雜交蘭與西藏虎頭蘭雜交種子無菌播種育苗的方法

2023-12-05 04:17:06

雜交蘭與西藏虎頭蘭雜交種子無菌播種育苗的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種遠緣雜交育種和雜交種子無菌播種繁殖的方法，特別指一種雜交蘭與西藏虎頭蘭雜交種子無菌播種育苗的方法。
【背景技術】
[0002]雜交蘭(Hybrid Cymbidium)是國蘭與大花蕙蘭種間雜交培育而成的蘭花新種類，集國蘭的植株小巧、幽香、典雅和大花蕙蘭的花大、色純靚麗等特性，花期長，有花觀花、無花觀葉，具有較高的觀賞和經濟價值，成為了近幾年來年宵及日常消費市場的新寵，消費份額逐年增長，市場潛力巨大。
[0003]西藏虎頭蘭(Cymbidium tracyanum L.)是蘭科蘭屬附生類多年生草本植物。原產我國貴州西南部、四川、雲南西南部至東南部和西藏東南部，緬甸、泰國也有分布，現廣泛栽培。葉長碧綠，花姿粗曠，色彩鮮豔，花型整齊且質地堅挺，經久不凋，具香味，抗逆性強，是世界著名的蘭花新星。
[0004]蘭屬(Cymbidium)的種間遠緣雜交存在親和障礙，種間雜種胚通常發育不良、無胚乳，雜交種子在自然條件下萌發困難，不易成苗，通過無菌播種人工培養，能夠在短期內獲得大量幼小植株。然而不同雜種胚的萌發差異較大，直接影響了蘭屬種間遠緣雜交育種效率。近年來，國內已有部分蘭屬種間雜交研究的報導，但建立的技術重複性差。因此，深入研究不同類型蘭屬植物種間雜交種子的萌發與發育特性，將為進一步開展蘭屬新品種培育奠定基礎。
[0005]鑑於消費者對「新、奇、特、香」蘭花新優品種的追求，培育更多具有自主智慧財產權的蘭花新品種是植物育種界研究的一個熱門課題。

【發明內容】

[0006]本發明要解決的技術問題，在於提供一種雜交蘭與西藏虎頭蘭雜交種子無菌播種育苗的方法。
[0007]本發明是這樣實現的:一種雜交蘭與西藏虎頭蘭雜交種子無菌播種育苗的方法，包括以下步驟:
[0008](I)人工授粉:以雜交蘭『臺北小姐』為母本，西藏虎頭蘭為父本進行雜交，取母本開花後2?4d的花朵，用消毒過的鑷子去除唇瓣及柱頭上的花粉塊，取父本完全張開的花朵的花粉塊置放於母本柱頭蕊腔內；剪取授粉205d後未開裂的成熟蒴果進行無菌播種；
[0009](2)果莢預處理與種子播種:
[0010]將成熟蒴果進行預處理，然後將成熟蒴果的種子播種於萌發培養基中；所述萌發培養基為 1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖20g/L+活性炭1.0g/L+瓊脂5.8g/L；
[0011](3)種子萌發:將種子接種於所述萌發培養基中培養，培養溫度為25±2°C，光照強度 1200Lux 土 100，光照時間 12h/d ；
[0012](4)根狀莖的增殖與分化培養:選擇生長狀態相近的種子萌發形成的根狀莖，在無菌條件下分切成長0.6?0.8cm的切段，接種於1/2MS+6-BA2.0mg/L+NAA 1.0mg/L+香蕉泥80g/L+蔗糖20g/L+活性炭1.5g/L+瓊脂5.8g/L的增殖與分化培養基中培養，培養溫度25 ± 2°C，光照強度1500Lux ± 100，光照時間12h/d ；
[0013](5)壯苗生根培養:將根狀莖分化形成的2.5?3.5cm的幼苗小心切下，分選後剪除老根，僅留I?2條短嫩新根，接種於MS+6-BA 1.0mg/L+NAA2.0mg/L+鹿糖25g/L+香蕉泥100g/L+活性炭2.5g/L+瓊脂5.8g/L的生根壯苗培養基中培養，培養溫度25 ± 2°C，光照強度1500Lux 土 100，光照時間 12h/d ；
