一種測定脂溶性茶多酚含量的方法
2023-12-05 20:23:51 3
專利名稱：一種測定脂溶性茶多酚含量的方法
技術領域：
本發明涉及化學定量檢測領域，特別涉及一種測定脂溶性茶多酚含量的方法。
背景技術：
茶多酚(Green Tea Polyphenols，GTP)是茶葉中30多種多羥基酚類化合物的總稱，兒茶素類化合物約佔茶多酚含量的65% 80%左右，主要包括:( + )兒茶素[(+ ) Catechin, C],(-)表兒茶素[(_) Epicatechin, EC],(-)沒食子兒茶素[(_)Gallocatechin, GC], (_)表兒茶素沒食子酸酯[(-)Epicatechin Gallate, ECG],(-)表沒食子兒茶素[(-)Epigall0catechin，EGC]，(-)表沒食子兒茶素沒食子酸酯[(-)Epigallocatechin Gallate)，EGCG]六種物質，均為黃烷_3醇衍生物。其中EGCG佔兒茶素類化合物的50% 60%，在結構、組成、生物活性等方面均為茶多酚的代表性成分。茶多酚是一種性能十分優異的純天然抗氧化劑，無毒副作用，具抑制細菌、抗氧化等性能，但茶多酚易溶於水而難溶於脂，因而直接將其用於抗油脂及高脂食品的氧化變質便受到很大限制，所以，研究者為了克服茶多酚容易被氧化且脂溶性差等缺點，通過對其化學改性，即在茶多酚上連接脂肪酸，研製出的茶多酚組成中相應結構的長鏈脂肪酸酯，該長鏈脂肪酸酯可能是其一酯化、二酯化或多酯化產物，因此脂溶性茶多酚的組成比茶多酚更加複雜。現有技術中有一種在植物油中檢測微量脂溶性茶多酚的方法，該方法首先以沒食子酸乙酯為標準品，採用酒石酸亞鐵比色法，以亞鐵離子為顯色劑，通過茶多酚類能與亞鐵離子形成紫藍色絡合物，測定脂溶性茶多酚的含量，然後用已知含量的脂溶性茶多酚作為對照品，採用福林酚試劑氧化法，測定植物油中微量脂溶性茶多酚的含量。在實現本發明的 過程中，發明人發現現有技術至少存在以下問題:相對於茶多酚的理化性質，脂溶性茶多酚在組成、結構、平均分子量、分子中鄰二酚羥基或連三酚羥基的數量和與亞鐵離子顯色的強度等均發生了較大的變化，在這種情況下，上述方法仍然採用沒食子酸乙酯與表沒食子兒茶素沒食子酸酯在相同質量下與亞鐵離子顯色物吸光度的比值1.5，而且，上述方法是通過測定酚羥基的含量間接反映脂溶性茶多酚的含量，導致其測定結果偏低，不能直接得到脂溶性茶多酚的含量，而且該方法較為繁瑣，只適用於微量脂溶性茶多酚的檢測。
發明內容
為了解決現有技術中不能準確測定脂溶性茶多酚的含量的問題，本發明實施例提供了一種測定脂溶性茶多酚含量的方法。所述技術方案如下:本發明提供了一種測定脂溶性茶多酚含量的方法，所述方法包括以下步驟:將對照品和供試品分別製備成對照品溶液和供試品溶液，所述供試品為脂溶性茶多酚或含有脂溶性茶多酚的製劑，所述供試品溶液的溶劑為有機溶劑，所述對照品為脂溶性茶多酚，所述對照品溶液的溶劑為有機溶劑；
通過分別繪製所述對照品溶液和所述供試品溶液的紫外波長掃描圖，獲得所述對照品溶液和所述供試品溶液的最大吸收波長，並根據所述最大吸收波長確定檢測波長；繪製所述對照品溶液的標準曲線並計算所述標準曲線的回歸方程；採用紫外分光光度法測定所述供試品溶液的吸光度；將所述供試品溶液的吸光度帶入所述標準曲線回歸方程計算所述供試品中脂溶性茶多酚的含量。具體地，所述脂溶性茶多酚為茶多酚與所述8碳以上的有機脂肪酸的醯滷或酸酐反應得到的產物、或者為所述茶多酚中含有的黃烷-3醇衍生物與所述8碳以上的有機脂肪酸的醯滷或酸酐反應得到的產物。具體地，通過所述供試品溶液的紫外波長掃描圖確定所述供試品溶液的最大吸收波長的方法為:所述供試品為所述脂溶性茶多酚時，將所述脂溶性茶多酚配製成每毫升含有所述脂溶性茶多酚為0.04mg的所述供試品溶液，以所述有機溶劑為參比，在200-400nm波長範圍內掃描，得到所述供試品溶液的紫外波長掃描圖，由所述紫外波長掃描圖確定所述供試品溶液的最大吸收波長為275nm。具體地，通過所述供試品溶液的紫外波長掃描圖確定所述供試品溶液的最大吸收波長的方法為:所述供試品為所述含有脂溶性茶多酚的製劑時，取所述製劑適量，精密稱定，置於容器中，加適量所述有機溶劑，充分攪拌，於離心機3600rpm離心30min,分取上清液，並重複提取3次，合併所述上清液並過濾，將濾液移入容量瓶,用所述有機溶劑定容,配製成每毫升含有所述脂溶性茶多酚為0.04mg的所述供試品溶液，以製備所述供試品溶液的方法製備等質量空白製劑提取液作為參比，在200-400nm波長範圍內掃描，得到所述供試品溶液的紫外波長掃描圖，由所述紫外波長掃描圖確定所述供試品溶液的最大吸收波長為 275nm。 