一種植物根部專一性表達的啟動子及其表達載體的製作方法
2023-12-10 04:12:01
專利名稱：一種植物根部專一性表達的啟動子及其表達載體的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物基因工程領域，具體的說，涉及一種新型芥子酶TGG5基因啟動子的獲得和植物表達載體的構建，尤其涉及誘導外源基因在根部特異性表達，獲得具有較高抗病蟲害和營養高效利用型的新品種。
背景技術：
植物根系是植物吸收水分、礦質 養分的器官，根系發育對植株生長發育至關重要。植物根系也是容易受到土傳病蟲害侵染的器官。通過特定基因的根部表達，有可能培育出抗旱、耐貧瘠、抗鹽鹼、抗土傳病蟲害的轉基因新品種。十字花科植物分布廣泛，這種優勢得益於其獨特的芥子酶防禦系統(硫代葡糖苷/芥子酶體系)，俗稱「芥子炸彈」。當植物受到機械損傷、昆蟲攻擊或受到真菌和病原體的感染時，酶和底物(芥子酶和硫代葡糖苷分別儲藏在不同的細胞中)相遇，硫代葡糖苷被降解為有毒化合物，參與對病蟲害的防禦，硫、氮的代謝以及生長調節等。目前在擬南芥中已發現的六個芥子酶基因TGG1、TGG2、TGG3、TGG4、TGG5、TGG6，其中已知芥子酶基因TGG1、TGG2、TGG3與新型芥子酶基因TGG4、TGG5、TGG6，它們在DNA序列、基因結構及編碼蛋白特性等方面有較大差異，TGG1、TGG2、TGG4、TGG5被證實是有功能的基因，TGG3、TGG6是不能編碼完整芥子酶的假基因。啟動子是位於結構基因5』端上遊的一段DNA序列，由不同的調節元件組成，這些調節元件以不同方式可操作性地結合結構基因，控制基因表達的起始時間和表達的程度。在植物體內，啟動子是天然基因和重組基因轉錄的調節物，管制基因的空間與時間性轉錄。隨著功能基因組學研究的發展，更多的功能基因被克隆，但是要獲得更好的轉基因植株，首先要考慮的問題即選擇適當的啟動子並使其在特異部位高效表達。目前植物基因工程中常用的是組成型表達啟動子，使外源基因在植物內各部位均表達。而與現有表達方式不同的特異表達則是將目的基因在有需要的部位進行表達，使目的基因的作用更經濟有效發揮；另外，研究植物組織特異性表達的調控方式對植物組織器官分化及基因調控具有重要意義；同時，作為食用植物，外源基因最好直接表達在食用部位以外的其他部位中，更加符合轉基因植物的安全性。目前已從植物中分離出在葉片、根、花粉絨氈層、胚胎、內皮層、糊粉層以及韌皮部等器官或組織中特異性表達的多種類型的啟動子。其中根特異性啟動子相對較少，主要有菸草RB7根啟動子(U. S. Pat. No. 5459252)，玉米 MR7 (U. S. Pat. No. 5837848)，馬鈴薯 PGT2 的啟動子(MEIKE K0STER-T0PFER, WOLFB FROMME, MARIO R0CHA-S0SA , et al . A Class II patatin promoter is underdevelopmental control in both transgenic potato and tobacco plants [J]. Mol GenGenet，1989，219 : 390 - 396.)等。植物的生長與發育依賴根系從土壤中吸收水分和無機鹽，根的發育對於植物起著至關重要的作用。根特異性啟動子可以驅動其下遊的目的基因特異表達在根部。通過轉基因手段，可以將已經分離的與K+吸收相關的轉運器特異地超表達於根部，將有效地提高施肥效率，提高養分的生物利用率。以根作為儲藏器官的經濟作物，如土豆，在根部特異的增強與澱粉和糖類代謝相關的基因的表達水平，從而提高其利用價值。根系作為植物體進行營養吸收、運輸、儲存與合成的重要器官，同時也是抵抗病蟲害和抗逆環境下賴以生存的重要組成部分。