[0014](6)煉苗移栽:待生根苗長至6.0?7.0cm、葉片3?4片、根3?4條時，將瓶苗從培養室移至溫室大棚，進行煉苗，繼續生長30d，溫室大棚遮光率60%，溫度保持25 ±2°C，空氣溼度保持60%?70%;
[0015]出瓶種植前3?5d，打開瓶蓋適應外界環境，然後取出小苗，洗淨根部培養基，用50 %多菌靈可溼性粉劑1000倍稀釋溶液浸泡3min，陰涼處自然晾乾後種植於發酵過的基質中，用惡黴靈溶液噴灌植株及植料；2d後澆透水，以後按預定周期進行葉面噴水和噴灑
0.1 %多囷靈殺囷劑ο
[0016]進一步地，所述步驟(2)中，將成熟蒴果進行預處理的具體方法如下:
[0017]將成熟蒴果置於流水下衝洗3min，用牙刷沾洗潔精仔細刷洗表皮，用手術刀剔除柱頭、殘留的枯瓣及表皮病蟲斑，再用75 %酒精擦拭;放入I %NaC10溶液浸泡15min，再用超聲波清洗器震蕩5?lOmin，移到超靜工作檯上，用消毒過的鑷子取出蒴果，用無菌水清洗2次;夾取蒴果沾上75%酒精後在酒精燈上點燃消毒10s。
[0018]進一步地，所述步驟(2)中，將成熟蒴果的種子播種於萌發培養基中的具體操作方法如下:
[0019]用手指捏住成熟蒴果的果柄，使蒴果朝風口而手在後，另一手持消毒過的手術刀將果莢平切打開果皮，露出種子，用鑷子直接夾取種子均勻撒播於萌發培養基表面;或將消毒過的種子移入有無菌水的培養瓶中搖勻，然後用無菌吸管吸取Iml搖勻懸浮液均勻滴到萌發培養基面上。
[0020]進一步地，所述基質包括質量比為2:1的樹皮和碎石子。
[0021 ]本發明的優點在於:種子萌發快，萌發率高，根狀莖分化成苗時間短，能快速地獲得大量試管苗;種苗質量高，成苗移栽成活率達97.8%,為雜交蘭種苗的規模化生產提供了一條有效的新途徑。
【具體實施方式】
[0022]本發明採用雜交蘭『臺北小姐』為母本，野生馴化的西藏虎頭蘭為父本，進行種間雜交種子無菌播種和種苗繁殖，具體步驟如下:
[0023](I)人工授粉:以雜交蘭『臺北小姐』為母本，西藏虎頭蘭為父本進行雜交，在12月初兩親本同時開花時，取母本開花後2?4d的花朵，用消毒過的鑷子去除唇瓣及柱頭上的花粉塊，取父本完全張開的花朵的花粉塊置放於母本柱頭蕊腔內；授粉後在母本植株掛上標籤，標籤上註明授粉日期、雜交父本和授粉花朵數；
[0024](2)果莢預處理與種子播種:剪取授粉205d後未開裂的成熟蒴果，用牙刷沾洗潔精仔細刷洗表皮，用手術刀剔除柱頭、殘留的枯瓣及表皮病蟲斑，再用75%酒精擦拭;放入1%NaClO溶液浸泡15min，再用超聲波清洗器震蕩5?lOmin，移到超靜工作檯上，用消毒過的鑷子取出蒴果，用無菌水清洗2次;夾取蒴果沾上75%酒精後在酒精燈上點燃消毒10s，用手指捏住果柄，使蒴果朝風口而手在後，另一手持消毒過的手術刀將果莢平切打開果皮，露出種子，用鑷子直接夾取種子均勻撒播於萌發培養基表面;或將消毒過的種子移入有少量無菌水的培養瓶中搖勻，然後用無菌吸管吸取Iml搖勻懸浮液滴到萌發培養基面上，並使其分布均勻;所述萌發培養基為:1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖20g/L+活性炭1.0g/L+瓊脂5.88/14!1為5.6。
[0025](3)種子萌發:將種子接種於萌發培養基中培養，培養溫度25±2°C，光照強度1200Lux ±100,光照時間12h/d ；培養35d後開始膨脹，約60d膨大形成白色球形胚，繼續培養形成白色原球莖，光下可轉成綠色原球莖，培養10d後萌發的類原球莖逐漸形成白色-淡綠色的根狀莖；
[0026](4)根狀莖的增殖與分化:選擇生長狀態相近的種子萌發形成的根狀莖，在無菌條件下分切成長0.6?0.8cm的切段，接種於I/2MS+6-BA2.0mg/L+NAA 1.0mg/L+香蕉泥80g/L+蔗糖20g/L+活性炭1.5g/L+瓊脂5.8g/L的增殖與分化培養基上培養，培養溫度25±2°C，光照強度1500Lux± 100，光照時間12h/d;培養70d根狀莖的增殖係數達5.16，培養125d即可獲得帶根的健壯小苗，成苗率達90.8%。