具體地，通過所述對照品溶液的紫外波長掃描圖確定所述對照品溶液的最大吸收波長的方法為:取所述對照品，用所述有機溶劑溶解，配製成每毫升含有所述對照品為0.04mg的所述對照品溶液，以所述有機溶劑為參比,在200-400nm波長範圍內掃描,得到所述對照品溶液的紫外波長掃描圖，由所述紫外波長掃描圖確定所述對照品溶液的最大吸收波長為275nm。具體地，根據所述對照品溶液與所述供試品溶液的最大吸收波長均為275nm，確定所述檢測波長為275nm誤差為±2nm。具體地，繪製所述對照品溶液的標準曲線並計算所述標準曲線的回歸方程的方法為:取乾燥的所述對照品，用所述有機溶劑溶解，配製成每毫升含有所述對照品分別為0，20，40，60，80和100 μ g的所述對照品溶液，以所述有機溶劑為參比，於275nm波長處測定吸光度，並繪製所述對照品溶液的標準曲線，由所述標準曲線經計算得所述線性回歸方程。具體地，測定所述供試品溶液的吸光度的方法為:所述供試品溶液的濃度在線性回歸方程的線性範圍以內，當所述供試品為所述脂溶性茶多酚時，以所述有機溶劑為參比；當所述供試品為所述含有所述脂溶性茶多酚的製劑時，以所述空白製劑提取液為參比，於275nm波長處測定所述供試品溶液的吸光度。具體地，所述含所述茶多酚硬脂酸酯的製劑為以所述茶多酚硬脂酸酯為主藥的凝膠劑、霜劑、軟膏劑、塗劑、塗膜劑、膜劑和貼劑中的至少一種的藥物製劑。
具體地，所述有機溶劑為無水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、滷仿、正已烷、環己烷、石油醚和二甲基亞碸中的至少一種。優選地，所述有機溶劑為無水乙醇、乙酸乙酯。可選地，所述茶多酚中含有的黃烷-3醇衍生物為:兒茶素、表兒茶素、沒食子兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素或表沒食子兒茶素沒食子酸酯。可選地，所述8碳以上的有機脂肪酸為:癸酸、羊蠟酸、月桂酸、肉豆蘧酸、棕櫚酸、珠光脂酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、桐酸、油酸或亞油酸。本發明實施例提供的技術方案帶來的有益效果是:本發明通過對脂溶性茶多酚以及含有脂溶性茶多酚的製劑進行含量測定，避免通過測定酚羥基的含量間接反映脂溶性茶多酚含量，這樣就無需加入顯色劑，避免了使用昂貴的標準品和昂貴的儀器設備條件，降低了成本，而且本發明測定方法簡單可行，測定結果準確，易於推廣應用，而且，本發明的測定方法也適用於含有脂溶性茶多酚的製劑中有複雜共存成分存在時脂溶性茶多酚的含量測定，其測定結果準確。
為了更清楚地說明本發明實施例中的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。圖1是本發明實施例一提供的茶多酚硬脂酸酯在275nm波長處的標準曲線圖；圖2是本發明實施例一提供的茶多酚硬脂酸酯的紫外波長掃描圖；圖3是本發明實施·例二提供的表沒食子兒茶素沒食子酸酯硬脂酸酯的紫外波長掃描圖； 圖4是本發明實施例二提供的表沒食子兒茶素沒食子酸酯硬脂酸酯在275nm波長處的標準曲線圖；圖5是本發明實施例三提供的表沒食子兒茶素沒食子酸酯棕櫚酸酯在275nm波長處的標準曲線圖；圖6是本發明實施例三提供的含茶多酚棕櫚酸酯凝膠劑的紫外波長掃描圖；圖7是本發明實施例三提供的空白凝膠劑的紫外波長掃描圖；圖8是本發明實施例四提供的茶多酚棕櫚酸酯在274nm波長處的標準曲線圖；圖9是本發明實施例五提供的茶多酚月桂酸酯的紫外波長掃描圖；圖10是本發明實施例五提供的茶多酚月桂酸酯在275nm波長處的標準曲線；圖11是本發明實施例六提供的茶多酚肉豆蘧酸酯的紫外波長掃描圖；圖12是本發明實施例六提供的茶多酚肉豆蘧酸酯在275nm波長處的標準曲線；圖13是本發明實施例七提供的茶多酚葵酸酯的紫外波長掃描圖；圖14是本發明實施例七提供的茶多酚葵酸酯在275nm波長處的標準曲線。
