茯苓多糖、灰樹花多糖或海帶多糖中選擇的β-1，3-葡聚糖是適宜的，尤其優選如裂褶菌多糖、香菇多糖或小核菌葡聚糖那樣的，含有多個1，6-吡喃葡萄糖甙分枝(側鏈率33～40％)的β-1，3-葡聚糖。
用在本發明的如上述那樣的多糖類物質，可以直接使用天然物，但在轉染能方面經過核酸結合性和/或細胞膜親和性官能團修飾的多糖類物質更為適宜。此處，核酸結合性是指和核酸相互作用而提高多糖類物質和相關核酸之間的結合的性質。此外，細胞膜親和性是指和細胞膜蛋白、細胞膜脂質(磷脂)具有親和性。本發明中，優選使用以官能團修飾過的多糖類物質，該官能團發揮上述核酸結合性和細胞膜親和性的任意一方或雙方性質。作為尤其適用於本發明的核酸結合性和/或細胞膜親和性官能團的例子，可以舉出陽離子性官能團、類固醇性官能團、鹼性胺基酸官能團以及肽性官能團。
陽離子性官能團是帶正電荷的官能團(有關其具體例，參照後述實施例2)、通過對多糖類物質賦予陽離子性官能團，藉助和DNA、RNA之類核酸所帶的負電荷之間的靜電相互作用，增強多糖類物質和核酸之間的結合。類固醇性官能團(有關其具體例，參照實施例4)是核酸結合性和類固醇骨架所具有的細胞親和性效果都為人所期待的官能團，其中，所述核酸結合性起因於經由間隔子(spacer)結合於類固醇骨架的氨基所帶的正電荷。鹼性胺基酸官能團(有關具體例，參照實施例3)是起因於胺基酸的氨基正電荷的核酸結合性和鹼性胺基酸殘基所具有的細胞親和性效果都為人所期待的官能團。肽性官能團，例如後述實施例5～7所示的R8、RGD那樣，是指含有主要以細胞膜親和性所產生的效果來促進核酸轉染能的胺基酸序列的肽鏈。作為對多糖類物質進行修飾，賦予其如上面那樣的核酸結合性和/或細胞親和性官能團的方法，可以是通常的有機化學手段，一般來說，將多糖的1，6-吡喃葡萄糖甙分枝以高碘酸氧化後，再經過還原性氨基化，使其結合適合的官能團(參照圖1)。關於這些事項，在本發明人的PCT/JP02/02228(專利文獻15)中進行了詳細描述，下面對其主要內容再予以說明。
如已經說過的那樣，為了得到構成本發明的免疫刺激劑的修飾多糖，將核酸結合性官能團和/或細胞膜親和性官能團賦予多糖時，一般是在多糖的1，6-吡喃葡萄糖甙分枝以高碘酸氧化後，進行還原性氨基化。
因而，形成本發明使用的修飾多糖的核酸結合性官能團和細胞膜親和性官能團，是來源於具有適用於還原性氨基化的伯胺、仲胺或肼的化合物的基團。
例如，作為適用在本發明中的陽離子性官能團，可以是來源於下面所示的至少含有一個伯或仲氨基的鏈狀或環狀化合物的官能團，當然並不限於這些。這些能夠從市售的具有氨基的化合物容易地合成。
圖1表示的是以導入陽離子性官能團(上述(a)所示的官能團)作為核酸結合性官能團的情況為例，得到用在本發明中的陽離子性修飾多糖的方法。圖中(i)表示以高碘酸進行氧化；(ii)表示希夫式鹼的形成；(iii)表示用硼氫化鈉還原希夫式鹼。側鏈包含未反應的3位羥基的β-1，3-葡聚糖的情況下，得到反應物2.X、3.X、4.X。5和6表示該反應在側鏈的一部分發生。
此外，依據本發明，通過高碘酸氧化後接著進行還原性氨基化，將類固醇性官能團添加於本發明的多糖的分枝，該類固醇性官能團優選如下述式(2)所示的化合物那樣的，來源於具有類固醇骨架，並在該類固醇骨架上經由間隔子而結合有氨基這樣的結構的官能團。
此處，R1、R2、R3是氫或包含碳、氧、氮或氫的取代基。此外，R4是間隔子，是氫或包含碳、氧、氮或氫的環狀或直鏈狀化合物來源的基團。R4結合於類固醇骨架的位置可以是任何位置。此外，即使是不符合上述一般式，只要是具有類固醇骨架就都可以使用。例如，皮質甾酮、皮質醇的衍生物等。
這種類固醇性官能團，在將二胺結合到連接在類固醇環上的羥基後，依據上述方法，以還原性氨基化法，將類固醇性官能團導入到β-1，3-葡聚糖的分枝。