[0027](5)壯苗生根:將根狀莖分化形成的2.5?3.5cm基部飽滿，葉尖開口露出心葉的幼苗小心切下，分選後剪除老根，僅留I?2條短嫩新根，接種於MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 2.0mg/L+蔗糖25g/L+香蕉泥100g/L+活性炭2.5g/L+瓊脂5.8g/L的生根壯苗培養基上培養，培養溫度25 ± 2°C，光照強度1500Lux± 100，光照時間12h/d ；培養90d左右小苗生根率可達98.4%；
[0028](6)煉苗移栽:待瓶內的生根苗長至6.0?7.0cm、葉片3?4片、根3?4條時，將瓶苗從培養室移至溫室大棚，進行煉苗，繼續生長30d，煉苗溫室大棚遮光率60 %，溫度保持25?28°C，空氣溼度保持60%?70%;出瓶種植前3?5d，打開瓶蓋，讓瓶內小苗適應外界的環境;取出小苗，小心洗淨根部培養基，用50 %多菌靈可溼性粉劑1000倍液浸泡3min，在陰涼處自然晾乾後種植於發酵過的樹皮+碎石子(質量比為2: I)的基質中，定植後用惡黴靈溶液噴灌植株及植料;2d後澆透水，以後定期進行葉面噴水和噴灑0.1 %多菌靈等殺菌劑，常規栽培管理;經過一系列的精心管理，試管苗移栽60d成活率達97.8%。
[0029]本發明具有以下優點:
[0030](I)本發明利用同一配方培養基(1/2MS+6-BA 2.0mg/L+NAA I.0mg/L+香蕉泥80g/L+蔗糖20g/L+活性炭1.5g/L+瓊脂5.8g/L)，實現了根狀莖增殖、分化同步進行，減少增殖到分化的轉瓶環節，不僅提高了成苗率、降低了汙染率，大大減少了工作量、節省了經濟成本，還縮短了成苗時間約30d。
[0031](2)本發明在整個培養過程均添加了活性炭，其作用是吸附了培養基中的部分營養物質和代謝過程中產生的廢棄物，促進種子的形態發生和器官形成。
[0032](3)本發明在移栽之前先在溫室大棚中煉苗繼續生長30d，有利於瓶苗假鱗莖形成、葉片增厚，為提高後期的移栽成活率奠定紮實的基礎。
[0033]總之，本發明中種子萌發快，萌發率高，根狀莖分化成苗時間短，能快速的獲得大量試管苗;種苗質量高，成苗移栽成活率達97.8 %。為雜交蘭種苗的規模化生產提供了一條有效的新途徑。
[0034]本發明以雜交蘭栽培種「臺北小姐」為母本，以野生的西藏虎頭蘭為父本，開展雜交育種，解決了雜交種子無菌播種、提高種子萌發率、提高根狀莖增殖與分化率、生根壯苗培養和煉苗移栽等無菌播種育苗的關鍵技術，獲得大量雜種後代植株，不僅為選育具有新花色、花型及抗性強的優良新品種奠定物質基礎，為雜交蘭種苗的生產提供一條有效的新途徑，促進雜交蘭產業化的可持續發展，還能進一步保護野生蘭花資源，本發明具有廣闊的應用前景。
[0035]雖然以上描述了本發明的【具體實施方式】，但是熟悉本技術領域的技術人員應當理解，我們所描述的具體的實施例只是說明性的，而不是用於對本發明的範圍的限定，熟悉本領域的技術人員在依照本發明的精神所作的等效的修飾以及變化，都應當涵蓋在本發明的權利要求所保護的範圍內。
【主權項】
