果糖基化芒果苷及其製備方法與用途的製作方法

2023-12-05 22:34:21

專利名稱：果糖基化芒果苷及其製備方法與用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種果糖基化芒果苷及其製備方法與用途，屬於生物製藥技術領域。
背景技術：
芒果苷是一種四羥基吡酮的碳酮苷，屬雙苯吡酮類黃酮類化合物，在多種植物中存在，如芒果樹、扁桃樹、東北龍膽及知母等。芒果苷分子式=C19H18O11,分子量422. 3。芒果苷具有多種生物活性和藥理作用，如抗氧化、抗腫瘤、免疫調節、抗糖尿、抗炎等(鄧家剛，蕈驪蘭.長春中醫藥大學學報，2008，24 (4) :463-464.)。芒果苷雖具有廣泛藥理活性，但其溶解度很差，嚴重限制了其製劑的開發，為方便應用，需要改善芒果苷溶解性和生物利用度。鄧家剛等(鄧家剛，袁葉.華西藥學雜誌，2008，23 (I) :17-18.)將芒果苷3-酚羥基轉化成酚鈉鹽，芒果苷單鈉鹽質量收率為92.8%。芒果苷轉化成鈉鹽後，改善了水溶性，有利於其在胃腸道的吸收，進而改善其生物利用度和 療效；實驗表明芒果苷及其鈉鹽均有止咳、化痰和抗炎作用，由於芒果苷單鈉鹽因其水溶性較好，其作用優於芒果苷，故芒果苷單鈉鹽有望開發成呼吸系統藥物。Hu等(Hu H G，WangM J, Zhao Q J.Chin Chem Lett, 2007,18 :1323-1326.)以芒果苷為原料，經烷基化得到一系列3，6，7-0-三取代芒果苷衍生物，其結構均經核磁共振氫譜確證，其中化合物2 11為新化合物；初步的體外抗糖尿病活性篩選結果表明，在相同濃度下，化合物5和11對蛋白酪氨酸磷酸酯酶(PTPlB)的抑制率比芒果苷高出I倍。對於複雜結構的天然活性成分來說，利用化學合成來進行結構修飾存在著得率低、反應專一性差、副產物多等缺點，特別是有些反應目前利用化學手段較難實現，生物轉化技術卻可彌補化學合成的不足。Cantagrel等(歐洲專利申請號FR2005000222320050304 ;公開號FR 2882762 (Al))以來源於兩株腸膜狀明串珠菌的葡萄糖基轉移酶，對芒果苷進行糖基化修飾，在芒果苷為糖基受體，蔗糖為糖基供體時，得到葡萄糖基-β - (I，6)_ 芒果苷(CASRN :908570-23-0)。當 Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1299 菌株作為生物催化劑，在O. 4g/L芒果苷，40g/L鹿糖條件下,糖基化反應收率為25%;當Leuconostocmesenteroides NRRL 521-F菌株作為生物催化劑,在O. 4g/L芒果苷,40g/L鹿糖條件下,糖基化反應收率為28%。芒果苷糖苷化後，水溶性得到顯著提高，但糖苷化修飾後分子結構的變化是否影響芒果苷的藥理活性，目前還未見相關研究報導。由於芒果苷較差的水溶性，利用生物轉化方法進行芒果苷糖基化修飾時，轉化前芒果苷濃度普遍較低(均不超過O. 5g/L)，產物摩爾轉化率也較低(均不超過30% )，這些局限性給獲得足夠產物進行腫瘤相關疾病的藥理實驗及後期的工業化生產都帶來了相當的難度。