為了得到本發明使用的修飾多糖，通過高碘酸氧化和還原性氨基化導入到多糖的分枝的鹼性胺基酸官能團，是下面通式(3)表示的胺基酸來源的官能團。
此處，R5是胺基酸的側鏈。該鹼性胺基酸是為了保護羧基和側鏈而導入到多糖的分枝。
依據本發明，為了製備免疫刺激性寡核苷酸和多糖類物質的複合體，尤其優選依據本發明人的PCT/JP02/02228(專利文獻15)中詳細記載的方法。即，將原本在自然界或水中以三重螺旋結構存在的β-1，3-葡聚糖等多糖溶解於極性溶劑(例如二甲基亞碸)，解離成單鏈後，加入單鏈核酸，通過從溶劑回到水中(再生過程)，用作為由1條核酸和2條多糖構成的三重螺旋狀複合體(參照後述實施例1)。該複合體被認為是1條核酸鏈和2條多糖鏈通過氫鍵和疏水性相互作用而結合成三重螺旋狀的非共價結合性複合體。複合體由於通常能以水溶液的形式得到，因而在用超濾法等比較簡單的方法精製為必要的純度後，可用於治療。
實施例以下，有關免疫刺激劑的具體製備方法、所得到免疫刺激劑的表徵以及體外實驗的給予方法和評價，將在實施例中對本發明的特徵予以詳細說明，但這些實施例並不是用來限制本發明。
實施例1β-1，3-葡聚糖(裂褶菌多糖)和包含非甲基化CpG模體的寡核苷酸(CpGDNA)複合體化而成的免疫刺激劑的製備依照文獻記載的規定方法製備三重螺旋結構的裂褶菌多糖。即，將從ATCC(American Type Culture Collection)得到的Schizophyllum commune.Fries(ATCC 44200)，以最小培養基靜置培養7天後，將細胞成分以及不溶殘渣離心分離得到上清，再將該上清進行超聲處理，得到分子量為45萬的三重螺旋裂褶菌多糖。將該裂褶菌多糖溶解於二甲基亞碸(以下記為DMSO)成為單鏈，調整濃度為30mg/ml後，在該溶液1μl中混合純水3μl、10mM tris緩衝液(pH7.8)1μl和3mg/ml的CpG DNA溶液5μl。均得到均一透明的溶液。(Gregory G.Martin，et al.，Am.Chem.Soc.Polymer Prepr.38(1)，253-254(1997)；K.Tabata，et al.，Carbohydr.Res.，89，121-135(1981))。
使用的包含CpG模體的寡核苷酸(固相合成物)，是以在TCC ATG ACGTTC CTG ATG CT的3』末端帶有40個dA的序列(序列1)作為CpG DNA，所述TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT是在鹼基序列內含有一個胞嘧啶·鳥嘌呤二核苷酸(CpG)序列、並帶有硫代磷酸酯鍵的序列(Y.Aramaki，et al.Biol.Pharm.Bull.，25(3)，351-355(2002))。
實施例2陽離子性衍生物的合成(氨基修飾裂褶菌多糖)和表徵依據圖1方案，合成陽離子性衍生物(用陽離子性官能團修飾後的多糖)。有關氨基導入率的控制，可由高碘酸氧化中使用的高碘酸鈉的當量數進行控制。因而，對於所有導入率而言，其合成法是沒有差別的。此處，說明向裂褶菌多糖導入4.6、17、20以及36％的氨基而得的陽離子修飾裂褶菌多糖的合成例。此外，使用2-氨基乙醇和精胺作為導入的氨基。氨基的導入率可由相對於側鏈葡萄糖的高碘酸鈉的當量數進行控制，其實驗結果示於實施例3中。用實施例1記載的方法得到分子量為45萬的裂褶菌多糖。將該裂褶菌多糖100mg溶於水100ml中。向其中慢慢加入高碘酸鈉水溶液(相對於裂褶菌多糖側鏈葡萄糖，當量數為10％、40％、80％或為過剩量500％)，4℃攪拌2天。將反應溶液以透析膜(排除界限12000)透析後，冷凍乾燥。將得到的白色固體溶於二甲基亞碸20ml，再加入2-氨基乙醇和精胺2ml(大大過剩，大於等於10000當量)，於室溫持續攪拌2天。用醋酸除去過剩的硼氫化鈉使其失活後，用透析膜(排除界限12000)透析(酸性水溶液、鹼性水溶液、蒸餾水)反應液，冷凍乾燥，而製備陽離子性衍生物。
