一種翅果油樹試管苗的繁殖方法

2023-12-05 06:40:31 1

專利名稱：一種翅果油樹試管苗的繁殖方法
技術領域：
本發明涉及一種翅果油樹試管苗的繁殖方法。
背景技術：
翅果油樹(Elaeagnus molis Diels)是胡頹子科、胡頹子屬的一種多年生落葉灌木或喬木，也是一種新興的油料和藥用植物(中國樹木志，1983)。目前，翅果油樹已被列入國家重點保護野生植物名錄(第一批)中，屬國家二級保護植物，其分布範圍狹窄，僅分布於山西呂梁山南段東側的鄉寧、河津、中條山南段西側的翼城等縣，此外，陝西渭河流域(戶縣澇峪溝)也有少量分布。經檢測，該植物種仁的含油率高達51％，且油質好，可應用於食品、醫藥和工業領域，其中，亞油酸含量高達所含油脂總量的45％，維生素E的含量高達1558mg/100mg(馮寶英和楊坪榮，翅果油樹種仁化學成分析研究[J].山西林業科技，46-9.1989)；經化學成分分析，其葉富含18種胺基酸，粗蛋白、粗脂肪，7種維生素，多種微量元素，3種黃酮類化合物，含量達58.5-58.8％的亞麻酸以及7.6-10.9％的亞油酸，因此可將其進一步開發為保健食品(王聯結和白新生，翅果油樹葉化學分析研究[A].見王伏雄主編.北方植物學研究，(第一集)[C].南開大學出版社，141-146，1993)。此外，翅果油樹開花早、花粉香，含蜜量大，是很好的早春蜜源植物，而且其根系發達，富含根瘤菌，能固氮，對貧瘠、乾旱、寒冷、高溫等逆境脅迫均具有較高的抗性(王毅巖，一種新的共生固氮植物—翅果油樹[J].植物學報，(4)359.1981；楊曉玲，郭金耀，張青娥，翅果油樹生物學特性的研究[A].見王伏雄主編.北方植物學研究(第一集)[C]，天津南開大學出版社，215-218.1993)。目前，國家開發大西北，號召退耕還林，綠化荒山，翅果油樹可作為優選樹種進行推廣。因此，綜合開發利用翅果油樹，具有較高的社會、環保和經濟價值。然而，其開發利用也受到一些因素的限制，主要因素是繁殖率不高。
翅果油樹有兩種繁殖方式其一為種子繁殖，但種子發芽率較低，已有研究表明，未經任何處理的種子，發芽率為5.93％，發芽後能正常發育成籽苗(Seedling)的僅為1.69％。經過沙積處理的種子的發芽率為45.76％，但發芽後能正常發育成苗的也僅為11.02％(山西省林科所造林組，翅果油樹調查試驗初報.山西林業科技，125-32，1974)。另外，翅果油樹種子的壽命也短，保存一年後其發芽率幾乎為零(上官鐵梁，張峰，我國特有珍稀植物翅果油樹瀕危原因分析[J].生態學報，21(3)502-505，2001)，且自然狀態下的種子苗很少；其二是通過植株根櫱苗繁殖，但根櫱苗自生根能力差，繁殖係數低，而且，通過這種營養繁殖方法長成的苗木病害嚴重。因此利用組織培養方法，尤其用種子苗為材料進行快速繁殖生產的翅果油樹苗木具有無病毒、無菌，且繁殖係數高等優點。

發明內容
本發明的目的是提供一種翅果油樹試管苗的繁殖方法。
本發明所提供的翅果油樹試管苗的繁殖方法，可包括以下步驟1)以無菌種子苗的莖段、根段或子葉切塊為外植體誘導愈傷組織；所述愈傷組織誘導培養基是在MS基本培養基的基礎上添加了2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，蔗糖和瓊脂，pH值為5.0-6.5，優選為5.8；2)將愈傷組織置於預分化培養基上進行預分化；所述預分化培養基是在MS基本培養基的基礎上添加了6-苄基腺嘌呤(6-BA)，α-萘乙酸(NAA)，蔗糖和瓊脂