轉基因玉米mir604及其衍生品種的lamp檢測引物組、檢測試劑盒及檢測方法
2023-12-10 04:19:01 4
專利名稱：轉基因玉米mir604及其衍生品種的lamp檢測引物組、檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學技術領域，涉及轉基因植物品種的檢測試劑盒及其檢測方法，具體涉及轉基因玉米MIR604及其衍生品種的LAMP檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
國際農業生物技術應用服務組織近期發表的《2010年全球生物技術/轉基因作物商業化發展態勢》報告顯示，由於轉基因作物帶來的巨大益處，過去15年內大約有I億人次的農民做出種植決定。自轉基因作物投入商業化種植15年來,全球轉基因作物種植面積累計已經超過10億公頃。2010年,全球29個國家的1540萬農民種植了共I. 48億公頃的轉基因作物。自1996年至2010年，全球轉基因作物的種植面積增加了 87倍。種植轉基因作物排名前十位的國家種植面積首次均超過了 100萬公頃。這些國家按照作物種植面積的大小排列分別是美國(6680萬公頃)、巴西(2540萬公頃)、阿根廷(2290萬公頃)、印度(940萬公頃)、加拿大(880萬公頃)、中國(350萬公頃)、巴拉圭(260萬公頃)、巴基斯坦(240萬公頃)、南非(220萬公頃)和烏拉圭(110萬公頃)。目前，世界各國已進行田間試驗的轉基因作物超過5000種，批准商品化的轉基因作物有160多種，包括玉米、大豆、油菜、番茄、馬鈴薯、甜椒、木瓜、甜菜、菸草、水稻等。轉基因玉米作為目前世界上最主要的轉基因作物之一，佔全世界轉基因作物種植面積的30%以上，僅次於轉基因大豆。從世界範圍看，轉基因玉米的推廣已經帶來了巨大的社會和經濟效益。然而轉基 因玉米在帶來巨大社會和經濟效益的同時也存在許多問題，主要集中在轉基因食品的安全性以及對生態環境的安全性方面，包括對人和動物健康的風險，對生態環境與農業的風險，對非目標生物的風險。針對第一種風險，1993年，聯合國經濟發展與合作組織(OECO)提出了食品安全性評估的「實質等同性」原則。如果準基因作物生產的產品與傳統產品具有實質等同性，則可以認為是安全的。最早提出對轉基因食品進行標識管理的是歐盟，1998年，歐盟在世界上簽署第一個法案，要求對轉基因產品進行標籤說明；1999年，要求出口到歐盟的非轉基因產品不得含有1%的轉基因產品汙染；2002年，歐盟將標識的最低限量降低到O. 9%。日本，澳大利亞，紐西蘭對轉基因成分的最低含量做了不同規定，域值從I 5%不等。我國於2001年5月9日公布並實施《農業轉基因生物安全管理條例》，於2002年I月5日公布了農業轉基因生物安全評價，標識和進口安全管理三個配套管理辦法，確定了第一批實施標識管理的農業轉基因生物目錄，並於2002年3月20日起正式實施。為了能夠對轉基因作物及其產品做出綜合評價，除了需要各國政府和國際機構制定科學的安全評價體系以及嚴格的管理法規外，建立有效的方法體系對轉基因作物進行檢測也很重要，這是對轉基因作物進行安全性評價和實施監管的基礎，也是農產品國際貿易健康發展的重要保障。轉基因產品的檢測要求方法要快速，準確，靈敏，並且還得考慮適應大樣品量，目標基因種類多等特點。因此，目前轉基因作物的檢測主要是檢測樣品是否含有外源蛋白質(基因表達產物)和是否含有外源基因(DNA)。轉基因作物中外源蛋白可以利用基於免疫原理的酶聯免疫吸附法(ELISA)試紙條檢測、Western雜交等方法檢測，主要從待測樣品中按照一定的程序抽提含有目的蛋白的基質，利用與目的蛋白(抗原)特異性結合的特性，通過偶聯抗體與抗原抗體複合物的作用產生可檢測的信號，但是這種方法要求高質量高穩定性的抗體，否則因準確性不夠，只能作為輔助檢測手段。轉基因作物的核酸檢測方法主要有兩種核酸分子雜交技術(Sourthernblot) ,PCR檢測技術。