關於氨基導入率的確定，是由依據元素分析的氮微量分析(檢測下限0.05％)來進行。氮微量分析實驗共進行3次，測定結果示於表1。此外，關於分子量，以凝膠滲透色譜(GPC)和粘度測定進行了檢測，明確了該分子量和原料一致。
表1

實施例3胺基酸衍生物的合成(精氨酸修飾的裂褶菌多糖)和表徵依據圖1的方案，合成胺基酸衍生物(以胺基酸性官能團修飾後的多糖)。胺基酸導入率的控制以和實施例2同樣的方法進行。此處，說明向裂褶菌多糖導入4.6、17、20以及36％的精氨酸而得的精氨酸修飾裂褶菌多糖的合成例。
以實施例1中記載的方法得到分子量為45萬的裂褶菌多糖。將該裂褶菌多糖100mg溶於水100ml中。向其中慢慢加入高碘酸鈉水溶液(相對於裂褶菌多糖側鏈葡萄糖，當量數為10％、40％、70％)，4℃攪拌2天。將反應溶液以透析膜(排除界限12000)透析後，冷凍乾燥。將得到的白色固體溶於DMSO 20ml，再加入精氨酸甲酯2ml(大大過剩，大於等於10000當量)，於室溫持續攪拌2天。用醋酸除去過剩的硼氫化鈉使其失活後，反應液以透析膜(排除界限12000)透析(酸性水溶液、鹼性水溶液、蒸餾水)，冷凍乾燥，而製備精氨酸修飾裂褶菌多糖。
關於精氨酸導入率的確定，是由依據元素分析的氮微量分析(檢測下限0.05％)來進行。測定均分為3次進行，測定結果示於表2(M.Numata，et al.，Bioorg.Chem.，31，163-171(2003))。
表2

實施例4膽固醇衍生物(膽固醇修飾裂褶菌多糖)的合成和定性依據圖1的方案，合成膽固醇衍生物(以類固醇性官能團修飾後的多糖)。膽固醇導入率的控制以和實施例2同樣的方法進行。此處，說明修飾相對於側鏈為4.5％的膽固醇後的膽固醇修飾裂褶菌多糖合成法。即，將實施例1製備的裂褶菌多糖100mg溶於水100ml，再加入高碘酸鈉1.65mg(相對於側鏈葡萄糖為5mol％)，於4℃避光攪拌2天。反應液以透析膜(排除界限12000)透析後，冷凍乾燥。
將得到的白色固體懸浮於DMSO中，加入具有氨基末端的類固醇衍生物(此處，依據Ishii等人的文獻合成的3β-膽甾-5-烯-3-基N-(2-氨基乙基)氨基甲酸酯)，室溫持續攪拌2天。在反應液中間隔4小時分兩次加入硼氫化鈉100mg，然後室溫攪拌1天。用醋酸除去過剩的硼氫化鈉使其失活後，將反應液以透析膜(排除界限12000)透析，冷凍乾燥而得到膽固醇修飾裂褶菌多糖(Tsutomu Ishii，Ritsuko Iguchi，Erwin Snip，Masato Ikeda and Seiji Shinkai，Langmuir，17，5825-5833(2001))。
膽固醇導入率的確定，是由依據元素分析的氮微量分析(檢測下限0.05％)來進行。測定均分為3次進行，將結果示於表3。
表3

實施例5包含結合性官能團的肽的合成在由肽鏈(肽性官能團)對裂褶菌多糖進行化學修飾中，肽鏈中有必要含有與裂褶菌多糖具有結合性的官能團。該結合性官能團及間隔子沒有特別限制，但此處作為例子說明含有半胱氨酸的肽鏈的合成，該半胱氨酸具有硫醇基，能夠通過Michael加成反應共價結合固定於馬來醯亞胺基。
