雷公藤甲素順鉑聯合運用在製備抗耐藥性胰腺癌藥物中的應用的製作方法
2023-12-05 13:08:31
專利名稱：雷公藤甲素順鉑聯合運用在製備抗耐藥性胰腺癌藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及雷公藤甲素順鉬聯合運用在製備抗耐藥性胰腺癌藥物以及在製備抗腫瘤藥物增敏劑中的應用。
背景技術：
胰腺癌是一種常見的消化道腫瘤，具有惡性程度高、侵襲速度快和致死率高的特點。由於目前尚缺乏早期發現胰腺癌的有效手段，加之確診後病情進展迅速，致使大多數胰腺癌病人無法實施手術。據世界衛生組織癌症研究中心的最新估計(GL0B0CAN 2008)，全球範圍內每年新診斷胰腺癌病例27.87萬例，死亡沈.27例，死亡發病比為0.94 [1]。在所有常見的惡性腫瘤中，胰腺癌患者的生存率最低，其平均中位生存期為3個月，5年生存率為 3-5%。參考文獻[1]。[1] Ferlay J, Shin HR, Bray F, et al. GL0B0CAN 2008，Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No. 10. http://www. iarc. fr/ en/publication/eresources/cancerbases/index, php嘧啶核苷類似物吉西他賓自上世紀末以來被認為是治療胰腺癌的唯一有效的藥物， 但也只有20-30%的病人對該藥敏感，該藥與其它一線抗癌藥物聯合運用未見協同作用 [2-4]。藥物的耐受性的產生是導致胰腺癌化學治療失敗的最主要原因。針對藥物耐受性發展新的化學治療藥物已經成為治療胰腺癌的一個重要方向。參考文獻[2-4]。[2] Ina S, Hirono S, Noda T, et al. Identifying molecular markers for chemosensitivity to gemcitabine in pancreatic cancer: increased expression of interferon-stimulated gene 15 kd is associated with intrinsic chemoresistance. Pancreas. 39(4): 473-485. [3] Rivera F, Lopez-Tarruella S, Vega-Villegas ME, et al. Treatment of advanced pancreatic cancer: from gemcitabine single agent to combinations and targeted therapy. Cancer Treat Rev. 2009. 35(4): 335-339. [4] Heinemann V. Gemcitabine: progress in the treatment of pancreatic cancer. Oncology. 2001. 60(1) : 8-18.雷公藤甲素是從衛矛科植物雷公藤rripterj^i wilfoudii Hook. f.左中分離得到的環氧化二萜內酯化合物。雷公藤用於治療自身免疫性疾病如腎炎、類風溼關節炎等已經有幾個世紀。近年來，越來越多研究發現，雷公藤甲素具有非常強的抗癌活性，通過促進腫瘤細胞凋亡顯著抑制腫瘤的生長及轉移。雷公藤甲素與多種抗癌藥(如阿糖胞苷、阿黴素、 拓撲異構酶I抑制劑CPT-11)聯合運用可增強這些藥物的抗腫瘤效果，提示雷公藤甲素作為腫瘤增敏劑的應用潛力[5，6]。