其中PCR檢測方法是最主要,最準確地檢測轉基因作物的方法，包括定性PCR方法，符合PCR方法，巢式PCR方法，競爭性定量PCR方法，螢光定量PCR方法等等。目前，國內外推廣使用的是定性PCR和實時定量PCR檢測方法PCR技術的基本原理類似於DNA的天然複製過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。通過聚合酶的作用，在體外快速特異地擴增目的片段，使微量、特定目的DNA片段在幾小時內迅速擴增到百萬倍，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色後很容易觀察，因而具有快速 靈敏等優點。然而，PCR方法反應體系和操作過程比較複雜，需要專業人員；所需PCR儀價格在5萬元左右，擴增時間2 3小時，擴增結果的電泳時間需要I小時左右；電泳常用染料EB為強致癌物質，有較強毒性，且難以實行現場檢測。所以，在科學研究和生產實踐中均需要一種快速簡便、操作準確、容易普及、安全可靠且適用於現場操作的轉基因作物檢測方法。環介導等溫基因擴增技術(Loop-MediatedIsothermal Amplification,以下簡稱LAMP法)是日本榮研化學株式會社於2000年前後開發出的基因擴增技術，其具有快速簡便、操作準確、容易普及、安全可靠的優點，目前尚未有將LAMP法應用於快速檢測轉基因玉米MIR604及其衍生品種的試劑盒。
發明內容
本發明的一個目的在於提供一種轉基因玉米MIR604及其衍生品種的LAMP檢測試引物組。本發明的另一個目的在於提供一種轉基因玉米MIR604及其衍生品種的LAMP檢測試劑盒。本發明的另一個目的在於提供一種基於上述檢測引物組與檢測試劑盒的轉基因玉米MIR604及其衍生品種的恆溫基因擴增檢測方法。本發明所採用的技術方案如下
轉基因玉米MIR604及其衍生品種的LAMP檢測引物組，包括外引物I、外引物2、內引物I和內引物2，其核苷酸序列分別如下所示
外引物 I :ACGACGATCGATCTCCAT (SEQ ID No 1)；
外引物 2 TCTCTTCTCGATAGGCAGATTA (SEQ ID No 2)；
內引物 I :AGGGCGCGTCGAAATGATTGGCCCTTCTCACCAATTC (SEQ ID No :3);
內引物 2 :GCCCTTATCTCCTTCCCGTGCTAGCCTGGTTAGCAACG (SEQ ID No :4)。轉基因玉米MIR604及其衍生品種的LAMP檢測試劑盒，包括以下成分
(!)引物液含有上述的引物組，濃度分別為4 6μ M外引物1、4 6μΜ外引物2，32 48μΜ內引物1、32 48 μ M內引物2 ；
(2)反應液含有IOmMdNTPUOXThermoPol反應緩衝液、150mM MgS04水溶液，三者的體積比是7 9 :4 6 :2 ;
(3)DNA聚合酶濃度為7 9υ/μ I ;
(4)對照陽性對照為轉基因玉米MIR604的DNA或含目的基因的大腸桿菌質粒DNA，陰性對照為不含目的基因的反應混合液。
優選的，所述引物液中含有5μΜ外引物1、5μΜ外引物2，40μΜ內引物1、40μΜ內引物2。優選的，所述DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶，濃度為8U/μ I。優選的，所述反應液中，IOmM dNTP : 10XThermoPol反應緩衝液150mM MgS04 =8 5 2體積比。本發明的轉基因玉米MIR604及其衍生品種的LAMP檢測試劑盒中還可以含有顯色齊U，所述顯色劑為螢光染料SYBRGreen I。利用以上所述的試劑盒檢測轉基因玉米MIR604及其衍生品種的方法，包括如下步驟
(1)待檢樣品DNA的提取採用CTAB法提取純化樣品DNA；
(2)恆溫基因擴增反應在200ulPCR管配製反應體系引物液I μ 1，反應液12. 5μ I,DNA聚合酶I μ 1，待檢DNA 2 5 μ 1，用滅菌去離子水補齊到25 μ I ;設置陽性對照反應時，用轉基因玉米MIR604的DNA或含目的基因的大腸桿菌質粒DNA替代待檢DNA，設置陰性對照反應時，用不含目的基因的反應混合液替代待檢DNA ;將配製好的PCR管混勻後離心，並於63 65°C反應60 90min，並在80°C持續2min ；