，pH值為5.0-6.5，優選為5.8；3)將步驟2)經預分化培養的愈傷組織置於分化培養基上進行不定芽的分化；所述分化培養基是在MS基本培養基的基礎上添加了6-苄基腺嘌呤，α-萘乙酸和瓊脂，pH值為5.0-6.5，優選為5.8；4)將步驟3)長出不定芽原基的愈傷組織置於芽伸長培養基上促進芽長成無根小苗；所述芽伸長培養基是在MS基本培養基的基礎上添加了6-苄基腺嘌呤，α-萘乙酸，赤黴素(GA3)和瓊脂，pH值為5.0-6.5，優選為5.8；5)對步驟4)獲得的小苗用吲哚丁酸(IBA)溶液浸泡法或微型扦插法進行生根培養，得到翅果油樹試管苗；所述吲哚丁酸溶液浸泡法為將小苗的基部置於100-300mg/L吲哚丁酸溶液中浸泡0.5-2小時後，將基部插入1/2MS基本培養基中進行培養；微型扦插法為將小苗置於生根培養基上誘導生根，所述生根培養基是在1/2MS基本培養基的基礎上添加了α-萘乙酸，水解乳蛋白(LH)，吲哚丁酸，蔗糖和瓊脂，pH值為5.0-6.5，優選為5.8。
在上述繁殖方法中，翅果油樹無菌種子苗的獲得方法可為將種仁經消毒後置於添加有瓊脂的1/2MS基本培養基，在(25±2)℃、光照時間10-12小時/天、光照強度1000-1500Lx的條件下進行培養，培養7天後移到7％瓊脂培養基上繼續培養；所述培養基中瓊脂的含量為0.5-0.8％，優選為0.68或0.7％，pH值為5.0-6.5，優選為5.8。
愈傷組織的培養條件可為在(25±2)℃下暗培養，暗培養時間為21-30天，優選的暗培養時間為28天。
為獲得大量的愈傷組織，可將經誘導獲得的愈傷組織再移至新的愈傷組織誘導培養基上，並在相同的愈傷組織培養條件下進行繼代培養，每隔21-30天繼代培養一次。
預分化的條件可為在(25±2)℃下暗培養，暗培養時間為21-30天，優選的暗培養時間為28天。
不定芽的分化培養條件可為在(25±2)℃、光照時間10-12小時/天、光照強度1000-1500Lx的條件下進行培養，培養時間為30-50天，優選的培養時間為40天。
促進芽伸長的培養條件可為在(25±2)℃、光照時間10-12小時/天、光照強度1000-1500Lx的條件下進行培養，培養時間為20-28天，優選的培養時間為20天。
步驟5)生根培養方法中吲哚丁酸溶液的濃度優選為200mg/L，基部浸泡時間優選為2小時；生根培養條件為在(25±2)℃、光照時間10-12小時/天、光照強度1000-1500Lx下進行培養。
在上述步驟中所用到的培養基添加劑或添加物的濃度(或含量)為所述愈傷組織誘導培養基中2，4-二氯苯氧乙酸濃度為0.5-1.2mg/L，優選為1.0mg/L，蔗糖含量為2.5-3.5％，優選為3.0％，瓊脂的含量為0.5-0.8％，優選為0.68％；所述預分化培養基中6-苄基腺嘌呤的濃度為0.5-1.2mg/L，優選為1.0mg/L，α-萘乙酸的濃度為0.1-1.0mg/L，優選為0.1mg/L，蔗糖含量為2.5-3.5％，優選為3.0％，瓊脂的含量為0.5-1.0％，優選為0.7％；所述分化培養基中6-苄基腺嘌呤的濃度為0.5-1.2mg/L，優選為0.5或1.0mg/L，α-萘乙酸濃度為0.25-1.0mg/L，優選為0.25或0.5mg/L，瓊脂的含量為0.5-1.0％，優選為0.7％；所述芽伸長培養基中6-苄基腺嘌呤的濃度為0.5-1.2mg/L，優選為0.5或1.0mg/L，α-萘乙酸的濃度為0.25-1.0mg/L，優選為0.25或0.5mg/L，赤黴素的濃度為0.1-1.0mg/L，優選為0.2或0.5mg/L，瓊脂的含量為0.5-1.2％，優選為0.8％；所述生根培養基中α-萘乙酸的濃度為0.01-0.03mg/L，優選為0.02mg/L，水解乳蛋白的濃度為200-400mg/L，優選為300mg/L，吲哚丁酸的濃度為0.5-2.0mg/L，優選為1.0mg/L，蔗糖含量為2.0-3.0％，優選為2.5％，瓊脂的含量為0.5-1.0％，優選為0.7％。