發明內容
因此，本發明的目的針對目前芒果苷糖基化反應轉化前濃度普遍較低，產物摩爾轉化率也較低，無法獲得足夠的產物進行腫瘤相關疾病治療的不足，提供一種果糖基化芒果苷，其用於治療腫瘤疾病，能夠達到較好的治療效果。本發明的另一目的的提供上述果糖基化芒果苷的製備方法。本發明的再一目的是提供上述果糖基化芒果苷在製備用於治療腫瘤相關疾病的藥物中的應用。針對上述目的，本發明的技術方案如下一方面，本發明提供一種果糖基化芒果苷，所述果糖基化芒果苷具有下述式(I)所示的結構
權利要求
1.一種果糖基化芒果苷，所述果糖基化芒果苷具有下述式(I)所示的結構
2.根據權利要求I所述的果糖基化芒果苷的製備方法，其特徵在於，該方法包括將具有果糖基化酶活力的物質加入含有芒果苷的轉化液中，進行生物轉化反應，使芒果苷轉化為果糖基化芒果苷，所述轉化液中含有芒果苷和糖基供體，優選地，所述糖基供體為果糖或蔗糖；轉化反應結束後，去除轉化液中的菌體細胞或菌體蛋白，再將其用樹脂純化，然後將經樹脂純化得到的果糖基化芒果苷餾分旋轉蒸發或冷凍乾燥後得到果糖基化芒果苷粉末或晶體。
3.根據權利要求2所述的果糖基化芒果苷的製備方法，其特徵在於，所述具有果糖基化酶活力的物質包括具有果糖基化酶活力的發酵液、發酵液上清、純化的果糖基化酶和果糖基化酶重組表達蛋白，優選地，果糖基化酶為β -D-呋喃果糖苷酶，更為優選地，所述β -D-呋喃果糖苷酶來源於節桿菌屬細菌，其分子量約60kDa，N端前5個胺基酸序列分別為 ATEPV0
4.根據權利要求2至3任一項所述的果糖基化芒果苷的製備方法，其特徵在於，所述發酵液或發酵液上清由具有果糖基化芒果苷活力的微生物發酵獲得，優選地，所述微生物為菸草節桿菌，其保藏號為CCTCCM2010164，優選地，所述微生物發酵用包含蔗糖5 80g/L，蛋白腖 5 50g/L, KH2PO4 O. 4 4g/L, CaCl2 O. 5 5g/L, MnSO4 O. I 2g/L, pH 6 8的發酵培養基，於25 40°C，10 400rpm搖瓶振蕩或發酵罐攪拌通氣，轉速通氣量為I 6vvm, 10 400rpm,發酵6 48小時,優選地,所述微生物發酵用包含鹿糖15g/L,蛋白腖25g/L，KH2PO4 2g/L，CaCl2 2g/L，MnSO4O. 2g/L，pH 7. 5 的發酵培養基，於 30°C，240rpm 搖瓶振蕩16小時或發酵罐攪拌通氣,轉速通氣量為4vvm, 300rpm,發酵6小時。
5.根據權利要求2至4任一項所述的果糖基化芒果苷的製備方法，其特徵在於，所述生物轉化反應在非水相反應條件中進行；所述非水相反應條件為採用10 400rpm搖瓶振蕩或發酵罐攪拌，5 50%的親水性有機溶劑，芒果苷濃度為O. I 70g/L，芒果苷和糖基供體的配比為摩爾比I : I I : 200，加入10% 50%的發酵液或發酵液上清，所述發酵液或發酵液上清含果糖基化酶10 100U/mL，在pH4 8的緩衝溶液中，於25 40°C，反應6 400小時。
6.根據權利要求5所述的果糖基化芒果苷的製備方法，其特徵在於，所述親水性有機溶劑選自二甲基亞碸、二甲基甲醯胺、乙腈、甲醇、丙酮或乙醇的一種或幾種；優選地，所述非水相反應條件為採用20%的二甲基亞碸，62. 7g/L芒果苷，200g/L蔗糖為糖基供體，力口入20%的發酵液上清，所述發酵液上清含果糖基化酶30U/mL，於l/15mol/L pH6. 86的磷酸鹽緩衝液的發酵罐中，於30°C，300rpm攪拌轉化360小時。
7.根據權利要求2至6任一項所述的果糖基化芒果苷的製備方法，其特徵在於，所述樹脂純化為將含有果糖基化芒果苷的轉化液通過AB-8大孔樹脂吸附；吸附後先採用洗脫液洗去殘餘的糖基供體，然後採用洗脫液梯度洗脫或階段洗脫分別得到果糖基化芒果苷； 優選地，先用10倍柱床體積pH 4 4. 5的蒸懼水洗去殘餘的糖基供體,然後採用5 30 %的甲醇或乙醇溶液梯度洗脫或階段洗脫分別得到果糖基化芒果苷。
8.根據權利要求2至7任一項所述的果糖基化芒果苷的製備方法，其特徵在於，當在非水相反應條件中轉化反應時，該吸附在將轉化液中的有機溶劑低溫蒸發去除或將有機溶劑稀釋至低於2%體積比的條件下進行。
9.根據權利要求I所述的果糖基化芒果苷的用途，所述果糖基化芒果苷在製備用於治療腫瘤相關疾病的藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供一種果糖基化芒果苷及其製備方法與用途，所述果糖基化芒果苷的結構式如下式(I)所示；所述果糖基化芒果苷的製備方法包括將具有果糖基化酶活力的物質加入含有芒果苷的轉化液中，進行生物轉化反應，使芒果苷轉化為果糖基化芒果苷，所述轉化液中含有芒果苷和糖基供體；及所述果糖基化芒果苷用途為其在製備用於治療腫瘤相關疾病的藥物中的應用。
文檔編號C07H15/26GK102863484SQ20111018822
公開日2013年1月9日 申請日期2011年7月6日 優先權日2011年7月6日
發明者何冰芳, 吳薛明, 儲建林, 吳斌, 張森, 歐陽平凱 申請人:南京工業大學