參考文獻[5]和[6]。[5] Pigneux A, Mahon FX, Uhalde Μ, et al. TPL cooperates with chemotherapy to induce apoptosis in acute myeloid leukemia cells. Exp Hemato1. 2008. 36(12) : 1648—1659. [6] Chang WT, Kang JJ,Lee KY, et al. TPL and chemotherapy cooperate in tumor cell apoptosis. A role for the p53 pathway. J Biol Chem. 2001. 276(3) : 2221-2227.順鉬屬於高效廣譜抗癌藥，主要通過誘導細胞凋亡抑制腫瘤生長。其對胰腺癌治療不敏感，與吉西他賓聯合運用也達不到理想的治療作用[7]。參考文獻[7]。[7] Choi JH, Oh SY, Kwon HC, et al. Gemcitabine versus gemcitabine combined with DDP treatment locally advanced or metastatic pancreatic cancer: a retrospective analysis. Cancer Res Treat. 2008. 40(1) : 22-26.HSP27，包括HSP79，HSP90均是熱休克蛋白家家族HSI3s成員。HSI3s屬於應激蛋白的一種。作為小分子伴娘蛋白，HP^參與細胞凋亡過程與癌變過程。大量的文獻報導 HSP27在藥物耐受的腫瘤，比如胃癌、結腸癌、卵巢癌和淋巴癌中高度表達，在藥物耐受中扮演了非常重要的作用。在侵襲性惡性胰腺癌細胞株和雄性激素不敏感的細胞株，HSP27 表達顯著上調。HSP27可能是一個潛在的針對藥物耐受性的靶點[8]。參考文獻[8]。 [8] Cornford PA, Dodson AR, Parsons KF, et al. Heat shock protein expression independently predicts clinical outcome in prostate cancer. Cancer Res. 2000. 60(24) : 7099-7105.我們的研究發現，與單獨運用雷公藤甲素和與順鉬相比，雷公藤甲素與順鉬聯合運用可協同增強對耐藥性胰腺癌PANC-I和MIA I^Ca-2細胞的誘導凋亡作用。裸鼠異位移植腫瘤試驗表明，雷公藤甲素與順鉬聯合運用顯著增強了抑癌活性。據我們的文獻檢索，至今未見關於雷公藤甲素和與順鉬聯合運用協同增強抗癌或抑瘤效果的報導
發明內容
本發明的目的在於克服現有技術的不足，提供一種藥物組合物，該組合物由雷公藤甲素與順鉬組成。
本發明的另一目的是提供上述組合物在製備抗耐藥性胰腺癌藥物中的應用。
本發明的進一步目的是提供上述組合物在製備抗腫瘤藥物增敏劑中的應用。
為了實現上述目的，本發明採用如下技術方案我們的研究表明，在耐藥性胰腺癌細胞株PANC-I和MIA PaCa-2中，單獨運用較低劑量的雷公藤甲素或順鉬僅輕微降低細胞生存率，而兩者聯合使生存率降低了大約50% 以上。同時，通過兩者多個濃度聯合應用測定得到的聯合治療係數CI低於1，表明兩種藥物可協同殺傷胰腺癌細胞，其協同抑瘤作用是通過線粒性途徑實現的。雷公藤甲素和順鉬重量份數比為1 一20:2—120。雷公藤甲素-順鉬協同抑癌作用可能與HSP27顯著下調緊密相關。此外，濃縮、碎裂的細胞核象以及凋亡執行酶caspase-3活性的3. 3倍增強，進一步提示兩種藥物聯合應用誘導了明顯的細胞凋亡，且較單獨應用效果明顯。