(3)結果判斷通過觀察反應管內沉澱的濁度變化來判斷擴增結果。在試劑盒中含有顯色劑的情況下，在(2)得到的產物中加入I 2μ I顯色劑，混勻，根據顯色結果來判斷擴增結果。其中，常規CTAB法提取轉基因玉米MIR604 DNA的方法為
(1)取轉基因玉米MIR604約IOOmg,放入研缽中，加入少量液氮迅速磨碎,液氮反覆加入3 4次，磨碎成粉末為止；
(2)加入I.5ml預熱至65°C的CTAB提取緩衝液，充分混合、懸浮試樣，65°C保育30min，期間不停顛倒混勻；
(3)約12000g離心lOmin。轉移上清至一新離心管,加入I倍體積的苯酹氯仿異戍醇(25:24:1)，充分混合，約12000g離心15min。轉移上清至一新離心管中；
(4)加入I倍體積的氯仿異戊醇(24:1)，充分混合，約12000g離心15min。轉移上清
至一新離心管中；
(5)加入2倍體積的CTAB沉澱緩衝液，室溫靜置保育60min；12000g離心15min，棄上清；加入350 μ I氯化鈉溶液溶解沉澱；12000g離心lOmin，轉移上清至一新離心管；
(6)加入O.6倍體積異丙醇，倒置離心管輕柔混合，室溫放置20min，12000g離心15min，棄上清，加入500 μ 170%乙醇溶液，並顛倒離心管數次，12000g離心lOmin，棄上清；
(7)乾燥DNA沉澱，加100μ ITE緩衝液溶解DNA。本發明基於環介導等溫擴增技術(LAMP法)，根據靶基因設計的四條引物能特異性識別靶基因序列上的六個獨立區域，啟動循環鏈置換反應，在靶標DNA區啟動互補鏈合成，結果在同一鏈上周而復始形成有很多環的花椰菜結構的莖一環DNA混合物。採用4條特異性引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在63 65°C對核酸進行擴增反應，反應需在恆溫條件下進行，反應時間依據模板DNA質量變化,一般為90min或更少,在60 90min的短時間內擴增效率可以達到IO9 101°個拷貝數。加入模板DNA，在63 65°C反應60 90min後,在80°C保藏2min,終止反應。這項技術的優點是不需要熱循環,且由於擴增是在恆溫條件下進行，因此不需要PCR儀等昂貴儀器。在反應中，在核酸大量合成時，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液中Mg離子結合，產生副產物焦磷酸鎂的白色沉澱。本發明具有快速高效、操作簡便、高特異性、高靈敏度、鑑定簡便、適合現場檢測等有益效果
(1)快速高效整個擴增只用60 90min即可完成，擴增產量可達IO9 101°個拷貝；
(2)操作簡便不需要複雜的儀器，不需要特殊試劑，不需要預先進行雙鏈DNA的變性等繁瑣步驟，只需要一部恆定溫度儀就能反應和檢測，條件比較溫和；
(3)高特異性本發明根據轉基因玉米MIR604的外源基因與內源基因結合處設計了四條特異性引物，應用上述四條引物，擴增靶序列的6個區域，具有很強的品系特異性，且非常穩定，形成引物二聚體概率低，保證了反應的順利進行；
(4)高靈敏度最低檢測極限可達到10個拷貝；
(5)鑑定簡便可通過觀察觀察加入SYBRGreen I顏色變化或者是否存在焦磷酸鎂沉澱來判斷擴增與否，無需電泳等其他任何分析步驟，適合現場檢測。
圖I是實施例I的檢測結果圖(1-4 :待檢樣品；5 :陽性對照；6 :陰性對照)；
圖2是實施例2的檢測結果圖(1、2 :待檢樣品；3 :陰性對照，4 :陽性對照)；
圖3是實施例3的檢測結果圖(1-6依次為5%、0· 5%、0· 1%、005%、0· 01%、O. 005%的樣品DNA，7 :陰性對照8 :陽性對照)；
