一種純化多酚類化合物的方法
2023-12-05 16:34:16 1
專利名稱：一種純化多酚類化合物的方法
技術領域：
本發明涉及一種純化多酚類化合物的方法，屬於天然產物活性成分分離提純技術領域。
背景技術：
多酚是指分子結構中含有多羥基的一類生物活性小分子化合物的總稱，其相對分子質量在500-3000範圍內，是植物的次生代謝產物之一，廣泛存在於水果、蔬菜、茶葉及中草藥中。多酚和生物大分子如蛋白質、多糖的結合以及與金屬離子的絡合等化學性質使其具有多種生物活性，如抗氧化、抗病毒、抗癌及抑菌等。現代醫學研究表明，困擾人類的多種疾病如組織器官的老化，冠心病、動脈粥樣硬化及中風等心腦血管疾病均與人體內活性氧自由基的過剩(失衡)密切相關，研究發現植物源的多酚物質具有很強的氧自由基清除能力及抑制脂質體過氧化作用等，因而從植物中分離高效抗氧化多酚化合物成為當前抗氧化領域的研究熱點。目前，多酚化合物的分離純化方法主要有大孔樹脂吸附、矽膠柱層析和逆流色譜分離等。大孔吸附樹脂吸附容量大、易於再生，但有機試劑用量大且目標物純度不高；矽膠柱層析價格便宜，但操作繁瑣、得率較低；逆流色譜分離效果好、產品純度高，但其成本相對較高，且製備量小，不易實現規模化生產。所以，開發低生產成本、高純度的多酚類化合物分離純化方法，具有重要的經濟和社會意義。瓊脂糖具有良好的親水性、大孔性、非特異性和生物學相容性，表面帶有大量的羥基，是應用最廣的一種多糖類色譜分離介質。目前已開發出多種商品化低糖濃度(瓊脂糖基質濃度為2%_6%)分離介質,如Sepharose 4FF、Sepharose 6FF以及以此為基質偶聯不同配基所製備的一系列疏水、親和、離子交換等分離介質，主要用於蛋白質、核酸等大分子的分離，在生物製藥、食品工業及化工等領域具有廣泛應用。
發明內容
本發明目的在於提供一種純化多酚類化合物的方法，本發明使用高濃度的瓊脂糖凝膠微球作為分離介質用於天然多酚類化合物分離純化。本發明實現過程如下:
一種純化多酚類化合物的方法，包括如下步驟:
(1)將含有多酚類化合物的樣品溶解於體積百分含量為10.0-50.0%的乙醇水溶液中，所述的多酚類化合物為白藜蘆醇、虎杖苷、丹參素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯；
(2)上樣純化，等度模式洗脫，採用裝填有瓊脂糖凝膠微球的層析柱，洗脫液為乙醇、乙酸體積比為1:1的水溶液，其中乙醇和乙酸的體積百分含量分別為10.0-30.0%。上述方法多酚類化合物的質量回收率大於95%，純度大於98%。所述的瓊脂糖凝膠微球中瓊脂糖的質量百分含量為16 24%，微球的粒徑範圍為20-60 μ m，最大耐壓大於0.4MPa，其製備方法包括如下步驟: (1)將乳化劑與油相溶劑混勻，乳化劑質量百分含量為0.05-1.0%，然後將質量百分含量為16 24%的瓊脂糖水溶液加入到乳化劑與油相溶劑混合液中進行懸浮乳化制球，混合液與瓊脂糖水溶液的體積比為3:1 6:1 ;
所述的乳化劑選自Tween 60>Span 80、NP-4、0P_500,油相溶劑選自石油醚、四氯化碳、液體石蠟、大豆油、菜籽油；
(2)將製得的微球在含有1-5%的KBH4的30-45%的NaOH溶液中活化；
(3)加入交聯劑進行交聯，清洗篩分即可得到瓊脂糖凝膠微球，所述的交聯劑選自2，3- 二溴丙醇、二乙烯基苯、環氧氯丙烷、1，4- 丁二醇縮水甘油醚。本發明的優點與積極效果:
(I)增大瓊脂糖基質濃度可以提高製備的分離介質羥基數目，從而對多酚類化合物具有很好的選擇性吸附作用，最優條件下目標物的質量回收率和純度均高於95.0%和98.0%。高濃度瓊脂糖凝膠分離介質(瓊脂糖基質濃度為16%-24%，為常規瓊脂糖凝膠分離介質的4-8倍)在天然產物活性物質分離中的應用潛力巨大。(2)採用乙醇-乙酸二元混合液為洗脫液，在等度模式下常壓分離，解析度高、負載量大、操作簡單且溶劑條件無毒無害。
圖1為製備的高濃度瓊脂糖凝膠分離介質的掃描電鏡圖(1000X )；
圖2為高濃度瓊脂糖凝膠分離介質純化虎杖中白藜蘆醇和虎杖苷的色譜 圖3為白藜蘆醇和虎杖苷收樣組分的高分辨質譜 圖4為白藜蘆醇和虎杖苷收樣組分的高效液相色譜圖。