作為肽序列，包含已知對細胞膜具有高親和性的精氨酸寡聚體(此處，合成8聚體，其肽鏈記作R8序列2)、以及已知可被細胞粘附因子識別的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的序列(記作RGD序列3)，分別合成在N末端導入有半胱氨酸的肽(參照圖2)。肽鏈依據Fmoc法合成，精製以HPLC(高效液相色譜)進行(精製條件日立L-7100、ODS柱(YMC公司生產)、洗脫液是乙腈/蒸餾水(同時含有0.1體積％的三氟乙酸)＝5/95，經40分鐘梯度到20/80)。以MALDI-TOF MS(基質輔助離子化-飛行時間質量分析器)進行鑑定，鑑定結果示於表4(基質CHCA)(Fmoc法，《固相合成ハンドブツク手冊》，メルク株式會社)。
表4

實施例6肽修飾裂褶菌多糖的合成為了將實施例5中合成的肽鏈導入到裂褶菌多糖，依據圖3所示合成方案合成。反應由高碘酸氧化、還原性氨基化、間隔子導入、肽導入反應這四個階段構成。肽導入率可由高碘酸氧化反應進行控制。第2、4階段由元素分析對反應進展進行評價。結果示於實施例7。
將實施例1製備的裂褶菌多糖300mg溶於水300ml，加入高碘酸鈉水溶液(9.87mg相對於裂褶菌多糖側鏈為0.1當量(10％))，4℃避光攪拌2天。反應液以透析膜(排除界限12000)透析後，冷凍乾燥，得到白色固體1。
將100mg該白色固體1溶於極性有機溶劑DMSO 10ml、28％氨水溶液10ml，加入氰基硼氫化鈉200mg(大量過剩)，室溫攪拌4天。反應液以透析膜(排除界限12000)透析後，冷凍乾燥，得到白色固體2。
將得到的白色固體2溶於DMSO 10ml，加入3-馬來醯亞胺丙酸-N-羥基琥珀醯亞胺酯100mg(大量過剩)，於N2氣流下室溫攪拌24小時。反應溶液以透析膜(排除界限12000)透析後，冷凍乾燥，得到白色固體3。
將得到的白色固體3溶於DMSO 5ml。此外，將實施例1中得到的包含半胱氨酸的肽鏈(約50mg)溶於蒸餾水，和前面的DMSO溶液混合後，將該溶液於室溫攪拌2天。反應溶液以透析膜(排除界限12000)透析後，冷凍乾燥，得到肽修飾裂褶菌多糖。
實施例7肽修飾裂褶菌多糖的表徵對實施例6得到的肽修飾裂褶菌多糖進行表徵(由氮元素分析評價各反應後的導入率、分子量)。表5顯示的是根據氮元素的元素分析測得的實施例6各反應中官能團的導入率(肽修飾率)變化。此外，以凝膠滲透色譜(GPC)評價分子量的結果，確認肽修飾前後分子量並未發生大變化(T.Matsumoto，etal.，Biochim.Biophys.Acta，1670，91-104(2004))。
表5

實施例8陽離子化裂褶菌多糖和胺基酸修飾裂褶菌多糖、膽固醇修飾裂褶菌多糖及肽修飾裂褶菌多糖和CpG DNA的複合體化免疫刺激劑的製備分別將17、20和36％的氨基修飾裂褶菌多糖(以下記作N-SPG)、4.6％的精胺修飾裂褶菌多糖(以下記作SP-SPG)、3.6、9.3、13.5％的精氨酸修飾裂褶菌多糖(以下記作Arg-SPG)、4.5％的膽固醇修飾裂褶菌多糖(以下記作Chol-SPG)、0.3和0.5％的R8修飾裂褶菌多糖(以下記作R8-SPG)、以及1.0和1.3％的RGD修飾裂褶菌多糖(以下記作RGD-SPG)溶於DMSO中，成為單鏈，並調整濃度為30mg/ml，再在各溶液1μl中混合純水3μl、10mM的tris緩衝液(pH7.8)1μl以及實施例1中記載的CpG DNA溶液(3mg/ml)5μl。得到的溶液全部均一透明。
此後，將實施例2、3、4以及6中合成的裂褶菌多糖類統稱為化學修飾裂褶菌多糖，各化學修飾裂褶菌多糖以如R8(0.3)-SPG這種在括號內表示其導入率的標記方式進行表示。
實施例9利用凝膠電泳法對CpG DNA和裂褶菌多糖類的複合體形成予以確認CpG DNA，其磷酸基帶負電荷，向正電荷方向泳動。進而由於向凝膠基質的網絡間隙中泳動，因而，通過CpG DNA和裂褶菌多糖形成複合體，分子量越大，移動率越小。此處，CpG DNA中添加裂褶菌多糖和化學修飾裂褶菌多糖，以實施例1和8中記載的方法合成複合體後，在MOPS緩衝液(20mMMOPS(pH 7.0)、0.5mM醋酸鈉、1mM EDTA、3％二甲基亞碸)中，以2％瓊脂糖凝膠2V/cm電泳1小時，再以Gel Star Nucleic Acids Stain(BMA)染色後，在透射儀下評價其移動率。