雷公藤甲素-順鉬聯合運用，較單獨使用雷公藤甲素或順鉬，PANC-I細胞漿中細胞色素C的含量及Caspase-9活性顯著增加，表明雷公藤甲素_順鉬協同誘導凋亡作用是通過線粒途徑介導的。
與單獨應用雷公藤甲素或順鉬相比較，兩者聯合應用可協同使HSP27下調表達。 沉默HSP27基因，可使PANC-I細胞對雷公藤甲素或順鉬的敏感性提高，生存率較單用化療藥物明顯降低。這些提示HSP27下調可增強藥物的抗癌效果，可能與雷公藤甲素和順鉬聯合運用增強化學治療敏感性相關。
在裸鼠異種移植模型上，聯合運用低劑量的雷公藤甲素(0.25 mg/kg，l次/2天) 和順鉬(3mg/kg，1次/1周)顯著抑制腫瘤的生長，而單用雷公藤甲素或順鉬均不能引起腫瘤的生長抑制。對各組的腫瘤切片的免疫組化結果表明，兩種藥物聯用顯著下調HSP27的蛋白表達，與細胞株上的結果一致。這說明雷公藤甲素和順鉬聯合運用能作為抗腫瘤藥物的增敏劑。
綜上，雷公藤甲素-順鉬聯合運用對耐藥性胰腺癌具有明顯的協同抑制作用。到目前為止，還沒有關於雷公藤甲素-順鉬聯合運用具有協同抑制胰腺癌的研究報導。
圖1為雷公藤甲素增強了順鉬對吉西他賓耐受的胰腺癌細胞株PANC-I凋亡的誘導作用。
A雷公藤甲素對細胞存活率的影響；B Hoechst 33258染色箭頭指的是凋亡細胞的細胞核；C caspase-3的活性；D乳酸脫氫酶(LDH)的相對釋放量。數值用平均值士標準差(n=3)。PANC-I經雷公藤甲素(25 nM)和(或)順鉬(16 μ M)共孵48小時；TPL—雷公藤甲素；DDP—順鉬；IPL+DDP —雷公藤甲素與順鉬聯合運用；與對照組比較，* p< 0.05,** /7 < 0. 01。
圖2為雷公藤甲素增強了順鉬對吉西他賓耐受的胰腺癌細胞株MIA PaCa-2凋亡的誘導作用。
A雷公藤甲素對細胞存活率的影響；B Hoechst 33258染色箭頭指的是凋亡細胞的細胞核；C caspase-3的活性；D乳酸脫氫酶(LDH)的相對釋放量。數值用平均值士標準差(n=3)。MIA PaCa-2經雷公藤甲素05 nM)和(或)順鉬(16 μ M)共孵48小時; TPL—雷公藤甲素；DDP—順鉬；TPL+DDP —雷公藤甲素與順鉬聯合運用；與對照組比較，* ρ< 0. 05，^ ρ < 0. 01。
圖3為雷公藤甲素和順鉬誘導凋亡的協同作用經線粒體途徑介導。
A Cytochrome c 的相對釋放；B caspase-9 活性。PANC-1 經雷公藤甲素(25 nM) 和(或)順鉬(16 μ Μ)共孵48小時；TPL—雷公藤甲素；DDP—順鉬；TPL+DDP —雷公藤甲素與順鉬聯合運用；與對照組比較，^ ρ < 0. 01。
圖4為雷公藤甲素與順鉬聯合運用下調了 PANC-I細胞中HSP27的蛋白表達。
A雷公藤甲素對HSP27、HSP70、HSP90蛋白水平的影響；B順鉬對HSP27、HSP70、 HSP90蛋白水平的影響；C雷公藤甲素與順鉬聯合運用對HSP27和HSP70蛋白水平的影響。 PANC-I經雷公藤甲素05 nM)和(或)順鉬(16 μ M)共孵48小時；TPL—雷公藤甲素； DDP—順鉬；TPL+DDP —雷公藤甲素與順鉬聯合運用；與對照組比較，#或## ρ < 0.01。
圖5為HSP27敲除增強了雷公藤甲素或順鉬對PANC-I細胞的殺傷作用。