具體實施例方式為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明實施方式作進一步地詳細描述。本發明所用試劑均為分析純市售試劑。本發明提供的方法包括以下步驟:將對照品和供試品分別製備成對照品溶液和供試品溶液，供試品為脂溶性茶多酚或含有脂溶性茶多酚的製劑，供試品溶液的溶劑為有機溶劑，對照品為脂溶性茶多酚，對照品溶液的溶劑為有機溶劑。通過分別繪製對照品溶液和供試品溶液的紫外波長掃描圖，獲得對照品溶液和供試品溶液的最大吸收波長，用於確定檢測波長。繪製對照品溶液的標準曲線並計算該標準曲線的回歸方程。採用紫外分光光度法測定供試品溶液的吸光度。將供試品溶液的吸光度帶入上述標準曲線回歸方程計算供試品中脂溶性茶多酚的含量。具體地，有機溶劑為無水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、正已烷、環己烷、石油醚和二甲基亞碸中的至少一種。具體如下:
本發明提供的供試品為茶多酚硬脂酸酯時，將脂溶性茶多酚配製成每毫升含有脂溶性茶多酚為0.04mg的供試品溶液，具體地，取脂溶性茶多酚4mg，用無水乙醇溶解並定容至IOOmL,以有機溶劑無水乙醇為參比，在200-400nm波長範圍內掃描，得到供試品溶液的紫外波長掃描圖，由該紫外波長掃描圖確定供試品溶液在275nm或274nm波長處有最大吸收峰。本發明提供的供試品為含有脂溶性茶多酚的製劑時，取該製劑適量，精密稱定，置於容器中，加適量有機溶劑無水乙醇，充分攪拌，於離心機3600rpm離心30min，分取上清液，並重複提取3次，合併上清液並過濾，將濾液移入容量瓶，用無水乙醇定容，配製成每毫升含有脂溶性茶多酚為0.04mg的供試品溶液，以製備該供試品溶液的方法製備空白製劑提取液作為參比，在200-400nm波長範圍內掃描，得到供試品溶液的紫外波長掃描圖，由該紫外波長掃描圖確定供試品溶液在波長275nm或274nm處有最大吸收峰。具體地，對照品為脂溶性茶多酚，對照品溶液的溶劑為有機溶劑。具體地，通過對照品溶液的紫外波長掃描圖確定對照品溶液的最大吸收波長的方法為:取對照品，用有機溶劑溶解，配製成每毫升含有對照品為0.04mg的對照品溶液，以有機溶劑為參比，在200-400nm波長範圍內掃描，得到對照品溶液的紫外波長掃描圖，由紫外波長掃描圖確定對照品溶液的最大吸收波長為275nm或274nm。根據對照品溶液和供試品溶液的最大吸收波長均為275nm,則確定檢測波長為275nm誤差為±2nm，即在275nm誤差為±2nm範圍內檢測有效。根據對照品溶液和供試品溶液的最大吸收波長均為274nm，則確定檢測波長為274nm誤差為±2nm，即在274nm誤差為±2nm範圍內檢測有效。具體地，含脂溶性茶多酚的製劑為以脂溶性茶多酚為主藥的凝膠劑、霜劑、軟膏齊U、塗劑、塗膜劑、膜劑和貼劑中的至少一種的藥物製劑。繪製對照品溶液的標準曲線並計算標準曲線的回歸方程的方法為:取乾燥的對照品，用有機溶劑溶解，配製成每毫升含有對照品分別為0，20，40，60，80和100 μ g的對照品溶液，以有機溶劑為參比。具體地，取乾燥的對照品50mg，用無水乙醇溶解並定容至IOOmL,分別取該溶液0，2，4，6，8和IOmL於50mL容量瓶中，用無水乙醇定容，即得每毫升定容後的溶液含對照品0，20，40，60，80和100 μ g的對照品溶液，以無水乙醇為參比，於275nm或274nm波長處測定吸光度，並繪製對照品溶液的標準曲線，由該標準曲線經計算得線性回歸方程。測定供試品溶液的吸光度的方法為:供試品溶液的濃度在線性回歸方程的線性範圍以內，當供試品為茶多酚硬脂酸酯時，以有機溶劑為參比；當供試品為含有脂溶性茶多酚的製劑時，以空白製劑提取液為參比，於275nm波長處測定供試品溶液的吸光度。可選地，茶多酚中含有的黃烷-3醇衍生物為:兒茶素、表兒茶素、沒食子兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素或表沒食子兒茶素沒食子酸酯。可選地，8碳以上的有機脂肪酸為:癸酸、羊蠟酸、月桂酸、肉豆蘧酸、棕櫚酸、珠光脂酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、桐酸、油酸或亞油酸。對照例茶多酚硬脂酸酯原料的含量測定茶多酚硬脂酸酯原料是以茶多酚為原料，醯化劑為硬脂酸醯滷或硬脂酸酸酐時，製備的茶多酚硬脂酸酯。