上述百分含量均為質量百分含量。
本發明提供了一種翅果油樹試管苗的繁殖方法，該方法簡便快速、成本低廉，可在較短的時間內(160-180天)獲得大量的翅果油樹再生植株，具有商業生產的可行性。本發明為翅果油樹的快速繁殖和該植物的保護性研究提供了理論和實踐基礎，也為進一步開展翅果油樹的遺傳轉化、遺傳改良和分子生物學研究奠定了堅實的基礎。


圖1為處於結果期的翅果油樹圖2為翅果油樹萌發30天的無菌種子苗圖3A為愈傷組織在第二次分化培養基上培養30天後分化出的不定芽和伸長的小苗圖3B為愈傷組織在第二次分化培養基上培養60天後由分化出的不定芽長成的小苗圖4為不定芽在含0.68％瓊脂的分化培養基上發育成的玻璃化不健壯的小苗圖5為不定芽在含0.68％瓊脂的芽伸長培養基上發育成的玻璃化不健壯的小苗(右)和在含0.8％瓊脂的芽伸長培養基上發育成的健康植株的比對圖6為用吲哚丁酸溶液浸泡法進行生根培養獲得的翅果油樹試管苗完整植株具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。所述百分比濃度均為質量百分比濃度。
實施例1、翅果油樹試管苗的繁殖培養基愈傷組織誘導培養基添加1.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，3.0％蔗糖和0.68％瓊脂的MS基本培養基，pH值為5.8。
預分化培養基添加1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.1mg/Lα-萘乙酸，3.0％蔗糖和0.7％瓊脂的MS基本培養基，pH值為5.8。
分化培養基是添加0.5或1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.25或0.5mg/Lα-萘乙酸和0.7％瓊脂的MS基本培養基，pH值為5.8。
芽伸長培養基添加0.5或1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.25或0.5mg/Lα-萘乙酸，0.20或0.5mg/L赤黴素和0.8％瓊脂的MS基本培養基，pH值為5.8。
生根培養基添加0.02mg/Lα-萘乙酸，300mg/L水解乳蛋白，1.0mg/L吲哚丁酸，2.5％蔗糖和0.7％瓊脂的1/2MS基本培養基，pH值為5.8。
一、翅果油樹無菌種子苗的獲得取當年9月份成熟的翅果油樹果實(處於結果期的翅果油樹見圖1)，剝去最外面的綿質外果皮後，用0.5％高猛酸鉀或濃硫酸浸泡堅果6-12小時，然後用鉗子小心去掉堅硬的中果皮(注意不要傷及胚，胚受損的棄之)，最後用鑷子去掉內部的革質種皮，得到裸露的種仁。將種仁用常規的消毒方法(70％乙醇浸泡5-8min，再用0.1％HgCl2浸泡8-10min，最後用無菌水衝洗3-5遍)進行滅菌後，將其接種於1/2MS固體培養基(大量元素添加量為MS基本培養基的一半，微量元素和附加物不變，瓊脂0.68％，pH值5.8)上，30℃暗培養7天後，轉移到含7％瓊脂培養基上光照培養。在光照時間10-12小時/天，光照強度為1000-1500Lx的條件下培養，得到翅果油樹無菌種子苗(見圖2)。