依據圖4中例示的瓊脂糖凝膠電泳的結果，隨著裂褶菌多糖和化學修飾裂褶菌多糖的添加，CpG DNA的移動率減少，確認形成了複合體。
實施例10由和裂褶菌多糖或修飾裂褶菌多糖形成複合體後的CpG DNA的刺激所致的來自小鼠來源腹腔巨噬細胞的細胞因子IL-12產生量的增強效果依據文獻記載的規定方法分離小鼠來源腹腔巨噬細胞。即，切斷8周齡的雌性Balb/c小鼠頸動脈，放血將其處死，用70％乙醇消毒後，在其腹部外皮上劃出切口，扯開外皮露出腹膜。在腹部注入冷PBS(磷酸緩衝生理鹽水)5ml，充分按摩後，回收液體。用聚丙烯制離心管於4℃以1000rpm離心10分鐘。除去上清後，將細胞懸浮於含有10％胎牛血清的RPMI 1640培養基(日本生化學會編，新生化學實驗講座12分子免疫學I免疫細胞·サイトカイン，東京化學同人(1989))。
在96孔板中接種懸浮於包含10％胎牛血清的RPMI 1640培養基100μl的小鼠來源腹腔巨噬細胞2×105個，於37℃、5％CO2中培養2小時，將細胞附著於板上後，在其中添加濃度經過重新調整的複合體液，於37℃、5％CO2中培養24小時後回收培養液上清，其中上述複合體液是由下述方法製得的將CpG DNA和實施例1和8中製備的CpG DNA同裂褶菌多糖和化學修飾裂褶菌多糖形成的複合體以超濾膜(排除界限3000)過濾除去DMSO後，重新調整濃度而成。
培養液上清中含有的小鼠IL-12總量的測定是利用Mouse Interleukin-12Total ELISA(ENDOGEN公司生產)，依據其所附操作說明進行的。其測定結果示於圖5。如圖5所示，關於培養液上清中所含的IL-12總量，作為CpG DNA和裂褶菌多糖及化學修飾裂褶菌多糖的複合體的本發明的免疫刺激劑，比CpG DNA單獨給予時，IL-12總量要高。該結果確認了，通過給予本發明的免疫刺激劑，巨噬細胞產生的細胞因子(IL-12)的量增加。
比較例1由和裂褶菌多糖及化學修飾裂褶菌多糖形成複合體後的non-CpG DNA(不含CpG模體的寡核苷酸)所致的來自小鼠來源腹腔巨噬細胞的細胞因子IL-12產生效果替代實施例10中使用的CpG DNA，使用在鹼基序列內不含胞嘧啶·鳥嘌呤二核苷酸(CpG)序列(不顯示免疫刺激效果)的具有硫代磷酸酯鍵的TCC ATG AGC TTC CTG ATG CT的3』末端帶有40個dA的序列的寡核苷酸(以下記作non-CpG DNA序列4)，採用和實施例10同樣的方法，評價來自小鼠來源腹腔巨噬細胞的細胞因子IL-12的產生量。將其結果示於圖6(Y.Aramaki，et al.Biol.Pharm.Bull.，25(3)351-355(2002))。
如圖6所示，在non-CpG DNA單獨給予以及和裂褶菌多糖或化學修飾裂褶菌多糖的複合體給予中，培養液上清中的小鼠IL-12總量並不增加，與僅加入培養基比較，IL-12產生量基本是相同程度。該結果顯示，和沒有免疫刺激效果的寡核苷酸(該例中是non-CpG DNA)的複合體形成物沒有免疫刺激效果(不產生細胞因子IL-12)。
實施例11由和裂褶菌多糖及化學修飾裂褶菌多糖形成複合體後的CpG DNA的刺激所致的來自小鼠來源巨噬細胞樣細胞J774.A1的細胞因子IL-12產生量的增強結果替代實施例10中使用的小鼠來源腹腔巨噬細胞，使用已報導在免疫刺激物質作用下IL-12產生增強的小鼠來源巨噬細胞樣細胞J774.A1(從ATCC得到)，以和實施例10同樣的方法評價來自小鼠來源腹腔巨噬細胞的細胞因子IL-12產生量。將其結果示於圖7(E.R.Kandimalla，et al.，Bioconjugate Chem.，13(5)，966-974(2002))。