取乾燥的茶多酹硬脂酸酯200mg,精密稱定,用無水乙醇溶解並定容至IOOmL,作為供試品溶液，取經 過100°C乾燥Ih的沒食子酸乙酯lOOmg，精密稱定，用水溶解並定容至IOOmL,作為標準品溶液；分別吸取lOOmg/lOOmL的標準品溶液2，4，6，8和IOmL於IOmL容量瓶中，用水定容至刻度，製備成每IOOmL含沒食子酸乙酯20，40，60，80和IOOmg的溶液。測定:分別準確吸取供試品溶液及各種濃度的標準品溶液各lmL，於IOmL比色管中，各加入三乙醇胺水溶液lmL，混勻，加入酒石酸鐵溶液5mL，加水定容至25mL，以空白試劑作為參比，於540nm波長下，在Icm比色杯中比色。結果計算:茶多酹硬脂酸酯(％)=樣品相當於標準品含量X 1.5X 100+樣品質量。按式計算，茶多酚硬脂酸酯含量為41.63%。該法不足之處是:相對於茶多酚，在茶多酚硬脂酸酯的組成、結構、平均分子量、分子中鄰二酚羥基或連三酚羥基的數量、與亞鐵離子顯色的強度等理化性質均發生了較大變化的情況下，該對照例仍然採用沒食子酸乙酯與表沒食子兒茶素沒食子酸酯在相同質量下與亞鐵離子顯色物吸光度的經驗比值即1.5，而且是通過測定酚羥基的含量間接反映茶多酚硬脂酸酯的含量，其測定結果偏低，不能直接測定茶多酚硬脂酸酯的含量。實施例一當以茶多酚為原料，醯化劑為硬脂酸醯滷或硬脂酸酸酐時，脂溶性茶多酚為茶多酚硬脂酸酯，測定茶多酚硬脂酸酯的含量。對照品為茶多酚硬脂酸酯，其茶多酚硬脂酸酯的紫外波長掃描圖如2所示。根據對照品溶液和供試品溶液的最大吸收波長均為275nm，則確定檢測波長為275nm誤差為±2nm，即在275nm誤差為±2nm範圍內檢測有效。取乾燥的茶多酚硬脂酸酯50mg，用無水乙醇溶解並定容至IOOmL,分別取該溶液0，2，4，6，8和IOmL於50mL容量瓶中，用無水乙醇定容，即得每毫升定容後的溶液含茶多酚硬脂酸酯O，20，40，60，80和IOOyg的對照品溶液，以無水乙醇為參比，於275nm波長處測定吸光度，並繪製對照品溶液的標準曲線，由該標準曲線經計算得線性回歸方程為:Y=0.0085X+0.0142，如圖1所示，其中，線性範圍為0-100 μ g/mL,線性範圍為X的取值範圍，R2=0.9992，R2為確定係數，該R2值越接近I表示該線性回歸方程越可靠，Y為對照品溶液的吸光度，X為對照品溶液的濃度。取茶多酚硬脂酸酯200mg，該樣品與對照例的樣品相同，精密稱定，置於50mL容量瓶中，用無水乙醇溶解並定容，精密量取該溶液ImL置於IOOmL容量瓶中，用無水乙醇定容，其紫外光譜掃描圖見附圖2，以無水乙醇為參比，按紫外分光光度法，在樣品配製2小時內，於275nm波長處測定吸光度，其吸光度為0.3558，將吸光度代入上述線性回歸方程並計算含量。結果測得茶多酚硬脂酸酯含量為100.47%，本發明實施例提供的方法測得含量值與茶多酚硬脂酸酯的實際含量接近。實施例二當以茶多酚為原料，醯化劑為硬脂酸醯滷或硬脂酸酸酐時，脂溶性茶多酚為茶多酚硬脂酸酯，測定茶多酚硬脂酸酯原料的含量。根據對照品溶液和供試品溶液的最大吸收波長均為275nm，則確定檢測波長為275nm誤差為±2nm，即在275nm誤差為±2nm範圍內檢測有效。對照品為表沒食子兒茶素沒食子酸酯硬脂酸酯，為茶多酚含有的表沒食子兒茶素沒食子酸酯與硬脂酸醯齒或硬脂酸酸酐反應的產物，其表沒食子兒茶素沒食子酸酯硬脂酸酯的紫外波長掃描圖如圖3所示。取乾燥的表沒食子兒茶素沒食子酸酯硬脂酸酯，用有機溶劑溶解，配製成每毫升含有表沒食子兒茶素沒食子酸酯硬 脂酸酯分別為0，20，40，60，80和100 μ g的對照品溶液，以有機溶劑為參比。具體地，取乾燥的表沒食子兒茶素沒食子酸酯硬脂酸酯50mg，用無水乙醇溶解並定容至IOOmL,分別取該溶液0，2，4，6，8和IOmL於5OmL容量瓶中，用無水乙醇定容，即得每毫升定容後的溶液含表沒食子兒茶素沒食子酸酯硬脂酸酯0，20，40，60，80和100 μ g的對照品溶液，以無水乙醇為參比，於275nm波長處測定吸光度，並繪製對照品溶液的標準曲線，如圖4所示，由該標準曲線經計算得線性回歸方程為:Y=0.0091Χ，其中，線性範圍為O-1OOy g/mL，線性範圍為X的取值範圍，R2=0.9993，R2為確定係數，該R2值越接近I表示該線性回歸方程越可靠，Y為對照品溶液的吸光度，X為對照品溶液的濃度。