圖4是實施例4的檢測結果圖(1-20依次為轉基因玉米MIR604、BT176、BTlUEVENT98140、59122、M0N810、M0N88017、M0N89034、M0N863、GA21，轉基因大豆 M0N89788，轉基因水稻BT63，轉基因土豆EH92-527-1，轉基因油菜T45，轉基因棉花GHB614，非轉基因玉米、水稻、小麥、油菜、棉花)。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明作進一步的說明，但並不局限於此。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。如無特殊說明，以下實施例中的「％」均指質量百分比。
實施例I含顯色劑的試劑盒及其檢測方法
轉基因玉米MIR604及其衍生品種的LAMP檢測試劑盒，包括引物液、反應液、DNA聚合酶、對照和顯色劑(1)引物液:含有5μΜ外引物1、5μΜ外引物2，40μ M內引物1、40μΜ內引物2，四條引物為
外引物 I :ACGACGATCGATCTCCAT (SEQ ID No :1)
外引物 2 TCTCTTCTCGATAGGCAGATTA (SEQ ID No :2)
內引物 I :AGGGCGCGTCGAAATGATTGGCCCTTCTCACCAATTC (SEQ ID No :3)
內引物 2 :GCCCTTATCTCCTTCCCGTGCTAGCCTGGTTAGCAACG (SEQ ID No :4)
(2)反應液含有IOmMdNTP、10XThermoPol反應緩衝液、150mM MgS04水溶液，三者的體積比是8:5:2;
(3)DNA聚合酶Bst DNA聚合酶，濃度為8U/μ I ;
(4)對照陽性對照為濃度為5%的轉基因玉米MIR604的DNA或含目的基因的大腸桿菌質粒DNA，陰性對照為不含目的基因的反應混合液；
(5)顯色劑螢光染料IX SYBR Green I。用上述試劑盒按以下方法對待測玉米品種進行檢測
(1)待檢樣品DNA的提取採用CTAB法提取純化待測樣品DNA；
(2)恆溫基因擴增反應在200ulPCR管配製反應體系引物液I μ 1，反應液12. 5μ I,DNA聚合酶I μ 1，待檢DNA 2 μ 1，用滅菌去離子水補齊到25 μ I ;設置陽性對照反應時，用濃度為5%的轉基因玉米MIR604的DNA或含目的基因的大腸桿菌質粒DNA替代待檢DNA，設置陰性對照反應時，用不含目的基因的反應混合液替代待檢DNA ;將配製好的PCR管混勻後離心，並於65°C反應60min，並在80°C持續2min ；
(3)結果判斷在上述反應管中加入2μI顯色劑，混勻，若顯現綠色則為陽性，橙色則為陰性。本實施例中，陰性對照顯現橙色，陽性對照顯現綠色，待檢樣品1、2的PCR管顯綠色(圖I中管1、2)，表明待檢玉米種子樣品1、2中含有或全部為轉基因玉米MIR604及其衍生品種，含有轉基因玉米MIR604成分，待檢樣品3、4的PCR管顯橙色(圖I中管3、4)，則表明待檢樣品3、4中不含轉基因玉米MIR604成分。參照EU Reference Laboratory for GM Food and Feed 中檢測 MIR604 品系的引物 MIR604 primer F: GCGCACGCAATTCAACAG (SEQ ID No 5), MIR604 primer R:GGTCATAACGTGACTCCCTTAATTCT (SEQ ID No :6)和探針 MIR604 Probe: FAM-AGGCGGGAAACGACAATCTGATCATG-TAMRA (SEQ ID No :7)進行螢光定量PCR檢驗，檢驗結果與上述LAMP方法
結果相一致。實施例2不含顯色劑的試劑盒及其檢測方法
試劑盒中除缺少實施例I中的顯色劑外，其餘同實施例I。用上述試劑盒按以下方法對待測玉米品種進行檢測
(1)待檢樣品DNA的提取採用CTAB法提取純化待測樣品DNA；