如圖7所例示的那樣，關於培養液上清中所含的IL-12總量，作為CpGDNA和裂褶菌多糖、化學修飾裂褶菌多糖的複合體的本發明的免疫刺激劑，比CpG DNA單獨給予時，IL-12總量要高。該結果確認了，和實施例10例示的小鼠來源腹腔巨噬細胞一樣，通過給予本發明免疫刺激劑，來自小鼠來源巨噬細胞樣細胞J774.A1的細胞因子IL-12產生量增加。
實施例12由和裂褶菌多糖及化學修飾裂褶菌多糖形成複合體後的CpG DNA的刺激所致的來自小鼠脾細胞的細胞因子IL-6及IL-12產生量的增強效果替代實施例10中使用的小鼠來源腹腔巨噬細胞，使用已報導在免疫刺激物質作用下IL-6及IL-12產生增強的小鼠來源脾細胞(脾臟淋巴球)，評價來自小鼠來源脾細胞的細胞因子IL-6及IL-12的產生量。依據文獻記載的規定方法，分離小鼠來源脾細胞。即，將8周齡的雌性Balb/c小鼠用頸椎脫臼法殺死，70％乙醇消毒後，在腹部外皮劃出切口，扯開外皮露出腹膜。打開腹膜，取出脾臟。將脾臟於PBS中以篩網(200目)和小鑷子揉碎後，用篩網過濾細胞團塊。將細胞懸浮液用聚丙烯制離心管於4℃、1000rpm離心10分鐘。去除上清，懸浮於包含10％胎牛血清的RPMI 1640培養基(日本生化學會編，新生化學實驗講座12分子免疫學I免疫細胞·サイトカイン，東京化學同人(1989))。
在96孔板中接種懸浮於包含10％胎牛血清的RPMI 1640培養基100μl的小鼠來源脾細胞2.5×105個，在其中添加濃度經過重新調整的複合體液，於37℃、5％CO2中培養24小時後回收培養液上清，其中上述複合體液是由下述方法製得的將CpG DNA以及實施例1和8中製備的CpG DNA同裂褶菌多糖和化學修飾裂褶菌多糖的複合體以超濾膜(排除界限3000)過濾除去DMSO後，重新調整濃度而成。
培養液上清中所含的小鼠IL-6和IL-12總量的測定，是利用MouseInterleukin-6 ELISA和Mouse Inerleukin-12 Total ELISA(ENDOGEN公司生產)，依據其所附的操作說明進行。將其測定結果示於圖8和圖9。如圖8和圖9所示，關於培養液上清中所含的IL-6和IL-12總量，作為CpG DNA和裂褶菌多糖、化學修飾裂褶菌多糖的複合體的本發明的免疫刺激劑，比CpGDNA單獨給予時，IL-6和IL-12總量要高。該結果確認，通過給予本發明的免疫刺激劑，脾細胞(淋巴球)產生的細胞因子(IL-6和IL-12)的量增加(E.R.Kandimalla，et al.，Bioconjugate Chem.，13(5)，966-974(2002))。
比較例2由和裂褶菌多糖及化學修飾裂褶菌多糖形成複合體後的non-CpG DNA所致的來自小鼠來源脾細胞的細胞因子IL-6和IL-12的產生效果替代實施例12中使用的CpG DNA，使用non-CpG DNA，採用和實施例12同樣的方法，評價來自小鼠來源脾細胞的細胞因子IL-6和IL-12的產生量。將其結果例示於圖10和圖11。
如圖10和圖11所示，在non-CpG DNA單獨給予以及和裂褶菌多糖或化學修飾裂褶菌多糖的複合體給予中，培養液上清中的小鼠IL-6和IL-12總量並不增加，與僅加入培養基比較，IL-6和IL-12產生量基本是相同程度。該結果顯示，和沒有免疫刺激效果的寡核苷酸(該例中是non-CpG DNA)的複合體形成物沒有免疫刺激效果。