取茶多酚硬脂酸酯200mg，該樣品與對照例的樣品相同，精密稱定，置於50mL容量瓶中，用無水乙醇溶解並定容，精密量取該溶液ImL置於IOOmL容量瓶中，用無水乙醇定容，以無水乙醇為參比，按紫外分光光度法，在樣品配製2小時內，於275nm波長處測定吸光度，其吸光度為0.3716，將吸光度代入上述線性回歸方程並計算含量。結果測得茶多酚硬脂酸酯含量為102.09%，本發明實施例提供的方法測得含量值與茶多酚硬脂酸酯的實際含量接近。實施例三當以茶多酚為原料，醯化劑為棕櫚酸醯滷或棕櫚酸酸酐時，脂溶性茶多酚為茶多酚棕櫚酸酯，測定茶多酚棕櫚酸酯的製劑的含量，具體為測定茶多酚棕櫚酸酯凝膠劑的含量。對照品為表沒食子兒茶素沒食子酸酯棕櫚酸酯，為茶多酚含有的表沒食子兒茶素沒食子酸酯與棕櫚酸醯滷或棕櫚酸酸酐反應的產物。根據對照品溶液和供試品溶液的最大吸收波長均為275nm，則確定檢測波長為275nm誤差為±2nm，即在275nm誤差為±2nm波長範圍內檢測有效。取乾燥的表沒食子兒茶素沒食子酸酯棕櫚酸酯，用有機溶劑溶解，配製成每毫升含有表沒食子兒茶素沒食子酸酯棕櫚酸酯分別為0，20，40，60，80和100 μ g的對照品溶液，以有機溶劑為參比。具體地，取乾燥的表沒食子兒茶素沒食子酸酯棕櫚酸酯50mg，用無水乙醇溶解並定容至IOOmL,分別取該溶液0，2，4，6，8和IOmL於5OmL容量瓶中，用無水乙醇定容，即得每毫升定容後的溶液含表沒食子兒茶素沒食子酸酯棕櫚酸酯0，20，40，60，80和100 μ g的對照品溶液，以無水乙醇為參比，於275nm波長處測定吸光度，並繪製對照品溶液的標準曲線，如圖5所示，由該標準曲線經計算得線性回歸方程為:Y=0.0101X+0.0159，其中，線性範圍為0-100 μ g/mL,線性範圍為X的取值範圍，R2=0.9991，R2為確定係數，該R2值越接近I表示該線性回歸方程越可靠，Y為對照品溶液的吸光度，X為對照品溶液的濃度。取標示量為0.5%的茶多酚棕櫚酸酯凝膠劑5g，精密稱定，置於燒杯中，加適量正已烷，充分攪拌，混合物於離心機3600rpm離心30min，分取上清液，重複提取3次，合併上清液，過濾，濾液移入IOOmL容量瓶中，用正已烷定容，即得供試品溶液；取等質量空白凝膠劑，並按照製備供試品溶液的方法製備空白凝膠劑提取液，並作為參比；取供試品溶液，以製備的空白凝膠劑提取液作參比，按紫外分光光度法，在凝膠劑提取液配製2小時內，於275nm波長處測定吸光度，其中，含茶多酚棕櫚酸酯的凝膠劑的紫外波長掃描圖如圖6所示，處理過的空白凝膠劑的紫外波長掃描圖如圖7所示，其吸光度為0.5198，將吸光度代入上述線性回歸方程並計算茶多酚棕櫚酸酯含量，該凝膠劑中茶多酚棕櫚酸酯的含量為
0.4989%，本發明實施例提供的方法測得含量值與茶多酚棕櫚酸酯的實際含量接近。實施例四當以茶多酚為原料，醯化劑為棕櫚酸醯滷或棕櫚酸酸酐時，脂溶性茶多酚為茶多酚棕櫚酸酯，測定茶多酚棕櫚酸酯的製劑的含量，具體為茶多酚棕櫚酸酯軟膏劑的含量。對照品為茶多酚棕櫚酸酯。根據對照品溶液和供試品溶液的最大吸收波長均為274nm，則確定檢測波長為274nm誤差為±2nm，即在274nm誤差為±2nm範圍內檢測有效。取乾燥的茶多酚棕櫚酸酯，用有機溶劑溶解，配製成每毫升含有茶多酚棕櫚酸酯分別為0，20，40，60，80和100 μ g的對照品溶液，以有機溶劑為參比。具體地，取乾燥的茶多酚棕櫚酸酯50mg，用無水乙醇溶解並定容至IOOmL,分別取該溶液0，2，4，6，8和IOmL於50mL容量瓶中，用無水乙醇定容，即得每毫升定容後的溶液含茶多酚棕櫚酸酯0，20，40，60，80和100 μ g的對照品溶液，以無水乙醇為參比，於274nm波長處測定吸光度，並繪製對照品溶液的標準曲線，如圖8所示，由該標準曲線經計算得線性回歸方程為:Y=0.0101X+0.0042，其中，線性範圍為0-100 μ g/mL，線性範圍為X的取值範圍，R2=0.9992，R2為確定係數，該R2值越接近I表示該線性回歸方程越可靠，Y為對照品溶液的吸光度，X為對照品溶液的濃度。