許多植物病原體和害蟲破壞植物的根，造成嚴重的作物損害和損失。只在受特定害蟲或者病原體影響的器官或組織中表達有毒的肽的轉基因植物提供了減少作物危害和損失的方法。例如，在轉基因玉米中的蘇雲金芽孢桿菌蛋白質的表達提供了對歐洲玉米螟蟲的抗性。組織特異性啟動子也可以用於將選擇的組織位點上殺蟲劑原轉化成活性形式。Hsu等報導了包含根特異性啟動子TobRB7和3 -葡糖苷酸酶基因的嵌合基因在優先將根中的殺蟲劑原轉化成活性形式方面的用途，將滅活的殺蟲劑原(羥甲基草醯胺醯的葡糖苷酸)施用到葉片上，然後通過植物韌皮部將其運輸到根部，在此由葡糖苷酸酶將其轉化成有活性的殺線蟲劑形式。因此，植物基因在根中特異性表達有效揭示了植物根系發生、分化和發育機制
發明內容
本發明的目的在於提供一種植物根部專一性表達的啟動子。為了實現上述目的，本發明的技術方案為提供一種植物根部專一性表達的啟動子，該啟動子為擬南芥第五個芥子酶基因TGG5的啟動子，大小為1447 bp，與另一個根部表達的芥子酶基因TGG4的啟動子的相似性為43. 3%，並且具有序列表中〈400>1項下的序列，該啟動子的序列如SEQ ID NO :1所示的核苷酸。通過擬南芥生態型Col-O中提取總DNA克隆獲得的芥子酶TGG5基因啟動子，經測序其長度為1447 bp。通過軟體分析，該啟動子具有高等植物啟動子應具有的調控元件。該啟動子可有效地將有益目的基因(包括抗病蟲害基因、抗逆性基因、促進次生物質代謝的基因、促進礦物質吸收的基因等)導入植物，在植物根中特異高效的表達，從而得到具有較高抗根部病蟲害和營養高效利用型的新品種。本發明的另一目的在於提供一種植物根部專一性表達載體，其中，轉入了前述的擬南芥根部專一性表達的啟動子。利用前述的擬南芥專一性表達的啟動子通過用Hind III和BamH I置換植物表達載體pBI 121上的CaMV35S啟動子，構建成在啟動子下遊含有⑶S基因的新的植物表達載體，命名為PBITG5。通過花序浸泡法轉化模式植物擬南芥，成功獲得轉基因植株。RT-PCR結果表明TGG5基因在根部特異性表達，⑶S組織化學染色鑑定進一步證實TGG5基因的啟動子為根部特異性表達的啟動子，PBITG5為一種根部專一性表達的載體。一、TGG5基因啟動子的克隆及表達載體的構建。採用大連寶生物總DNA提取試劑盒提取擬南芥生態型Col-O基因組DNA。根據資料庫中的TGG5基因的序列，設計兩個特異性的引物AP17 (5』 TGA GAA GCT TCC AGT TGGGTT TGG GTT AGT TTG 3』，5』 端有Bam HI 位點)和 AP18 (5，TGT TGG ATC CGG TTT GTATTT TCT TTA TTG ATG GGC T 3』，5』端有Hind III位點)。通過PCR擴增得到一條長約1500 bp的產物，雙酶切後置換植物表達載體PBI121上的CaMV 35S啟動子，得到新的植物表達載體，於上海生工測序，測序結果該啟動子長1447 bp，序列參照序列表〈400>1中。通過軟體分析，該啟動子具有高等植物啟動子應具有的調控元件，如TATA盒、CAAT盒等。新的植物表達載體命名為PBITG5。
二、轉基因植株的獲得及⑶S組織化學染色。I)轉基因植株的獲得通過電擊轉化法將上述表達載體轉入農桿菌C58，抗性篩選後進行PCR鑑定。鑑定為陽性的轉化子通過花序浸泡法轉化擬南芥，收取TO代種子進行抗性篩選，對轉基因植株進一步進行PCR鑑定。選擇PCR鑑定為陽性的植株繼續培養得到轉基因純系。2)⑶S組織化學檢測取Tl代種子抗性分離比為3 :1的小苗進行⑶S組織化學染色，觀察⑶S基因在轉基因擬南芥各個植物器官的表達情況，照相。本發明提供的根部特異性表達的啟動子及其植物表達載體，將該啟動子取代植物表達載體上的組成型CaMV35S啟動子，構建一個新的植物表達載體在根中表達。該啟動子