實施例13β-1，3-葡聚糖(裂褶菌多糖)以及化學修飾裂褶菌多糖和磷酸二酯型CpGDNA(CpG DNA(PO))的複合體化免疫刺激劑的製備分別將裂褶菌多糖和化學修飾裂褶菌多糖溶解於DMSO成為單鏈，調整濃度為30mg/ml後，在該溶液1μl中混合純水3μl、10mM tris緩衝液(pH 7.8)1μl，和替代實施例1中記載的CpG DNA溶液的CpG DNA(PO)溶液(3mg/ml)5μl。均得到透明均一的溶液。
使用的包含CpG模體的寡核苷酸(固相合成物)，是以在TCC ATG ACGTTC CTGATG CT的3』末端帶有40個dA的序列(序列5)作為CpG DNA(PO)，所述TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT是在鹼基序列內含有一個胞嘧啶·鳥嘌呤二核苷酸(CpG)序列、並帶有磷酸二酯鍵的序列。
實施例14由和裂褶菌多糖及化學修飾裂褶菌多糖形成複合體後的CpG DNA(PO)的刺激所致的來自小鼠脾細胞的細胞因子IL-6和IL-12產生量的增強效果對於實施例12中使用的CpG DNA，使用實施例13中記載的CpGDNA(PO)，採用和實施例12同樣的方法，評價來自小鼠來源脾細胞的細胞因子IL-6和IL-12的產生量。將其結果例示於圖12和圖13。
如圖12和圖13所例示的那樣，關於培養液上清中所含的IL-6和IL-12總量，作為CpG DNA(PO)和裂褶菌多糖、化學修飾裂褶菌多糖的複合體的本發明的免疫刺激劑，比CpG DNA(PO)單獨給予時，IL-6和IL-12總量要高。該結果確認，通過給予本發明的免疫刺激劑CpG DNA(PO)/裂褶菌多糖及CpG DNA(PO)/化學修飾裂褶菌多糖，來自小鼠來源脾細胞的細胞因子(IL-6和IL-12)產生量增加。
比較例3由和裂褶菌多糖及化學修飾裂褶菌多糖形成複合體後的non-CpGDNA(PO)所致的來自小鼠來源脾細胞的細胞因子IL-6和IL-12產生效果替代實施例14中使用的CpG DNA(PO)，使用在鹼基序列內不含胞嘧啶·鳥嘌呤二核苷酸(CpG)序列(不顯示免疫刺激效果)的具有磷酸二酯鍵的TCC ATG AGC TTC CTG ATG CT的3』末端帶有40個dA的序列的寡核苷酸(以下記作non-CpG DNA(PO)序列6)，採用和實施例14同樣的方法，評價來自小鼠來源脾細胞的細胞因子IL-6和IL-12產生量。將其結果例示於圖14和圖15。
如圖14和圖15所示，在non-CpG DNA(PO)單獨給予以及和裂褶菌多糖及化學修飾裂褶菌多糖的複合體給予中，培養液上清中的小鼠IL-6和IL-12總量並不增加，與僅加入培養基比較，產生量基本是相同程度。該結果顯示，和沒有免疫刺激效果的寡核苷酸non-CpG DNA(PO)的複合體形成物沒有免疫刺激效果(不產生細胞因子IL-6和IL-12)。
比較例4由和裂褶菌多糖及化學修飾裂褶菌多糖形成複合體後的CpG DNA或CpG DNA(PO)、non-CpG DNA、non-CpG DNA(PO)的刺激所致的來自小鼠脾細胞的細胞因子IL-4產生效果採用和實施例12和實施例14同樣的方法，評價來自小鼠來源脾細胞的細胞因子IL-4產生量。將其結果例示於圖16～圖19。
如圖16～圖19所例示的那樣，在CpG DNA或CpG DNA(PO)、non-CpGDNA、non-CpG DNA(PO)單獨給予以及和裂褶菌多糖及化學修飾裂褶菌多糖的複合體給予中，培養液上清中的小鼠IL-4量並不增加，與僅加入培養基比較，產生量基本是相同程度。據報導，具有免疫刺激效果的CpG模體僅誘導產生IL-2、IL-12、TNF-α、TNF-γ等細胞性免疫(I型免疫)類細胞因子，而抑制IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等體液性免疫(II型免疫)類細胞因子。由該結果表明，通過給予本發明的免疫刺激劑，根據CpG模體的免疫刺激效果，免疫得到增強(Dennis M.Klinman，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93，2879-2883(1996))。