取標示量為2%的茶多酚棕櫚酸酯軟膏劑10g，精密稱定，置於燒杯中，加適量乙酸乙酯，充分攪拌，混合物於離心機3600rpm離心30min,分取上清液,重複提取3次,合併上清液，過濾，濾液移入I OOmL容量瓶中，用乙酸乙酯定容，精密量取該溶液ImL置於50mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容，即得供試品溶液；取等質量空白軟膏劑，並按照製備供試品溶液的方法製備空白軟膏劑提取液，並作為參比；取供試品溶液，以製備的空白軟膏劑提取液作參t匕，按紫外分光光度法，在供試品溶液配製2小時內，於274nm波長處測定吸光度，其吸光度為0.4084，將吸光度代入上述線性回歸方程並計算茶多酚棕櫚酸酯含量，該凝膠劑中茶多酚棕櫚酸酯的含量為2.0012%，本發明實施例提供的方法測得含量值與茶多酚棕櫚酸酯的實際含量接近。實施例五當以茶多酚為原料，醯化劑為月桂酸醯滷或月桂酸酸酐時，脂溶性茶多酚為茶多酚月桂酸酯，測定茶多酚月桂酸酯的含量。對照品為茶多酚月桂酸酯，其茶多酚月桂酸酯的紫外波長掃描圖如圖9所示。根據對照品溶液和供試品溶液的最大吸收波長均為275nm，則確定檢測波長為275nm誤差為±2nm，即在275nm誤差為±2nm範圍內檢測有效。取乾燥的茶多酹月桂酸酯50mg,用無水乙醇溶解並定容至IOOmL,分別取該溶液0，2，4，6，8和IOmL於50mL容量瓶中，用無水乙醇定容，即得每毫升定容後的溶液含茶多酚月桂酸酯O，20，40，60，80和IOOyg的對照品溶液，以無水乙醇為參比，於275nm波長處測定吸光度，並繪製對照品溶液的標準曲線，由該標準曲線經計算得線性回歸方程為:Y=0.0101X+0.0019，如圖10所示，其中，線性範圍為0-100 μ g/mL,線性範圍為X的取值範圍，R2=0.9992，R2為確定係數，該R2值越接近I表示該線性回歸方程越可靠，Y為對照品溶液的吸光度，X為對照品溶液的濃度。取茶多酚月桂酸酯200mg，精密稱定，置於50mL容量瓶中，用無水乙醇溶解並定容，精密量取該溶液ImL置於IOOmL容量瓶中，用無水乙醇定容，以無水乙醇為參比，按紫外分光光度法，在樣品配製2小時內，於275nm波長處測定吸光度，其吸光度為0.4017，將吸光度代入上述線性回歸方程並計算含量。
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結果測得茶多酚月桂酸酯含量為98.96%，本發明實施例提供的方法測得含量值與茶多酚月桂酸酯的實際含量接近。實施例六當以茶多酚為原料，醯化劑為肉豆蘧酸醯滷或肉豆蘧酸酸酐時，脂溶性茶多酚為茶多酚肉豆蘧酸酯，測定茶多酚肉豆蘧酸酯的含量。對照品為茶多酚肉豆蘧酸酯，其茶多酚肉豆蘧酸酯的紫外波長掃描圖如圖11所
/Jn ο根據對照品溶液和供試品溶液的最大吸收波長均為275nm，則確定檢測波長為275nm誤差為±2nm，即在275nm誤差為±2nm範圍內檢測有效。取乾燥的茶多酹肉豆蘧酸酯50mg,用無水乙醇溶解並定容至IOOmL,分別取該溶液0，2，4，6，8和IOmL於50mL容量瓶中，用無水乙醇定容，即得每毫升定容後的溶液含茶多酚肉豆蘧酸酯0，20，40，60，80和100 μ g的對照品溶液，以無水乙醇為參比，於275nm波長處測定吸光度，並繪製對照品溶液的標準曲線，由該標準曲線經計算得線性回歸方程為:Y=0.0103X+0.0091，如圖12所示，其中，線性範圍為0-100 μ g/mL，線性範圍為X的取值範圍，R2=0.9992，R2為確定係數，該R2值越接近I表示該線性回歸方程越可靠，Y為對照品溶液的吸光度，X為對照品溶液的濃度。
取茶多酚肉豆蘧酸酯200mg，精密稱定，置於50mL容量瓶中，用無水乙醇溶解並定容，精密量取該溶液ImL置於IOOmL容量瓶中，用無水乙醇定容，以無水乙醇為參比，按紫外分光光度法，在樣品配製2小時內，於275nm波長處測定吸光度，其吸光度為0.4255，將吸光度代入上述線性回歸方程並計算含量。結果測得茶多酚肉豆蘧酸酯含量為101.08%，本發明實施例提供的方法測得含量值與茶多酚肉豆蘧酸酯的實際含量接近。實施例七當以茶多酚為原料，醯化劑為癸酸醯滷或癸酸酸酐時，脂溶性茶多酚為茶多酚癸酸酯，測定茶多酚癸酸酯的含量。對照品為茶多酚癸酸酯，其茶多酚癸酸酯的紫外波長掃描圖如圖13所示。根據對照品溶液和供試品溶液的最大吸收波長均為275nm，則確定檢測波長為275nm誤差為±2nm，即在275nm誤差為±2nm範圍內檢測有效。