二、愈傷組織的誘導及繼代培養當步驟一的無菌種子苗長至7cm左右時(約需20-40天)，將莖段和根段切割為0.4-0.5cm長的小段，子葉切成0.5×0.5cm2小塊作為外植體，接種於愈傷組織誘導培養基上，在(25±2)℃下暗培養，約30天後，將外植體切口處長出的白色愈傷組織切成0.4×0.4cm2小塊，移至新的愈傷組織誘導培養基上，在上述相同條件下進行繼代培養，每隔21-30天繼代培養一次，共繼代2次，得到大量愈傷組織。
三、愈傷組織的預分化將步驟二獲得的愈傷組織分割成0.4×0.4cm2的小塊，轉接到預分化培養基上，在(25±2)℃下暗培養約28天後，除有少量不定芽分化外，大多數愈傷組織只是增殖生長。
四、愈傷組織的分化及不同濃度6-BA和NAA對愈傷組織分化不定芽的影響將步驟三經預分化的愈傷組織再分割成0.4×0.4cm2的小塊，轉接到分別添加不同濃度(0、0.25、0.5、1.0mg/L)6-苄基腺嘌呤，不同濃度(0、0.25、0.5、1.0mg/L)α-萘乙酸和0.7％瓊脂的MS基本培養基上，pH值為5.8，在(25±2)℃，光照時間10-12小時/天，光照強度為1000-1500Lx的條件下培養，同時觀察並記錄不定芽的分化情況。培養30天後的觀察結果如表1所示，培養30-50天後，在其中五種培養基上，愈傷組織表面逐漸分化出許多球形、綠色的不定芽原基，再將含不定芽原基的愈傷組織轉移到各自相同的新鮮培養基上，在相同條件下培養約20-30天，結果在大部分培養基中，有不定芽的分化(圖3A)。已有的不定芽原基，繼續發育為不定芽，並進一步長成小苗(圖3B)。其中在添加有0.5或1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.25或0.5mg/Lα-萘乙酸的培養基中，不定芽的分化率較高，最高分化率達75％(18/24)，因此將添加0.5或1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.25或0.5mg/Lα-萘乙酸和0.7％瓊脂的MS基本培養基定為優選的分化培養基。
表1 6-BA和NAA對愈傷組織分化不定芽的影響(激素濃度單位mgL-1)

五、不定芽的伸長在分化培養基上分化伸長的小苗數目少，且易玻璃化(見圖4)。故將步驟四長出不定芽原基的愈傷組織小塊置於芽伸長培養基上，在(25±2)℃，光照時間10-12小時/天，光照強度為1000-1500Lx的條件下培養促進芽的伸長，20-25天後，不定芽伸長成3-4cm的小苗。不定芽在含0.68％瓊脂的芽伸長培養基上發育成的玻璃化不健壯的小苗和在含0.8％瓊脂的芽伸長培養基上發育成的健康植株的比對如圖5所示(圖中右為玻璃苗)，在芽伸長培養基(瓊脂濃度上升到0.8％玻璃苗減少，正常苗多)上長成的小苗數目多且正常。
六、無根苗的生根培養可用吲哚丁酸(IBA)溶液浸泡法或微型扦插法對步驟五獲得的無根苗進行生根培養，具體方法如下1、用吲哚丁酸溶液浸泡法進行生根培養及不同濃度吲哚丁酸、不同浸根時間對根生成的影響截取從根段和子葉愈傷組織表面分化發育而成的長約3-4cm的小苗，分別浸泡在濃度為100ppm(mg/L)、200ppm的IBA溶液中0.5h、1h、2h，然後垂直插入1/2MS基本培養基中，在(25±2)℃，光照時間10-12小時/天，光照強度為1000-1500Lx的條件下培養，40天左右，在苗的基部有白色的根長出，得到翅果油樹的試管苗(見圖6)。其中以200ppm濃度的IBA溶液處理2h的生根效果較好，生根率為50％-60％。在1/2 MS培養基中培養期間更換一次新鮮培養基培養。
