轉基因小麥b73-6-1的檢測方法

2023-12-10 04:14:41

專利名稱：轉基因小麥b73-6-1的檢測方法
技術領域：
本發明涉及一 種轉基因小麥品系的鑑定方法。
背景技術：
轉基因小麥是利用基因工程技術，將外源基因導入小麥基因中，經過篩選得到的能夠表達目的基因的小麥。在基因轉移和表達研究中，需要對經轉化處理的幼苗進行分子檢測，以淘汰非轉化植株。選擇標記基因(如新黴素磷酸轉移酶基因、氯黴素乙醯轉移酶基因和潮黴素轉移酶基因等)和報告基因(如B2葡萄糖苷酸酶基因和螢光素酶基因等)已被廣泛用於轉化植株和組織的篩選，但在某些情況下，這種篩選效果不可靠。PCR是用於此目的檢測的常用技術之一，具有靈敏、快速的優點。對於此技術的應用在於尋找恰當的、特異性強的標記性基因片段，並以此為基礎設計相匹配的引物及擴增條件。

發明內容
本發明的目的在於提供能準確快速地鑑定轉基因小麥B73-6-1的方法，所述的轉基因小麥B73-6-1的檢測方法，是通過PCR的方法檢測序列為SEQ ID NO :12的基因組件， 該基因組件中包括序列為SEQ ID NO 15和SEQ ID NO 16的邊緣序列。上述本發明的方法所述及的PCR擴增的引物對是SEQ ID NOS 3/4和/或SEQ IDNOS 5/6 B73-FF1 (SEQ ID NO 3) :AGTATATCCGGGACGTTACAACACB73-FR1(SEQ ID NO 4) TATCAGTGTGCATGGCTGGATATGTAB73-RF1(SEQ ID NO 5) CACGGCGCGTTGAATCTCCTCTGTATB73-RR1(SEQ ID NO 6) :ATGCCTTTGTTTTCCCGCCCTCCCA。容易理解，採用上述方法進行PCR擴增，如果擴增結果為陽性，則待測的小麥為轉基因小麥B73-6-1 ；如果擴增結果為陰性，則待測的小麥不是轉基因小麥B73-6-1。更為優選的技術方案中，PCR反應條件是94°C，lmin，1 個循環；98"C 10s，55°C 30s，72°C 30s，35 個循環；72°C，7min，1 個循環。本發明的轉基因小麥B73-6-1的檢測方法的最優技術方案是採用50 μ LPCR反應體系，其中含有待測樣品DNA，其濃度優選5ng/μ L，10XLA PCR BufferII (Mg2+Plus) 5ul, dNTP 各 0. 4mM，鹼基序列為 SEQ ID NOS :3 6 的 PCR 引物各 0. 2 μ M，Taq DNA 聚合酶 0. 05U/ul。採用本發明的方法可以快速、靈敏地實現對轉基因小麥B73-6-1的品系鑑定，該方法特異性強，靈敏度高，快速準確。


本發明附圖3幅，圖1是實施例1以樣品C基因組DNA為模板擴增的1 %瓊脂糖凝膠電泳圖，其中 M 是 DL2，000 DNA Marker ； 1 6 分別是 ubiquitin、NOS、barl、bar2、uidA 和 GAG56D。圖2是實施例1以樣品A、B、C基因組DNA為模板擴增的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中Ml 是 λ -Hind III digest, M2 是 DL2, 000 DNA Marker, 1 6 分別是 C-ubiquitin F/ Nos R,C-ubiquitin F/bar Rl,C-ubiquitin F/uidA R,A-ubiquitin F/Nos R,A-ubiquitin F/bar Rl和 A-ubiquitin F/uidA R。
圖3是實施例1的1 %瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M :DL2, 000 DNA Marker。
具體實施例方式本申請的發明人經過大量研究，成功地克隆出包括轉基因小麥B73-6-1中特異性外源序列的基因組件B，該基因組件B中包括uidA，ubi，lacZ 1Dx5和小麥基因組部分序列。 該基因組件B的全序列如SEQ ID N0:12所示。在所獲得的上述基因組件B全序列的基礎上，發明人進一步獲得轉基因成分的邊緣序列，即SEQ ID N0:15和SEQID N0:16所示的序列，它們分別位於SEQ ID NO 12序列的第1 403位及11786 14690位。針對SEQ ID N0:12所示的基因組件的檢測可以通過PCR來實現，使用特異性的引物對SEQ ID NOS 3/4 和/或SEQ ID NOS :5/6在一定條件下擴增，如擴增出目標序列，即可判定所檢測樣品源自轉基因小麥B73-6-1。下述非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。實施例1.轉基因小麥特異性基因組件A、B、C全序列及相應邊緣序列的獲取1、轉基因樣品基因組DNA提取分別選取轉基因小麥B72-8-llb、轉基因小麥B73-6-1和轉基因小麥B102-1-2， 分別標記為樣品A、樣品B和樣品C。各個樣品粉碎後在液氮中研成細末，然後使用DNA Extraction Kit for GMO Detection Ver. 2. 0 (TaKaRa Code No. D9093)進行基因組DNA提取。以1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品質量，並使用超微量分光光度計(Nanodrop) 對檢測樣品基因組DNA質量和濃度，檢測結果顯示基因組DNA質量符合後續實驗要求，樣品 A、B 和 C 的平均基因組 DNA 濃度是 162. 69ng/ μ L、125. 80ng/ μ L、203. 75ng/ μ L，也符合後續實驗要求。2、轉基因小麥特異性基因組件A、B、C全序列獲取以及元件分析(1)根據從GenBank獲取的小麥內、外源基因相關信息設計引物如表1所示表1定性PCR檢測小麥內源基因、外源基因所需的引物序列
權利要求
1.轉基因小麥B73-6-1的檢測方法，是通過PCR的方法檢測序列為SEQID NO 12的基因組件，該基因組件中包括序列為SEQ ID NO 15和SEQ ID NO 16的邊緣序列。
2.權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的PCR擴增的引物對是SEQIDNOS 3/4和 / 或 SEQ ID NOS :5/6。
3.權利要求2所述的方法，其特徵在於所述的PCR反應條件是 94°C，Imin，1 個循環；980C 10s，55°C 30s, 72°C 30s，35 個循環； 72°C，7min，l 個循環。
4.權利要求3所述的方法，其特徵在於所述的PCR反應體系為50μ L體系，含有待測樣品 DNA 5ng/y L, 10XLA PCR BufferII (Mg2+Plus) 5ul，dNTP 各 0. 4mM，引物對各 0. 2 μ M， Taq DNA 聚合酶 0. 05U/ul。
全文摘要
一種轉基因小麥B73-6-1的檢測方法，是通過PCR的方法檢測序列為SEQ IDNO12的基因組件，該基因組件中包括序列為SEQ ID NO15和SEQ ID NO16的邊緣序列。採用本發明的方法可以快速、靈敏地實現對轉基因小麥B73-6-1的品系鑑定，該方法特異性強，靈敏度高，快速準確。
文檔編號C12Q1/68GK102344965SQ20111032147
公開日2012年2月8日 申請日期2011年10月20日 優先權日2011年10月20日
發明者徐君怡, 曹際娟 申請人:徐君怡, 曹際娟