家蠶基因工程植酸酶工業化感染控制方法
2023-12-10 01:47:01 1
專利名稱：家蠶基因工程植酸酶工業化感染控制方法
技術領域：
本發明屬於轉基因物質，尤其是畜禽用轉基因酶製劑製造領域。
中國專利CN99103564公開了一種應用重組BmNPV載體-家蠶宿主表達系統生產植酸酶的基因工程方法，用植酸酶基因替換家蠶核型多角體病毒基因組中的多角體蛋白基因，並使其處於多角體蛋白基因啟動子的控制下，再將此重組質粒與野生型BmNPV-DNA共轉染於家蠶細胞，通過體內同源重組得到帶有外源植酸酶基因的重組病毒，再利用多角體蛋白基因的啟動子啟動植酸酶基因，並將此重組家蠶核型多角體感染家蠶，在蠶體內繁殖產生目標物植酸酶蛋白。但如何將家蠶基因工程植酸酶生產在較大的工業化程度上實現，或者更具體地說在畜禽用轉基因酶製劑工業中高產量、低成本的生產出具有商業競爭力的產品仍是需要解決的問題。
本發明的目的是，研究一種家蠶基因工程植酸酶工業化感染控制方法，使之能改善現有技術的不足，使蠶體取得較高且穩定的目標植酸酶表達量。為低成本、批量化生產畜禽飼料用基因工程植酸酶商品化製劑創立有利條件。
本發明的目的使通過如下的方法實現的。
家蠶基因工程植酸酶工業化感染控制方法，應用重組BmNPV載體-家蠶宿主表達系統生產植酸酶，用植酸酶基因替換家蠶核型多角體病毒基因組中的多角體蛋白基因，並使其處於多角體蛋白基因啟動子的控制下，再將此重組質粒與野生型BmNPV-DNA共轉染於家蠶細胞，通過體內同源重組得到帶有外源植酸酶基因的重組病毒，再利用多角體蛋白基因的啟動子啟動植酸酶基因，並將此重組家蠶核型多角體感染家蠶，在蠶體內繁殖產生目標物植酸酶蛋白，以以下的手段實現病毒的工業化感染及生長控制，A)擴增的重組BmNPV滴度標定達106PFU；注射接種深度為皮下2mm；B)蛹體用乙醇浸泡，蠶幼蟲用70％乙醇棉球體表消毒；接種後蠶體噴灑氯黴素；C)接種後嚴格控制溫度在25±1℃；一般收蠶時間病蠶接種後4-5天；病蛹接種後5-6天。
採用本發明的方法，與常規方法相比，在較小的生產成本下可保證較大批量的蛹(蠶)獲得平均較高的酶活量，從而使基因工程植酸酶製劑能在較大的工業化程度上實現商品化。
權利要求
1.家蠶基因工程植酸酶工業化感染控制方法，應用重組BmNPV載體-家蠶宿主表達系統生產植酸酶，用植酸酶基因替換家蠶核型多角體病毒基因組中的多角體蛋白基因，並使其處於多角體蛋白基因啟動子的控制下，再將此重組質粒與野生型BmNPV-DNA共轉染於家蠶細胞，通過體內同源重組得到帶有外源植酸酶基因的重組病毒，再利用多角體蛋白基因的啟動子啟動植酸酶基因，並將此重組家蠶核型多角體感染家蠶，在蠶體內繁殖產生目標物植酸酶蛋白，其特徵在於，以以下的手段實現病毒的工業化感染及生長控制，A)擴增的重組BmNPV滴度標定達106PFU；注射接種深度為皮下2mm；B)蛹體用乙醇浸泡，蠶幼蟲用70％乙醇棉球體表消毒；接種後蠶體噴灑氯黴素；C)接種後嚴格控制溫度在25±1℃；一般收蠶時間病蠶接種後4-5天；病蛹接種後5-6天為宜。
2.根據權利要求1所述之家蠶基因工程植酸酶工業化感染控制方法，其特徵在於，所述擴增的重組BmNPV滴度預實驗表達量蛹≥300U/克，蠶幼蟲≥200U/克。
3.根據權利要求1所述之家蠶基因工程植酸酶工業化感染控制方法，其特徵在於，所述接種注射量蛹2-3μl，蠶幼蟲3-5μl。
4.根據權利要求1所述之家蠶基因工程植酸酶工業化感染控制方法，其特徵在於，蛹體用70％的乙醇浸泡30秒；蠶幼蟲用70％乙醇棉球體表消毒，氯黴素溶液濃度為600-800U/ml，每48小時噴灑一次。
全文摘要
本發明涉及一種家蠶基因工程植酸酶工業化感染控制方法,應用重組BMNPV載體－家蠶宿主表達系統,在蠶體內繁殖產生目標物植酸酶蛋白,以以下的手段實現病毒的工業化感染及生長控制:A)擴增的重組BmNPV滴度標定達10
文檔編號C12N15/866GK1384191SQ0110739
公開日2002年12月11日 申請日期2001年4月30日 優先權日2001年4月30日
發明者秦儉, 陳英, 楊忠生 申請人:四川華神集團股份有限公司