2、用微型扦插法進行生根培養及不同濃度吲哚丁酸(IBA)對根生成的影響截取從根段和子葉愈傷組織表面分化並伸長為3-4cm的小苗，將小苗基部垂直扦插到生根培養基中，生根基本培養基為添加0.02mg/L α-萘乙酸，300mg/L水解乳蛋白，不同濃度(0.5、1.0、2.0mg/L)吲哚丁酸，2.5％蔗糖和0.7％瓊脂的1/2MS基本培養基，pH值為5.8，在(25±2)℃，光照時間10-12小時/天，光照強度為1000-1500Lx的條件下培養，同時觀察並統計生根率。培養45天後的生根率統計結果如表2所示，統計結果表明翅果油樹試管苗的生根，培養基中IBA濃度為1.0mgL-1較適宜，可使無根小苗的生根率高達60％，故將添加0.02mg/Lα-萘乙酸，300mg/L水解乳蛋白，1.0mg/L吲哚丁酸，2.5％蔗糖和0.7％瓊脂的1/2MS基本培養基定為優選的生根培養基。
表2 IBA水平對翅果油樹試管苗生根的影響

權利要求
1.一種翅果油樹試管苗的繁殖方法，包括以下步驟1)以無菌種子苗的莖段、根段或子葉切塊為外植體誘導愈傷組織；所述愈傷組織誘導培養基是在MS基本培養基的基礎上添加了2，4-二氯苯氧乙酸，蔗糖和瓊脂，pH值為5.0-6.5；2)將愈傷組織置於預分化培養基上進行預分化；所述預分化培養基是在MS基本培養基的基礎上添加了6-苄基腺嘌呤，α-萘乙酸，蔗糖和瓊脂，pH值為5.0-6.5；3)將步驟2)經預分化培養的愈傷組織置於分化培養基上進行不定芽的分化；所述分化培養基是在MS基本培養基的基礎上添加了6-苄基腺嘌呤，α-萘乙酸和瓊脂，pH值為5.0-6.5；4)將步驟3)長出不定芽原基的愈傷組織置於芽伸長培養基上促進芽長成無根小苗；所述芽伸長培養基是在MS基本培養基的基礎上添加了6-苄基腺嘌呤，α-萘乙酸，赤黴素和瓊脂，pH值為5.0-6.5；5)對步驟4)獲得的小苗用吲哚丁酸溶液浸泡法或微型扦插法進行生根培養，得到翅果油樹試管苗；所述吲哚丁酸溶液浸泡法為將小苗的基部置於100-300mg/L吲哚丁酸溶液中浸泡0.5-2小時後，將基部插入1/2MS基本培養基中進行培養；微型扦插法為將小苗置於生根培養基上誘導生根，所述生根培養基是在1/2MS基本培養基的基礎上添加了α-萘乙酸，水解乳蛋白，吲哚丁酸，蔗糖和瓊脂，pH值為5.0-6.5。
2.根據權利要求1所述的繁殖方法，其特徵在於所述步驟1)中無菌種子苗的獲得方法為將種仁經消毒後置於無蔗糖1/2MS瓊脂基本培養基上，培養7天後移到7％瓊脂培養基上繼續培養，培養條件為(25±2)℃、光照時間10-12小時/天、光照強度1000-1500Lx；所述培養基中瓊脂的含量為0.5-0.8％，pH值為5.0-6.5。
3.根據權利要求1或2所述的繁殖方法，其特徵在於所述步驟1)中愈傷組織的培養條件為在(25±2)℃下暗培養。
4.根據權利要求3所述的繁殖方法，其特徵在於所述暗培養時間為21-30天。
5.根據權利要求3所述的繁殖方法，其特徵在於所述繁殖方法中還包括將經步驟1)誘導獲得的愈傷組織再移至新的愈傷組織誘導培養基上，並在相同的愈傷組織培養條件下進行繼代培養，每隔21-30天繼代培養一次。