產業上的利用可能性本發明將安全性已被確認的β-1，3-葡聚糖等多糖作為載體(轉染試劑)使用，具有安全且優異的免疫增強作用，是可用在免疫治療和基因治療等領域的新型免疫刺激劑。
序列表110獨立行政法人科學技術振興機構110水雅美120免疫刺激劑1606210121160212DNA213人工S-寡核苷酸220
223固相合成核苷酸4001tccatgacgt tcctgatgct aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa21022113212PRT213人工序列220
223固相合成肽4002Arg Gly Asp121032118212PRT213人工序列220
223固相合成肽4003Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg15210421160212DNA213人工S-寡核苷酸
220
223固相合成核苷酸4004tccatgagct tcctgatgct aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa210521160212DNA213人工核苷酸220
223固相合成核苷酸4005tccatgacgt tcctgatgct aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa210621160212DNA213人工核苷酸220
223固相合成核苷酸4006tccatgagct tcctgatgct aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa
權利要求
1.免疫刺激劑，其包括免疫刺激性寡核苷酸和具有β-1，3-糖苷鍵的多糖類物質所形成的複合體。
2.根據權利要求1所述的免疫刺激劑，其中，免疫刺激性寡核苷酸包含非甲基化CpG模體。
3.根據權利要求1所述的免疫刺激劑，其中，寡核苷酸的磷酸骨架經硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯所修飾。
4.根據權利要求1所述的免疫刺激劑，其中，具有β-1，3-糖苷鍵的多糖類物質是β-1，3-葡聚糖或β-1，3-木聚糖。
5.根據權利要求4所述的免疫刺激劑，其中，β-1，3-葡聚糖選自裂褶菌多糖、熱凝多糖、香菇多糖、茯苓多糖、灰樹花多糖、海帶多糖和小核菌葡聚糖。
6.根據權利要求1所述的免疫刺激劑，其中，多糖類物質經核酸結合性和/或細胞膜親和性官能團所修飾。
7.根據權利要求1所述的免疫刺激劑，其中，寡核苷酸和多糖類物質所形成的複合體是經由氫鍵和疏水性相互作用而形成的三重螺旋結構狀物質。
全文摘要
公開了一種由免疫刺激性寡核苷酸和安全且轉染效果好的載體複合體化形成的新型免疫刺激劑。將免疫刺激性寡核苷酸和帶有β－1，3－糖苷鍵的多糖類物質(優選如裂褶菌多糖的β－1，3－葡聚糖)複合體化，作為免疫刺激劑給予。免疫刺激性寡核苷酸的優選例是包含非甲基化CpG模體的寡核苷酸。多糖類物質優選使用經核酸結合性和/或細胞親和性官能團修飾的多糖類物質。
文檔編號A61K47/48GK1798563SQ20048001329
公開日2006年7月5日 申請日期2004年5月13日 優先權日2003年5月15日
發明者新海徵治, 水雅美, 櫻井和朗, 甲元一也, 沼田宗典, 松本貴博 申請人:獨立行政法人科學技術振興機構, 三井製糖株式會社