A HSP27的沉默濃度為50 nM的siRNA片段01，02和03對PANC-1細胞幹預48小時的沉默效用檢測；B沉默HSP27對雷公藤甲素殺傷腫瘤細胞的增敏作用；C沉默HSP27對順鉬殺傷腫瘤細胞的增敏作用。ρ < 0.05為陰性對照寡核苷酸聯合雷公藤甲素和HSP27-siRNA聯合雷公藤甲素組相比；ρ < 0. 01為陰性對照寡核苷酸聯合順鉬和HSP27-siRNA聯合順鉬組相比.圖6為雷公藤甲素和順鉬聯合運用顯著地抑制了腫瘤的生長。
A藥物治療對裸鼠異體移植腫瘤的生長的影響=PANC-I細胞(5X IO6)被接種到6 周齡裸鼠的側腹。10天後，成功接種了腫瘤的裸鼠被分成四組，分別給予含1% DMSO的生理鹽水(1次/2天)、雷公藤甲素0.25 mg/kg (1次/2天)、順鉬;3mg/kg (1次/1周)以及聯合給予雷公藤甲素和順鉬。/7 < 0.01，與溶劑組比較；B第25天動物的腫瘤重量；C腫瘤的形態大小；D裸鼠的體重變化；E經免疫組化方法測定的HSP27蛋白水平。Vehicle—溶劑組；TP—雷公藤甲素組；DDP—順鉬組；TPL+DDP—雷公藤甲素與順鉬聯合運用組。
具體實施方式
實施例1 雷公藤甲素增強順鉬對吉西他賓耐受的胰腺癌細胞株PANC-I凋亡的誘導作用1)細胞存活率的測定腫瘤細胞用含10% (v/v) FBS的DMEM培養基稀釋並接種至96孔板。使細胞濃度為 2Χ103/孔，37°C、5%C02孵育過夜。遂加入藥物，孵育48小時。然後每孔加入20 ul MTT溶液，繼續培養4 h。IOOOrpm離心lOmin，小心吸掉上清，每孔加入100 ul 二甲基亞碸，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀於570nm (630nm校準)處測量各孔的吸光值0D。
細胞存活率=0Dt/0D。X100% ODt，試驗組OD值；0D。，對照組OD值。
2) caspase-3 活性測定將腫瘤細胞OXlO6/孔)接種至6孔板，培養過夜使貼壁。加入藥物，孵育48小時。冰浴下加入裂解液裂解15 min，4°C 15000rpm離心10 min，吸取上清液用Lowry法測定上清蛋白含量。加入反應緩衝液和caspase-3底物，培養4小時，用酶標儀測定405 nm 處的OD值。用蛋白量對caspase-3活性進行標準化，結果表示為與對照組的相對比值。
3) Hoechst 33342 染色腫瘤細胞中加入Hoechst 33342，避光培養20min，用PBS洗滌2-3次，於340 nm在螢光顯微鏡下觀察。
4) LDH釋放量檢測將腫瘤細胞OXlO6/孔)接種至6孔板，培養過夜使貼壁。加入藥物，孵育48小時。 每孔吸取50 μ 1培養基上清於另一 96孔板，每孔加入反應液50 μ 1，置37°C 5% CO2的二氧化碳培養箱中培養30 min.然後加入50 μ 終止液，在酶標儀上用波長450 nm測定各孔的OD值。結果表示為與對照組的相對比值。
在吉西他賓耐受的胰腺癌細胞株PANC-I中，單獨運用雷公藤甲素(TPL，25 nM)或順鉬(DDP，16 μ Μ)僅略微降低了 PANC-I細胞的存活率，而兩種藥物聯合運用(TPL+DDP) 則顯著地降低了細胞存活率(與對照組比較，降低了討％)。聯合治療係數CI低於1，揭示兩種藥物聯合運用為協同作用。細胞經Hoechst 33342染色後進行形態學觀察，與其它組相比，聯合用藥組細胞核出現明顯濃縮和碎裂。藥物聯合運用組，在細胞凋亡中起著重要作用的caspase-3的活性較對照組相比，增強了 3. 3倍。相比之下，雷公藤甲素組僅增強了 1. 46倍，順鉬為1.87倍。各組LDH釋放與對照組相比均未見明顯改變。結果如圖1所示。