6.根據權利要求1或2所述的繁殖方法，其特徵在於所述步驟2)中預分化的條件為在(25±2)℃下暗培養，暗培養時間為21-30天；步驟3)中不定芽的分化培養條件為在(25±2)℃、光照時間10-12小時/天、光照強度1000-1500Lx的條件下進行培養，培養時間為30-50天；步驟4)中促進芽伸長的培養條件為在(25±2)℃、光照時間10-12小時/天、光照強度1000-1500Lx的條件下進行培養，培養時間為20-28天。
7.根據權利要求1或2所述的繁殖方法，其特徵在於所述步驟5)生根培養方法中吲哚丁酸溶液的濃度為200mg/L，基部浸泡時間為2小時；生根培養條件為在(25±2)℃、光照時間10-12小時/天、光照強度1000-1500Lx下進行培養。
8.根據權利要求1或2所述的繁殖方法，其特徵在於所述愈傷組織誘導培養基中2，4-二氯苯氧乙酸濃度為0.5-1.2mg/L，蔗糖含量為2.5-3.5％，瓊脂的含量為0.5-0.8％；所述預分化培養基中6-苄基腺嘌呤的濃度為0.5-1.2mg/L，α-萘乙酸的濃度為0.1-1.0mg/L，蔗糖含量為2.5-3.5％，瓊脂的含量為0.5-1.0％；所述分化培養基中6-苄基腺嘌呤的濃度為0.5-1.2mg/L，α-萘乙酸的濃度為0.25-1.0mg/L，瓊脂的含量為0.5-1.0％；所述芽伸長培養基中6-苄基腺嘌呤的濃度為0.5-1.2mg/L，α-萘乙酸的濃度為0.25-1.0mg/L，赤黴素的濃度為0.1-1.0mg/L，瓊脂的含量為0.5-1.2％；所述生根培養基中α-萘乙酸的濃度為0.01-0.03mg/L，水解乳蛋白的濃度為200-400mg/L，吲哚丁酸的濃度為0.5-2.0mg/L，蔗糖含量為2.0-3.0％，瓊脂的含量為0.5-1.0％。
9.根據權利要求8所述的繁殖方法，其特徵在於所述愈傷組織誘導培養基中2，4-二氯苯氧乙酸濃度為為1.0mg/L，蔗糖含量為3.0％，瓊脂的含量為0.68％；所述預分化培養基中6-苄基腺嘌呤的濃度為1.0mg/L，α-萘乙酸的濃度為0.1mg/L，蔗糖含量為3.0％，瓊脂的含量為0.7％；所述分化培養基中6-苄基腺嘌呤的濃度為0.5或1.0mg/L，α-萘乙酸的濃度為0.25或0.5mg/L，瓊脂的含量為0.7％；所述芽伸長培養基中6-苄基腺嘌呤的濃度為0.5或1.0mg/L，α-萘乙酸的濃度為0.25或0.5mg/L，赤黴素的濃度為0.2或0.5mg/L，瓊脂的含量為0.8％；所述生根培養基中α-萘乙酸的濃度為0.02mg/L，水解乳蛋白的濃度為300mg/L，吲哚丁酸的濃度為1.0mg/L，蔗糖含量為2.5％，瓊脂的含量為0.7％。
全文摘要
本發明公開了一種翅果油樹試管苗的繁殖方法。該方法包括以下步驟1)以無菌種子苗的莖段、根段、子葉切段為外植體誘導愈傷組織；2)將愈傷組織置於預分化培養基上進行預分化；3)將步驟2)經預分化培養的愈傷組織置於分化培養基上進行不定芽的分化；4)將步驟3)長出不定芽原基的愈傷組織置於芽伸長培養基上促進芽的生長；5)對步驟4)獲得的小苗用吲哚丁酸溶液浸泡法或微型扦插法進行生根培養。該方法簡便快速、成本低廉，可在較短的時間內獲得大量的翅果油樹再生植株，具有商業生產的可行性。本發明為翅果油樹的快速繁殖和該植物的保護性研究提供了理論和實踐基礎，也為進一步開展翅果油樹的遺傳轉化、遺傳改良和分子生物學研究奠定了堅實的基礎。
文檔編號A01H4/00GK1748483SQ20051011466
公開日2006年3月22日 申請日期2005年10月25日 優先權日2005年10月25日
發明者陳惠 , 閆桂琴, 畢潤成, 張連水 申請人:山西師範大學