取乾燥的茶多酹癸酸酯50mg,用無水乙醇溶解並定容至IOOmL,分別取該溶液0，2，4，6，8和IOmL於50mL容量瓶中，用無水乙醇定容，即得每毫升定容後的溶液含茶多酚月桂酸酯0，20，40，60，80和100 μ g的對照品溶液，以無水乙醇為參比，於275nm波長處測定吸光度，並繪製對照品溶液的標準曲線，由該標準曲線經計算得線性回歸方程為:Y=0.0099X+0.0036，如圖14所示，其中，線性範圍為0-100 μ g/mL,線性範圍為X的取值範圍，R2=0.9998，R2為確定係數，該R2值越接近I表示該線性回歸方程越可靠，Y為對照品溶液的吸光度，X為對照品溶液的濃度。取茶多酚 癸酸酯200mg，精密稱定，置於50mL容量瓶中，用無水乙醇溶解並定容，精密量取該溶液ImL置於IOOmL容量瓶中，用無水乙醇定容，以無水乙醇為參比，按紫外分光光度法，在樣品配製2小時內，於275nm波長處測定吸光度，其吸光度為0.3911，將吸光度代入上述線性回歸方程並計算含量。結果測得茶多酚癸酸酯含量為97.86%，本發明實施例提供的方法測得含量值與茶多酚癸酸酯的實際含量接近。經研究發現，脂溶性茶多酚組分雖然較多，但其結構中的母核以黃烷-3醇衍生物為主，其它組分也主要為多羥基酚，本發明採用紫外分光光度法，通過測定脂溶性茶多酚母核的含量來間接得知脂溶性茶多酚的含量，經過大量實驗研究發現，以茶多酚或茶多酚中含有的黃烷-3醇衍生物為反應物製備的脂溶性茶多酚的有機溶劑溶液，以及由脂溶性茶多酚製備的所述製劑的有機溶劑提取液，紫外吸收峰位穩定，均在275nm誤差為±2nm，而且其濃度在一定範圍內與吸收度呈現良好的線性關係，此結果為本發明技術的基礎。需要說明的是，在本發明提供的實施例中，有機溶劑採用無水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿和正已烷，但是在其它實施例中，也可以採用環己烷、石油醚或二甲基亞碸，由實驗可知，當有機溶劑採用無水乙醇、正丁醇、氯仿、正已烷、環己烷、石油醚或二甲基亞碸時，獲得的實驗結果數據與前述實施例基本相同；同樣地，在本發明提供的實施例中採用茶多酚棕櫚酸酯為主藥的凝膠劑和軟膏劑，但是在其他實施例中，採用茶多酚棕櫚酸酯為主藥的霜劑、塗劑、塗膜劑、膜劑或貼劑作為供試品，獲得的實驗結果數據與前述實施例基本相同。以上所述僅為本發明的較佳實施例，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
權利要求
1.一種測定脂溶性茶多酚含量的方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟: 將對照品和供試品分別製備成對照品溶液和供試品溶液，所述供試品為脂溶性茶多酚或含有所述脂溶性茶多酚的製劑，所述供試品溶液的溶劑為有機溶劑，所述對照品為脂溶性茶多酚，所述對照品溶液的溶劑為有機溶劑； 通過分別繪製所述對照品溶液和所述供試品溶液的紫外波長掃描圖，獲得所述對照品溶液和所述供試品溶液的最大吸收波長，並根據所述最大吸收波長確定檢測波長； 繪製所述對照品溶液的標準曲線並計算所述標準曲線的回歸方程； 採用紫外分光光度法測定所述供試品溶液的吸光度； 將所述供試品溶液的吸光度帶入所述標準曲線回歸方程計算所述供試品中脂溶性茶多酚的含量。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述脂溶性茶多酚為茶多酚與8碳以上的有機脂肪酸的醯滷或酸酐反應得到的產物、或者為所述茶多酚中含有的黃烷-3醇衍生物與所述8碳以上的有機脂肪酸的醯滷或酸酐反應得到的產物。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，通過所述供試品溶液的紫外波長掃描圖確定所述供試品溶液的最大吸收波長的方法為:所述供試品為所述脂溶性茶多酚時，將所述脂溶性茶多酚配製成每毫升含有所述脂溶性茶多酚為0.04mg的所述供試品溶液，以所述有機溶劑為參比，在200-400nm波長範圍內掃描，得到所述供試品溶液的紫外波長掃描圖，由所述紫外波長掃描圖確定所述供試品溶液的最大吸收波長為275nm。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，通過所述供試品溶液的紫外波長掃描圖確定所述供試品溶液的最大吸收波長的方法為:所述供試品為所述含有所述脂溶性茶多酚的製劑時，取所述製劑適量，精密稱定，置於容器中，加適量所述有機溶劑，充分攪拌，於離心機3600rpm離心30min，分取上清液，並重複提取3次，合併所述上清液並過濾，將濾液移入容量瓶，用所述有機溶劑定容，配製成每毫升含有所述脂溶性茶多酚為0.04mg的所述供試品溶液，以製備所述供試品溶液的方法製備等質量空白製劑提取液作為參比，在200-400nm波長範圍內掃描，得到所述供試品溶液的紫外波長掃描圖，由所述紫外波長掃描圖確定所述供試品溶液的最大吸收波長為275nm。