(2)恆溫基因擴增反應在200ulPCR管配製反應體系引物液I μ 1，反應液12. 5μ I,DNA聚合酶I μ 1，待檢DNA 2 μ 1，用滅菌去離子水補齊到25 μ I ;設置陽性對照反應時，用濃度為5%的轉基因玉米MIR604的DNA或含目的基因的大腸桿菌質粒DNA替代待檢DNA，設置陰性對照反應時，用不含目的基因的反應混合液替代待檢DNA ;將配製好的PCR管混勻後離心，並於65°C反應60min，並在80°C持續2min ；(3)結果判斷將反應管放置在濁度儀中按(2)中步驟反應，觀察反應管內沉澱的濁度變化來判斷擴增結果，如果出現沉澱則為陽性，無沉澱則為陰性。本實施例中，陰性對照無沉澱，陽性對照產生沉澱，待檢樣品I的PCR管出現沉澱(圖2管1)，表明待檢玉米種子樣品I中含有或全部為轉基因玉米MIR604及其衍生品種，含有轉基因玉米MIR604成分。待檢樣品2的PCR管沒有出現沉澱(圖2管2)，表明待檢樣品2中不含轉基因玉米MIR604成分。參照EU Reference Laboratory for GM Food and Feed 中檢測 MIR6O4 品系的引物 MIR604 primer F: GCGCACGCAATTCAACAG (SEQ ID No 5), MIR604 primer R:GGTCATAACGTGACTCCCTTAATTCT (SEQ ID No :6)和探針 MIR604 Probe: FAM-AGGCGGGAAACGACAATCTGATCATG-TAMRA (SEQ ID No :7)進行螢光定量PCR檢驗，檢驗結果與上述LAMP方法
結果相一致。實施例3 PCR反應與本發明檢測方法靈敏度的比較
按下列配方製備轉基因玉米MIR604及其衍生品種的LAMP檢測試劑盒 Cl)引物液:含有5μΜ外引物1、5μΜ外引物2，40 μ M內引物1、40μΜ內引物2，四條引物為
外引物 I :ACGACGATCGATCTCCAT (SEQ ID No :1)
外引物 2 TCTCTTCTCGATAGGCAGATTA (SEQ ID No :2)
內引物 I :AGGGCGCGTCGAAATGATTGGCCCTTCTCACCAATTC (SEQ ID No :3)
內引物 2 :GCCCTTATCTCCTTCCCGTGCTAGCCTGGTTAGCAACG (SEQ ID No :4)
(2)反應液含有IOmMdNTP、10XThermoPol反應緩衝液、150mM MgS04水溶液，三者的體積比是8:5:2;
(3)DNA聚合酶Bst DNA聚合酶，濃度為8U/μ I ;
(4)對照陽性對照為濃度為5%的轉基因玉米MIR604的DNA或含目的基因的大腸桿菌質粒DNA，陰性對照為不含目的基因的反應混合液；
(5)顯色劑螢光染料IX SYBR Green I。用上述試劑盒按以下方法對確定為轉基因玉米MIR604的待測玉米品種進行檢測
(1)待檢樣品DNA的提取採用CTAB法提取純化待測樣品DNA，分別稀釋成5%、0.5%、O. 1%、0· 05%、O. 01%、O. 005% 的樣品 DNA ；
(2)恆溫基因擴增反應在200ulPCR管配製反應體系引物液I μ 1，反應液12. 5μ I,DNA聚合酶I μ 1，待檢DNA 2 μ 1，用滅菌去離子水補齊到25 μ I ;設置陽性對照反應時，用濃度為5%的轉基因玉米MIR604的DNA或含目的基因的大腸桿菌質粒DNA替代待檢DNA，設置陰性對照反應時，用不含目的基因的反應混合液替代待檢DNA ;將配製好的PCR管混勻後離心，並於65°C反應60min，並在80°C持續2min ；
(3)結果判斷將反應管放置在濁度儀中按(2)中步驟反應，觀察反應管內沉澱的濁度變化來判斷擴增結果，如果出現沉澱則有擴增，無沉澱則無擴增。也可以在(2)中得到產物中加入I μ I顯色劑，混勻，肉眼觀察。無擴增反應的管子呈現黃色，有擴增反映的管子變成綠色。本實施例中，陽性對照、5%、0· 5%、0· 1%、0· 05%,0. 01%、0· 005%均出現沉澱顯示為有擴增，陰性對照無沉澱顯示為無擴增；加入顯色劑後，陽性對照、5%、0. 5%、0. 1%、0. 05%、O. 01%,O. 005%的PCR管顯綠色，陰性對照管子呈現黃色(見圖3)。