實施例2 雷公藤甲素增強順鉬對吉西他賓耐受的胰腺癌細胞MIA I^aCa-2凋亡的誘導作用細胞存活率、caspase-3活性、Hoechst 33342染色及LDH釋放同實施例1。
在吉西他賓耐受的胰腺癌細胞MIA I^aCaj中，單獨運用雷公藤甲素(TPL，25 nM) 或順鉬(DDP，16 μ Μ)僅略微降低了細胞存活率，而兩種藥物聯合運用(TPL+DDP)則顯著地降低了細胞存活率(與對照組比較，降低了 59 %)。聯合治療係數CI低於1，揭示兩種藥物聯合運用為協同作用。細胞經Hoechst 33342染色後進行形態學觀察，與其它組相比， 聯合用藥組細胞核出現明顯濃縮和碎裂。藥物聯合運用組，在細胞凋亡中起著重要作用的 caspase-3的活性較對照組增強了 2. 6倍。相比之下，雷公藤甲素組僅增強了 1. 25倍，順鉬為1.65倍。各組LDH釋放與對照組相比均未見明顯改變。結果如圖2所示。
實施例3雷公藤甲素-順鉬協同誘導凋亡作用通過線粒途徑介導 1)細胞色素C測定將腫瘤細胞G2X IO6/孔)接種至6孔板，培養過夜使貼壁。加入藥物，孵育48小時。 抽提各組的胞漿蛋白，再將實驗各組的胞漿蛋白液及梯度稀釋後的細胞色素C標準液加入 96孔酶標板，每孔100 μ 過夜。每個樣品加3個孔，以鑑定區別陽性結果與汙染所致的假陽性結果。次日，將96孔板中的培養液吸出，按EL I SA試劑盒步驟進行操作用洗液(w ash solution)洗 1 次，加入分析液(assay diluent)，每孔 200 μ 1 室溫 lh。 加入用分析液稀釋的(1:350)鼠抗馬細胞色素C抗體，室溫下搖3 h。用洗液洗3次後，加入用分析液稀釋的(1:1000) HRP標記的抗人IgG的二抗，室溫下搖lh。洗8次後加入感光劑，30m in後終止反應，於酶標儀450nm下讀數。用蛋白量對caspase-3活性進行標準化，結果表示為與對照組的相對比值。結果如圖3A所示。
2) caspase-9 活性測定用Caspase-GloTM發光實驗進行測定。細胞((2X IO5/孔)被同時接種在透明和不透明的96孔板中，培養過夜使貼壁。加入100 μ 1 Caspase-Glo反應液，輕輕振搖使混勻， 室溫下孵育1.5小時後測定螢光。透明96孔板用MMT法測定細胞存活率。用細胞數對 caspase-9活性進行標準化，結果表示為與對照組的相對比值。
在PANC-I細胞中，雷公藤甲素-順鉬聯合運用顯著增強了細胞色素C從線粒體釋放進入胞液的量，與對照組相比，細胞色素C的含量升高了約3倍。雷公藤甲素-順鉬聯合運用，Caspase-9活性與對照組相比增加了約9倍。均較單獨使用雷公藤甲素或順鉬有顯著升高。提示，雷公藤甲素-順鉬協同抑瘤作用是通過線粒途徑介導的。結果如圖:3B所示。
實施例4雷公藤甲素與順鉬聯合運用下調了 PANC-I細胞中HSP27的蛋白表達 Western blotting參照Qiu等報導[9]的方法進行。如圖4所示，雷公藤甲素單獨應用在25nM至IOOnM濃度範圍內可劑量依賴性的降低HSP27的蛋白表達，IOOnM可下調HSP70 的表達，對HSP90無影響；順鉬單獨運用對HSP70和HSP90的蛋白表達沒有影響，但能劑量依賴性的下調HSP27的蛋白表達。隨雷公藤甲素和順鉬濃度的增加，HSP27蛋白表達呈濃度依賴地下調。將25nM雷公藤甲素與16 μ M的順鉬聯合運用，HSP27下調到一個相當低的水平。HSP27可通過結合cytochrome c抑制凋亡，因此該蛋白的協同下調很可能是雷公藤甲素與順鉬聯合運用協同誘導凋亡的重要機理。參考文獻[9]。