的獲得，為外源基因(對根部或根部生長發育有影響的基因)在根中特異性表達提供了基礎，外源基因可以是改變根組織功能的基因(包括可增強或修飾根的營養價值的基因)、編碼殺昆蟲或病原體毒素(靶向偏好攻擊根的昆蟲或病原體)的基因、抗除草劑或不良環境條件特性的基因等。同時利用基因工程技術還可獲得抗病蟲害、抗逆和營養高效利用型的新品種，因此對於根部特異性表達啟動子的研究具有潛在的商業價值和重要的應用價值。
圖I為TGG5啟動子驅動⑶S基因在根部特異表達的染色圖(表達的⑶S細胞經染色呈藍色)；A :在植株的子葉、下胚軸中檢測不到GUS基因的表達，在根部檢測到GUS基因的表達； B :在植株的真葉、葉柄和莖中檢測不到⑶S基因的表達，在根部檢測到⑶S基因的表達；C :在植株的花中檢測不到⑶S基因的表達；D :在植株的角果中都檢測不到⑶S基因的表達；E :在根尖檢測到⑶S基因的表達(放大)；F :在植株的根毛區檢測到⑶S基因的表達。
具體實施例方式本發明提供了一種擬南芥根部專一性表達啟動子及其植物表達載體。該啟動子是利用生物信息學的方法分析初步確認、通過PCR方法由擬南芥生態型Col-O總DNA中擴增獲得、並通過科學實驗驗證為根部特異表達(圖I)。I、擬南芥生態型和種植方法是將來自Nottingham Arabidopsis Stock Center,England的擬南芥生態型Col-O種子播種在標準營養土上，4°C放置3天後轉到培養室培養，溫度為白天22°C，晚上20°C，光照16小時/天，光照強度50001x。擬南芥種子消毒是在
I.5ml的Eppendorf管中加入少量種子，用Iml 75%乙醇浸泡數秒，吸出上清液；加入Iml無菌水，上下顛倒數次，靜置數秒，吸出上清液；再加入Iml 5%的次氯酸鈉溶液，顛倒混勻6 8min,用無菌水衝洗5次；消毒後的種子用Iml滅菌的0. 1%瓊脂糖混勻,用無菌滴管滴到培養基上；4°C冰箱內春化3天，放入到光照8h/d的人工氣候箱萌發，溫度為白天22°C，晚上20°C，20天後轉入14h/d光照培養箱，溫度同上；萌發後30天，選取健壯、生長一致的苗移栽到事先滅菌的培養土中，覆蓋保鮮膜，等苗生長正常後(一般需3 5 d)去保鮮膜培養(溫度為白天22°C，晚上20°C，14h/d光照)。2、TGG5基因啟動子的克隆及載體的構建是取擬南芥生態型Col-O植株的葉片，液氮研磨，採用大連寶生物公司總DNA提取試劑盒提取總DNA。以基因特異引物AP17 (5』 TGAGAA GCT TCC AGT TGG GTT TGG GTT AGT TTG 3』，5』 端有Bam HI 位點)和 AP18 (5，TGTTGG ATC CGG TTT GTA TTT TCT TTA TTG ATG GGC T 3』，5』 端有 Hind III 位點)擴增TGG5基因的啟動子片段。引物由上海閃晶生物公司合成，DNA聚合酶LA Taq來自採用大連寶生物公司。目的片段的PCR擴增在PCR管中依次加入
IOXPCRBuffer5 μ
dNTP4 μ I
DNA templateI μ I
API7I μ
AP18I μ
Taq E0.5 μ I
Sterilized distilled water 37.5 μ I
Total50 μ I輕輕混勻，瞬時離心，將Eppendorf管置PCR擴增儀中，蓋上加熱帽。反應程序94°C變性 2min ;94°C變性 40s，62°C退火 40s，72°C延伸 Imin 30 sec, 35 個循環；72°C延伸7min結束反應。取5 μ I PCR擴增反應液進行I. 0%瓊脂糖凝膠電泳，5V/cm恆電壓條件下電泳30min後，通過凝膠成像系統觀察並照相。採用大連寶生物小片段DNA純化試劑盒純