PCR反應引物採用上述LAMP反應中的外引物I和外引物2。PCR反應為25 μ I體系，10XPCR Buffer (PCR 反應緩衝液，Promega 公司)2· 5 μ 1，IOmM dNTPs (Promega 公司)O. 5μ 1，上、下遊引物分別對應外引物I和外引物2，各O. 5μ l，Taq酶(5υ/μ I ,Promega公司)0. 5 μ 1，DNA模板I μ 1，用滅菌去離子水補至25 μ I。反應程序為95°C預變性5min，95°C變性30s，58 °C退火30s，72 °C延伸30s，72 °C延伸7min。PCR產物取10 μ I與2%瓊脂糖凝膠電泳，100V電壓下40min，通過凝膠成像分析儀觀察結果，對應條帶分別為M，DL600 DNAMarker (DNA分子量標準，最大DNA片段為600鹼基對)；1，陽性對照；2，5% ； 3,0. 5% ；4，O. 1% ； 5,0. 05% ； 6,0.01%； 7,0. 005% ； 8，陰性對照。其中 PCR 方法的靈敏度為O. 05%,而6，7顯示為陰性結果。由兩種方法比較可以看出，本發明的試劑盒的靈敏度的結果可以達到O. 005%的濃度，而PCR方法的靈敏度為O. 05%，而O. 01%或以下顯示為陰性結果；經比對，本發明的試劑盒及方法靈敏度明顯高於PCR方法的敏感度，能檢測出更低含量的樣品。實施例4特異性實驗
用實施例I的鑑定方法分別對分離純化的轉基因玉米MIR604、BT176、BTlUEVENT98140、59122、M0N810、M0N88017、M0N89034、M0N863、GA21，轉基因大豆 M0N89788，轉基因水稻BT63，轉基因土豆EH92-527-1，轉基因油菜T45，轉基因棉花GHB614，非轉基因玉米、水稻、小麥、油菜、棉花進行鑑定，同時參照EU Reference Laboratory for GM Food andFeed 中檢測 MIR604 品系的引物 MIR604 primer F: GCGCACGCAATTCAACAG(SEQ ID No 5),MIR604 primer R: GGTCATAACGTGACTCCCTTAATTCT (SEQ ID No :6)和探針 MIR604 Probe:FAM-AGGCGGGAAACGACAATCTGATCATG-TAMRA (SEQ ID No :7)進行螢光定量 PCR 檢驗。鑑定結果顯示轉基因玉米BT176、BTlU EVENT98140、59122、M0N810、M0N88017、M0N89034、M0N863、GA21，轉基因大豆 M0N89788，轉基因水稻 BT63，轉基因土豆 EH92-527-1，轉基因油菜T45，轉基因棉花GHB614，非轉基因玉米、水稻、小麥、油菜、棉花反應管均為橙色，即無擴增；轉基因玉米MIR604的反應管為綠色，即有擴增(見圖4)。本結果與EUReference Laboratory for GM Food and Feed中的突光定量PCR結果相一致，顯不出良好的特異性。
權利要求
1.轉基因玉米MIR604及其衍生品種的LAMP檢測引物組，包括外引物I、外引物2、內引物I和內引物2，其核苷酸序列分別如下所示外引物 I :ACGACGATCGATCTCCAT (SEQ ID No 1)；外引物 2 TCTCTTCTCGATAGGCAGATTA (SEQ ID No 2)；內引物 I :AGGGCGCGTCGAAATGATTGGCCCTTCTCACCAATTC (SEQ ID No :3);內引物 2 :GCCCTTATCTCCTTCCCGTGCTAGCCTGGTTAGCAACG (SEQ ID No :4)。