[9] Qiu D, Zhao G, Aoki Y,et al. Immunosuppressant PG490 (TPL) inhibits T-cell interleukin-2 expression at the level of purine-box/nuclear factor of activated T-cells and NF-kappaB transcriptional act iy at ion. J Biol Chem. 1999. 274(19) : 13443-13450. 實施例5 HSP27敲除增強了雷公藤甲素或順鉬的細胞毒性採取三對幹擾片斷SiRNAOOl，SiRNA002，SiRNA003，對HSP27基因進行敲除。如圖5所示，經Wfestern blotting證實SiRNA 03是HSP27最有效的幹擾片斷。與陽性對照寡核苷酸相比，沉默HSP27基因，使各劑量的雷公藤甲素或順鉬對細胞的殺傷作用明顯增強。提示 HSP27下調可增強胰腺癌細胞對雷公藤甲素或順鉬的敏感性，可能是雷公藤甲素和順鉬聯合運用化學治療敏感性增強的重要原因。
實施例6雷公藤甲素和順鉬聯合運用顯著地抑制了腫瘤的生長PANC-I細胞(5X106)被接種到6周齡裸鼠的側腹的皮下。4天後，將成功接種了異位腫瘤的裸鼠分成四組，分別給予含1% DMSO的生理鹽水(1次/2天)、雷公藤甲素0.25 mg/ kg (1次/2天)、順鉬3mg/kg (1次/1周)以及聯合給予雷公藤甲素和順鉬。25天後，處死裸鼠，切除腫瘤，測定腫瘤大小。
將腫瘤組織用4%的福馬林緩衝液固定M小時，用石蠟包埋。進行熱固定、除去石蠟以及重新水化後，將組織切片浸入IOmM檸檬酸緩衝液(pH 6.0)微波lOmin。組織切片與1. 5%的block serum培養1小時，然後與HSP27抗體4°C孵育過夜。結合了 HPR的第二抗體1小時。最後，組織切片用Gills Hemtoxylin III進行復染，在倒置顯微鏡下觀察。
在裸鼠異種移植模型上，單獨運用低劑量的雷公藤甲素或順鉬，對腫瘤生長無統計學意義的抑制作用。然而，聯合運用低劑量的雷公藤甲素和順鉬顯著降低了腫瘤的體積和質量。免疫組化結果也表明，藥物聯合降低了 HSP27。結果如圖6所示。
權利要求
1.一種組合物，其特徵在於，由雷公藤甲素和順鉬組成，雷公藤甲素和順鉬重量份數比為 1 一 20:2—120。
2.權利要求1所述組合物在製備抗耐藥性胰腺癌藥物中的應用。
3.權利要求1所述組合物在製備抗腫瘤藥物增敏劑中的應用。
全文摘要
本發明公開了雷公藤甲素順鉑聯合運用在製備抗耐藥性胰腺癌藥物中的應用。在兩種耐藥性胰腺癌細胞PANC-1和MIAPaCa-2上，以及側腹接種PANC-1細胞的裸鼠上，證實雷公藤甲素-順鉑聯合運用對耐藥性胰腺癌具有協同抑瘤作用。到目前為止，還沒有關於雷公藤甲素-順鉑聯合運用具有協同抑制胰腺癌的研究報導。在裸鼠異種移植模型上，聯合運用低劑量的雷公藤甲素和順鉑顯著抑制腫瘤的生長，而單用雷公藤甲素或順鉑均不能引起腫瘤的生長抑制。對各組的腫瘤切片的免疫組化結果表明，兩種藥物聯用顯著下調HSP27的蛋白表達，與細胞株上的結果一致。這說明雷公藤甲素和順鉑聯合運用能作為抗腫瘤藥物的增敏劑。
文檔編號A61K31/585GK102499942SQ20111038450
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月28日 優先權日2011年11月28日
發明者朱文博, 李晶潔, 胡海燕 申請人:廣州市賽普特醫藥科技有限公司