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，通過所述對照品溶液的紫外波長掃描圖確定所述對照品溶液的最大吸收波長的方法為:取所述對照品，用所述有機溶劑溶解，配製成每毫升含有所述對照品為0.04mg的所述對照品溶液，以所述有機溶劑為參比，在200-400nm波長範圍內掃描，得到所述對照品溶液的紫外波長掃描圖，由所述紫外波長掃描圖確定所述對照品溶液的最大吸收波長為275nm。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，根據所述對照品溶液與所述供試品溶液的最大吸收波長均為275nm,確定所述檢測波長為275nm誤差為±2nm。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，繪製所述對照品溶液的標準曲線並計算所述標準曲線的回歸方程的方法為:取乾燥的所述對照品，用所述有機溶劑溶解，配製成每毫升含有所述對照品分別為O，20，40，60，80和100 μ g的所述對照品溶液，以所述有機溶劑為參比，於275nm波長處測定吸光度，並繪製所述對照品溶液的標準曲線，由所述標準曲線經計算得所述線性回歸方程。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於，測定所述供試品溶液的吸光度的方法為:所述供試品溶液的濃度在線性回歸方程的線性範圍以內，當所述供試品為所述脂溶性茶多酚時，以所述有機溶劑為參比；當所述供試品為所述含有脂溶性茶多酚的製劑時，以所述空白製劑提取液為參比，於275nm波長處測定所述供試品溶液的吸光度。
9.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述含所述茶多酚硬脂酸酯的製劑為以所述茶多酚硬脂酸酯為主藥的凝膠劑、霜劑、軟膏劑、塗劑、塗膜劑、膜劑和貼劑中的至少一種的藥物製劑。
10.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述有機溶劑為無水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、正已烷、環己烷、石油醚和二甲基亞碸中的至少一種。
11.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述茶多酚中含有的黃烷-3醇衍生物為:兒茶素、表兒茶素、沒食子兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素或表沒食子兒茶素沒食子酸酯。
12.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述8碳以上的有機脂肪酸為:癸酸、羊蠟酸、月桂酸、肉豆 蘧酸、棕櫚酸、珠光脂酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、桐酸、油酸或亞油酸。
全文摘要
本發明公開了一種測定脂溶性茶多酚含量的方法，屬於化學定量檢測領域。所述方法包括將對照品和供試品分別製備成對照品溶液和供試品溶液；通過分別繪製所述對照品溶液和所述供試品溶液的紫外波長掃描圖確定檢測波長；繪製所述對照品溶液的標準曲線並計算所述標準曲線的回歸方程；測定所述供試品溶液的吸光度；將所述吸光度帶入所述標準曲線回歸方程計算所述供試品中脂溶性茶多酚的含量。本發明通過對脂溶性茶多酚以及含有脂溶性茶多酚的製劑進行含量測定，避免通過測定酚羥基的含量間接反映脂溶性茶多酚含量，這樣就無需加入顯色劑或氧化劑，避免了使用昂貴的標準品和昂貴的儀器設備條件，降低了成本，而且測定方法簡便、準確。
文檔編號G01N21/35GK103234934SQ20131010823
公開日2013年8月7日 申請日期2013年3月29日 優先權日2013年3月29日
發明者張濤 申請人:江漢大學