化產物。再將純化產物雙酶切。酶切反應體系如下 10 X K Buffer5 μ
Hind III1.5 μ I
BamH I1.5 μ
純化PCR產物30 μ I
Sterilized distilled water12 μ I
Total50 μ I30°C反應3h，採用大連寶生物小片段DNA純化試劑盒回收純化酶切產物，用40 μ I ddH20洗脫得到各酶切產物備用。將植物表達載體PBI121雙酶切，反應體系如下
10 X K Buffer5 μ
Hind III1.5 μ I
BamH I1.5 μ I
ρΒΠ21 質粒40 μ I
Sterilized distilled water2 μ I Total50 μ I對酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳、照相、檢查片段大小，切膠回收大片段、濃縮，進
行連接反應。反應體系如下IO X 連接酶 Buffer2 μ I
PCR片段5 μ
載體片段I μ I T4DNA連接酶 Ιμ Sterilized distilled water 11 μ I
Total20 μ I輕彈混勻瞬時離心後，16°C過夜反應，次日全部用作轉化大腸桿菌(E. coli)DH5 α，酶切鑑定後，由上海生工生物公司測序鑑定。每個片段至少測3個克隆，以排除PCR錯誤對序列的影響。測序結果為該啟動子長1447 bp，序列參照序列表〈400>1中。通過軟體分析，該啟動子具有高等植物啟動子應具有的調控元件，如TATA盒、CAAT盒等。測序正 確的載體命名為PBITG5。3、表達載體導入農桿菌C58是採用電擊轉化法，分別吸取I μ I重組質粒與100 μ I農桿菌感受態細胞於離心管中，充分混勻，置冰上IOmin ;將上述混和液轉移到經紫外照射滅菌的電極杯中，進行電擊脈衝放電(電壓1.8kv，電容25 μ f，阻抗400 Ω );電擊結束後，分別加入500μ I液體YEP培養基，輕輕混勻後，吸出混和液到IOml離心管中，28°C，200rpm，培養4 6h ;吸取200 μ I菌液，塗布到含有相應抗生素的固體YEP培養基上，28°C培養I 2 d。對單菌落進行菌液PCR鑑定篩選陽性轉化子。4、農桿菌介導法轉化擬南芥是通過花序浸泡的方法侵染擬南芥生態型Col-Ο，並引入組成型表達的35S啟動子作為一個參照。選取健壯、生長一致、抽苔的苗，頭天澆水澆透；農桿菌先搖30ml，再取25ml放入500ml YEP+Km (相應抗生素)中，搖菌24h以上(0D6。。值在I. 8 2. 0);4000rpm離心15min (室溫)集菌；用2倍體積(1L)轉化Buffer (1000ml1/2MS +10 μ I BA(lmg/mL) + Tween20 400 μ I +5%蔗糖，用 KOH調PH5. 8)溶解，混勻後用來轉化；取花序15 cm左右的擬南芥植株，剪掉果莢及已開的花，整個花序軸浸入到轉化溶液中IOmin或將整個花序軸浸入到轉化溶液後置於真空裝置中抽真空5min ;取出後讓植物平躺，覆蓋保鮮膜，置於黑暗中，隔天再立起；約一個半月後可以收種子(22°C /20°C，16h/8h光/暗);轉化植株收種後，根據轉化質粒抗性篩選轉基因植株，進一步種植篩選得到轉基因植株純系。5、轉基因植株的篩選是根據轉化質粒抗性篩選轉基因植株，抗性篩選(卡那黴素50 μ g/ml)得到的轉基因植株通過SDS法進行PCR鑑定初步確定轉化成功的植株。