具體實施例方式實施例1高濃度瓊脂糖凝膠分離介質的製備
(1)將160.0-240.0g瓊脂糖加入到1.0L超純水中，在壓力0.12- 0.18Mpa、溫度110-125°C的高壓反應釜中保溫0.5-1.5h，完全溶解為水溶液；
(2)將乳化劑與油相溶劑混合均勻，乳化劑質量百分含量為0.05-1.0%，然後將瓊脂糖水溶液加入到油相溶劑懸浮乳化制球，油水相比例為3:1- 6:1，體系溫度為60-80°C，轉速為600-1000rpm;其中油相溶劑選自石油醚、四氯化碳、液體石蠟、大豆油、菜籽油、二甲苯、二氯苯，乳化劑選自 Tween 60、Tween 20、Span 80、Span 40、Arlacel C、NP-4、0P-500 ;
(3)攪拌5-30min後將反應體系置換為冰浴，待體系溫度降到20_40°C後，除去乳化劑清洗後將微球在含有1-5%的KBH4的30-45%的NaOH溶液中活化，溫度為20_30°C，活化
0.5-1.0h ；
(4)加入交聯劑升溫到45-65°C進行交聯，交聯6.0-12.0h後，清洗篩分即可得到用於液相色譜的高濃度瓊脂糖凝膠微球，交聯劑選自2，3-二溴丙醇、二乙烯基苯、環氧氯丙烷、1，4- 丁二醇縮水甘油醚、三甲基丙烯酸甘油酯；
(5)製備的高濃度瓊脂糖凝膠微球粒徑範圍在20-60μ m之間(圖1)，尺寸分布均勻；最大耐壓大於0.4MPa，機械性能良好，易於清洗和重複使用。實施例2天然多酚活性物質一白藜蘆醇和虎杖苷的分離純化
使用實施例1方法製備得到16%瓊脂糖凝膠分離介質，其中，油相溶劑為石油醚，乳化劑為Tween 60,交聯劑為2，3- 二溴丙醇。(I)稱取0.40g虎杖粗提物超聲溶解於20.0%的乙醇水溶液中，超聲助溶5min，
0.45 μ m濾膜過濾；
(2)流動相為乙醇、乙酸體積比為1:1的水溶液，其中乙醇和乙酸的體積百分含量分別為20.0%，0.45 μ m濾膜過濾後超聲脫氣15min，室溫靜置0.5h備用；
(3)將製備的高濃度瓊脂糖凝膠微球抽濾清洗，加入適量超純水後超聲分散15min，然後將分散均勻的微球裝入層析柱管(600mmX 16 mm id.),流動相平衡2個柱體積後進樣；
(4)流速為3.0mL/min，檢測波長UV280nm，等度模式下進行洗脫，根據分離圖譜收集各組分(圖2)；
(5)將白藜蘆醇、虎杖苷收樣組分和標準對照品進行高分辨質譜對比鑑定，採用配置UltiMate3000 HPLC (Dionex, US)的 MicrOTOF-MS Q II (Bruker, Germany)進行分析，質譜條件:負離子模式，噴霧電壓為5kV，保護氣為高純氦氣，毛細管溫度為275°C，分子量範圍為50-3000 amu，檢測信號採用Xcalibur軟體進行記錄分析(圖3)；
(6)同時將虎杖粗提物、白藜蘆醇和虎杖苷標準對照品及高濃度瓊脂糖凝膠分離介質純化後的收樣組分進行HPLC定性定量分析，色譜條件:流動相為甲醇-水溶液(65:35，v/v, 0.5% HAc)，進樣量 20 μ L，流速 lmL/min，檢測波長為 UV 280nm (圖 4)。(7)最優條件下可得純度為99.1%的白藜蘆醇39.8mg，質量回收率為98.5% ;純度為98.7%的虎杖苷20.6mg，質量回收率為98.1%。實施例3天然多酚活性物質——丹參素的分離純化
使用實施例1方法製備得到20%瓊脂糖凝膠分離介質，其中，油相溶劑為液體石蠟，乳化劑為Span 80，交聯劑為環氧氯丙烷。(I)稱取0.50g丹參粗提物超聲溶解於10.0%的乙醇水溶液中，超聲助溶5min，
0.45 μ m濾膜過濾；
(2)流動相為乙醇、乙酸體積比為1:1的水溶液，其中乙醇和乙酸的體積百分含量分別為10.0%，0.45 μ m濾膜過濾後超聲脫氣15min,室溫靜置0.5h備用；
(3)將製備的高濃度瓊脂糖凝膠微球抽濾清洗，加入適量超純水後超聲分散15min，然後將分散均勻的微球裝入層析柱管(600mmX 16 mm id.),流動相平衡2個柱體積後進樣；
(4)流速為2.0mL/min，檢測波長UV280nm，等度模式下進行洗脫，根據分離圖譜收集各組分；