2.轉基因玉米MIR604及其衍生品種的LAMP檢測試劑盒，包括以下成分 Cl)引物液含有權利要求I所述的引物組，濃度分別為4 6μΜ外引物1、4 6μΜ外引物2,32 48μΜ內引物1、32 48μΜ內引物2 ； (2)反應液含有IOmMdNTP、10XThermoPol反應緩衝液、150mM MgS04水溶液，三者的體積比是7 9 :4 6 :2 ; (3)DNA聚合酶濃度為7 9υ/μ I ; (4)對照陽性對照為轉基因玉米MIR604的DNA或含目的基因的大腸桿菌質粒DNA，陰性對照為不含目的基因的反應混合液。
3.根據權利要求2所述的轉基因玉米MIR604及其衍生品種的LAMP檢測試劑盒，其特徵在於所述引物液中含有5μΜ外引物1、5μΜ外引物2，40μΜ內引物1、40μΜ內引物2。
4.根據權利要求2所述的轉基因玉米MIR604及其衍生品種的LAMP檢測試劑盒，其特徵在於所述DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶，濃度為8U/ μ I。
5.根據權利要求2所述的轉基因玉米MIR604及其衍生品種的LAMP檢測試劑盒，其特徵在於所述反應液中，IOmM dNTP : 10XThermoPol反應緩衝液150mM MgS04 = 8 :5 :2體積比。
6.利用權利要求2 5任一項所述的試劑盒檢測轉基因玉米MIR604及其衍生品種的方法，包括如下步驟 (1)待檢樣品DNA的提取採用CTAB法提取純化樣品DNA； (2)恆溫基因擴增反應在200ulPCR管配製反應體系引物液I μ 1，反應液12. 5μ I,DNA聚合酶I μ 1，待檢DNA 2 5 μ 1，用滅菌去離子水補齊到25 μ I ;設置陽性對照反應時，用轉基因玉米MIR604的DNA或含目的基因的大腸桿菌質粒DNA替代待檢DNA，設置陰性對照反應時，用不含目的基因的反應混合液替代待檢DNA ;將配製好的PCR管混勻後離心，並於63 65°C反應60 90min，並在80°C持續2min ； (3)結果判斷通過觀察反應管內沉澱的濁度變化來判斷擴增結果。
7.根據權利要求2 5任一項所述的LAMP檢測試劑盒，其特徵在於還含有顯色劑，所述顯色劑為螢光染料SYBRGreen I。
8.利用權利要求7所述的試劑盒檢測轉基因玉米MIR604及其衍生品種的方法，其特徵在於，包括如下步驟 (1)待檢樣品DNA的提取採用CTAB法提取純化樣品DNA； (2)恆溫基因擴增反應在200ulPCR管配製反應體系引物液I μ 1，反應液12. 5μ I,DNA聚合酶I μ 1，待檢DNA 2 5 μ 1，用滅菌去離子水補齊到25 μ I ;設置陽性對照反應時，用轉基因玉米MIR604的DNA或含目的基因的大腸桿菌質粒DNA替代待檢DNA，設置陰性對照反應時，用不含目的基因的反應混合液替代待檢DNA ;將配製好的PCR管混勻後離心，並於63 65°C反應60 90min，並在80°C持續2min ；(3)結果判斷在上述反應管中加入I 2μ I顯色劑，混勻，根據顯色結果來判斷擴增結果。
全文摘要
本發明公開了一種轉基因玉米MIR604及其衍生品種的LAMP檢測引物組、檢測試劑盒及檢測方法。檢測引物組包括四條特異性引物；檢測試劑盒包括引物液、反應液、DNA聚合酶和對照；試劑盒還可以有顯色劑。其檢測方法是通過提取待檢玉米品種的DNA、採用四條特異性引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在63～65℃對樣品DNA模板進行擴增，短時間擴增效率可達到109～1010個拷貝，其鑑定採用加入SYBRGreenI觀察顏色變化或者利用濁度儀觀察反應管內沉澱的濁度變化判斷擴增與否，確定待檢玉米品種是否含有或為轉基因玉米MIR604及其衍生品種。本發明具有快速高效、操作簡便、高特異性、高靈敏度、鑑定簡便、適合現場檢測等優點，適於推廣應用。
文檔編號C12Q1/68GK102634588SQ20121012876
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月28日 優先權日2012年1月16日
發明者凌莉, 劉津, 莊陽陽, 李志勇, 石磊, 肖豔文 申請人:廣州迪澳生物科技有限公司