具體方法是，取新生葉片I片(約IOmg),置於I. 5ml Epppendorf管中，室溫下,用塑料小件將葉片迅速研磨成勻漿(20s 之內)；加入提取液(200mmol/L Tris-HCl pH8. O ；250mmol/L NaCl ；25mmol/L EDTA ；0. 5% SDS ;121°C，高壓蒸汽滅菌20min) 400 μ 1，劇烈搖動震蕩混勻；在微型離心機上，12000rpm,離心2min ;取上清液300 μ I,轉移到另一個I. 5mlEpppendorf管中，加入等體積異丙醇，輕輕混勻後，室溫下靜置2min ;室溫，12000rpm，離心5min，棄上清，開蓋放置15min左右，使異丙醇揮發，但是時間不易過長，否則沉澱的DNA難以回溶；加入50 μ I ddH20，溶解沉澱，得到DNA粗提液；離心樣品lmin，上清液用於PCR反應；取5 μ I樣品電泳，檢測DNA提取質量；取I μ I DNA為模板，其它成分按標準程序進行PCR反應；取5 μ I PCR產物電泳檢測。繼續種植收穫T1代擬南芥植株上的成熟種子，取100 200顆消毒後播種於含相應抗生素的培養基上，春化後光照培養，10 20天後分別計數抗性苗和非抗性苗的數目，計算抗性苗與非抗性苗的比率(分離比)，3 :1即符合孟德爾遺傳定律。轉基因植株的GUS檢測是對轉基因植株進行GUS染色分析。取T1代種子抗性分離比為3 :1的小苗直接加入適量新鮮配製的X-gluc溶液(50 mmol/L磷酸鈉緩衝液，pH7.0,1 mmol/L X-gluc,O. 1% Triton X-100,0. I mmol/L亞鐵氰化鉀,O. lmmol/L鐵氰化鉀，20%甲醇)中，37°C溫育Ih至過夜；然後脫色分別用30%、50%、70%和100%乙醇漂洗，每次5min，繼續用100%乙醇脫色至背景白色或無色為止；最後將脫好色的材料放在70%乙醇中保存或照相。
以上所揭露的僅為本發明的較佳實施例而已，當然不能以此來限定本發明之權利範圍，因此依本發明權利要求所作的等同變化，仍屬於本發明所涵蓋的範圍。
權利要求
1.一種植物根部專一性表達的啟動子，其特徵在於該啟動子為擬南芥第五個芥子酶基因TGG5的啟動子，大小為1447 bp，具有序列表中〈400>1項下的序列。
2.如權利要求I所述的植物根部專一性表達的啟動子，其特徵在於該啟動子的序列如SEQ ID NO : I所示的核苷酸。
3.一種植物根部專一性表達載體，其特徵在於用Hind III和BamH I對權利要求I所述的植物根部特異性表達的啟動子雙酶切後置換植物表達載體PBI121上的CaMV35S啟動子，構建成在啟動子下遊含有GUS報告基因的根部特異表達載體；利用花序浸泡法導入擬南芥，獲得轉基因植株。
全文摘要
本發明公開了一種植物根部專一性表達啟動子及其表達載體，該啟動子為擬南芥第五個芥子酶基因TGG5的啟動子，長1447bp，具有序列表中1項下的序列。將該啟動子取代植物表達載體pBI121上的組成型CaMV35S啟動子，構建成為一個新的植物表達載體，命名為pBITG5；利用花序浸泡法成功導入擬南芥，獲得轉基因植株，GUS組織化學染色顯示該啟動子僅在根部特異高效表達，在其它組織細胞中都不表達。該啟動子的獲得，為利用基因工程獲得抗病蟲害、抗逆和營養高效利用型的新品種創造了條件，為外源基因在根中特異性表達提供了基礎，具有潛在的商業價值和重要的理論實踐意義。
文檔編號C12N15/113GK102776186SQ20121017375
公開日2012年11月14日 申請日期2012年5月31日 優先權日2012年5月31日
發明者張家明, 汪萌, 譚德冠 申請人:中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所