1.一種雜交蘭與西藏虎頭蘭雜交種子無菌播種育苗的方法，其特徵在於:包括以下步驟: (1)人工授粉:以雜交蘭『臺北小姐』為母本，西藏虎頭蘭為父本進行雜交，取母本開花後2?4d的花朵，用消毒過的鑷子去除唇瓣及柱頭上的花粉塊，取父本完全張開的花朵的花粉塊置放於母本柱頭蕊腔內；剪取授粉205d後未開裂的成熟蒴果進行無菌播種； (2)果莢預處理與種子播種: 將成熟蒴果進行預處理，然後將成熟蒴果的種子播種於萌發培養基中；所述萌發培養基為 1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖20g/L+活性炭1.0g/L+瓊脂5.8g/L； (3)種子萌發:將種子接種於所述萌發培養基中培養，培養溫度為25±2°C，光照強度1200Lux 土 100，光照時間 12h/d ； (4)根狀莖的增殖與分化培養:選擇生長狀態相近的種子萌發形成的根狀莖，在無菌條件下分切成長0.6?0.8cm的切段，接種於I/2MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 1.0mg/L+香蕉泥80g/L+蔗糖20g/L+活性炭1.5g/L+瓊脂5.8g/L的增殖與分化培養基中培養，培養溫度25 ± 2°C，光照強度1500Lux± 100，光照時間12h/d; (5)壯苗生根培養:將根狀莖分化形成的2.5?3.5cm的幼苗小心切下，分選後剪除老根，僅留I?2條短嫩新根，接種於MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 2.0mg/L+鹿糖25g/L+香蕉泥10g/L+活性炭2.5g/L+瓊脂5.8g/L的生根壯苗培養基中培養，培養溫度25 ±2 °C，光照強度1500Lux 土 100，光照時間 12h/d ； (6)煉苗移栽:待生根苗長至6.0?7.0cm、葉片3?4片、根3?4條時，將瓶苗從培養室移至溫室大棚，進行煉苗，繼續生長30d，溫室大棚遮光率60 %，溫度保持25 ± 2°C，空氣溼度保持60% ?70% ； 出瓶種植前3?5d，打開瓶蓋，然後取出小苗，洗淨根部培養基，用50%多菌靈可溼性粉劑1000倍稀釋溶液浸泡3min，陰涼處自然晾乾後種植於發酵過的基質中，用惡黴靈溶液噴灌植株及植料;2d後澆透水，以後按預定周期進行葉面噴水和噴灑0.1 %多菌靈殺菌劑。2.如權利要求1所述的雜交蘭與西藏虎頭蘭雜交種子無菌播種育苗的方法，其特徵在於:所述步驟(2)中，將成熟蒴果進行預處理的具體方法如下: 將成熟蒴果置於流水下衝洗3min，用牙刷沾洗潔精仔細刷洗表皮，用手術刀剔除柱頭、殘留的枯瓣及表皮病蟲斑，再用75%酒精擦拭;放入l%NaC10溶液浸泡15min，再用超聲波清洗器震蕩5?lOmin，移到超靜工作檯上，用消毒過的鑷子取出蒴果，用無菌水清洗2次;夾取蒴果沾上75%酒精後在酒精燈上點燃消毒10s。3.如權利要求1所述的雜交蘭與西藏虎頭蘭雜交種子無菌播種育苗的方法，其特徵在於:所述步驟(2)中，將成熟蒴果的種子播種於萌發培養基中的具體操作方法如下: 用手指捏住成熟蒴果的果柄，使蒴果朝風口而手在後，另一手持消毒過的手術刀將果莢平切打開果皮，露出種子，用鑷子直接夾取種子均勻撒播於萌發培養基表面;或將消毒過的種子移入有無菌水的培養瓶中搖勻，然後用無菌吸管吸取Iml搖勻懸浮液均勻滴到萌發培養基面上。4.如權利要求1所述的雜交蘭與西藏虎頭蘭雜交種子無菌播種育苗的方法，其特徵在於:所述基質包括質量比為2: I的樹皮和碎石子。
【專利摘要】本發明提供了一種雜交蘭與西藏虎頭蘭雜交種子無菌播種育苗的方法，以雜交蘭『臺北小姐』為母本，西藏虎頭蘭為父本，通過人工授粉獲得雜交蒴果，成熟蒴果經果莢預處理、種子播種、種子萌發、根狀莖增殖與分化同步進行、壯苗生根、煉苗移栽等繁殖步驟獲得雜種後代群體。本發明具有種子萌發率高，成苗數多，成苗時間短，種苗質量好等優點，移栽60d成活率達97.8％，獲得的大量後代植株為雜交蘭優良新品種(系)的選育奠定物質基礎，同時為雜交蘭種苗的生產提供一條有效的新途徑。
【IPC分類】A01H1/02, A01H4/00
【公開號】CN105706900
【申請號】CN201610051245
【發明人】鍾淮欽, 陳南川, 黃敏玲, 陳少雲, 葉秀仙, 林榕燕
【申請人】福建省農業科學院作物研究所