(5)將丹參素收樣組分和標準對照品進行高分辨質譜對比鑑定，並用高效液相色譜進行定性定量分析；
(6)最優條件下可得純度為98.7%的丹參素47.6mg，質量回收率為96.8%。實施例4天然多酚活性物質一表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)的分離純化 使用實施例1方法製備得到24%瓊脂糖凝膠分離介質，其中，油相溶劑為1:1的液體石
蠟與菜籽油，乳化劑為0P-500，交聯劑為1，4- 丁二醇縮水甘油醚。(I)稱取0.45g茶多酚粗提物超聲溶解於30.0%的乙醇水溶液中，超聲助溶5min，
0.45 μ m濾膜過濾；
(2)流動相為乙醇、乙酸體積比為1:1的水溶液，其中乙醇和乙酸的體積百分含量分別為25.0%，0.45 μ m濾膜過濾後超聲脫氣15min，室溫靜置0.5h備用； (3)將製備的高濃度瓊脂糖凝膠微球抽濾清洗，加入適量超純水後超聲分散15min，然後將分散均勻的微球裝入層析柱管(600mmX 16 mm id.),流動相平衡2個柱體積後進樣；
(4)流速為1.5mL/min，檢測波長UV280nm，等度模式下進行洗脫，根據分離圖譜收集各組分；
(5)將表沒食子兒茶素沒食子酸酯的收樣組分和標準對照品進行高分辨質譜對比鑑定，並用高效液相色譜進行定性定量分析；
(6)最優條件下可得純度為98.2%的表沒食子兒茶素沒食子酸酯58.2mg，質量回收率為 95.2%ο
權利要求
1.一種純化多酚類化合物的方法，其特徵在於包括如下步驟: (1)將含有多酚類化合物的樣品溶解於體積百分含量為10.0-50.0%的乙醇水溶液中； (2)上樣純化，等度模式洗脫，採用裝填有瓊脂糖凝膠微球的層析柱，流動相為乙醇、乙酸體積比為1:1的水溶液，其中乙醇和乙酸的體積百分含量分別為10.0-30.0%。
2.根據權利要求1所述純化多酚類化合物的方法，其特徵在於:所述的多酚類化合物為白藜蘆醇、虎杖苷、丹參素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、黃芩甙或燈盞乙素。
3.根據權利要求1所述純化多酚類化合物的方法，其特徵在於:所述的瓊脂糖凝膠微球中瓊脂糖的質量百分含量為16 24%,微球的粒徑範圍為20 60 μ m,最大耐壓大於0.4MPa0
4.根據權利要求1所述純化多酚類化合物的方法，其特徵在於所述的瓊脂糖凝膠微球製備方法包括如下步驟: (1)將乳化劑與油相溶劑混勻，乳化劑質量百分含量為0.05 1.0%，然後將質量百分含量為16 24%的瓊脂糖水溶液加入到乳化劑與油相溶劑混合液中進行懸浮乳化制球，混合液與瓊脂糖水溶液的體積比為3:1 6:1 ; 所述的乳化劑選自 Tween 60、Tween 20、Span 80、Span 40、Arlacel C、NP-4、0P-500,油相溶劑選自石油醚、四氯化碳、液體石蠟、大豆油、菜籽油、二甲苯、二氯苯； (2)將製得的微球在含有1-5%的KBH4的30-45%的NaOH溶液中活化； (3)加入交聯劑進行交聯，清洗篩分即可得到瓊脂糖凝膠微球，所述的交聯劑選自2，3-二溴丙醇、二乙烯基苯、環氧氯丙烷、1，4-丁二醇縮水甘油醚、三甲基丙烯酸甘油酯。
5.根據權利要求3所述純化多酚類化合物的方法，其特徵在於:多酚類化合物的質量回收率大於95%，純度大於98%。
全文摘要
本發明公開了一種純化多酚類化合物的方法，將含有多酚類化合物的樣品溶解於體積百分含量為10.0-50.0%的乙醇水溶液中，上樣純化，等度模式洗脫，採用裝填有瓊脂糖凝膠微球的層析柱，流動相為乙醇、乙酸體積比為1:1的水溶液，其中乙醇和乙酸的體積百分含量分別為10.0-30.0%。本發明通過增大瓊脂糖基質濃度可以提高製備的分離介質羥基數目，從而對多酚類化合物具有很好的選擇性吸附作用，最優條件下目標物的質量回收率和純度均高於95.0%和98.0%。
文檔編號C07C51/47GK103182199SQ20131009205
公開日2013年7月3日 申請日期2013年3月22日 優先權日2013年3月22日
發明者申燁華, 白斌, 趙彥鼎, 郭立安, 李聰 申請人:西北大學, 西安交大保賽生物技術股份有限公司